在体外精油抗菌活性链球菌Pyogenes

摘要

链球菌Pyogenes在扁桃体炎的发病机制中起重要作用。本研究旨在评价在体外18种芳香药用植物精油化学类型对植物的抑菌活性链球菌．采用圆盘扩散法研究精油的抑菌活性。采用肉汤稀释法测定具有重要抑菌活性的精油的最低抑菌浓度。在测试的18种精油中，14种精油显示出抑菌活性链球菌．他们之中肉桂，香橼，胸腺CT百里酚，牛至， 和Satureja蒙大拿精油具有显著的抑菌活性。的在体外本研究结果提示，对于咽喉细菌性感染的患者，如果使用芳香疗法，这些精油作为潜在的抗菌药物，应该是首选。

1.介绍

十年来，抗生素的优化使用涉及到国家卫生机构，他们试图通过许多广告活动和著名的口号，让人们了解和敏感。例如，大多数扁桃体炎是病毒性的，不需要抗生素治疗。例如，约37%的儿童扁桃体炎的病因是细菌，与链球菌Pyogenes是最常见的细菌病原[1］．在这种特殊情况下，扁桃体发炎必须用抗生素治疗。青霉素是抗生素治疗的首选链球菌扁桃体炎。没有链球菌有对青霉素耐药的报道。不幸的是，青霉素治疗无法根除链球菌扁桃体炎/咽炎2- - - - - -4］．

在替代治疗砷中，精油（EOS）可能是对该病原体的有趣选择;至少证明了EOS防腐性质，至少在体外(自2002年以来，PubMed收录了2000多篇关于EOs抗菌活性的论文)。尽管EOs上有所有可用的信息，我们还是想评估它们在替代或补充治疗中的地位链球菌扁桃体炎。

我们进行了在体外实验评价抗菌活性的EOs描述为活性的链球菌．进行盘扩散方法以测试18 eos的抗菌活性;测定5个最有效EOS的MIC（最小抑制浓度）和MBC（最小杀菌浓度）。与Amoxicillin进行了类似的实验，该病理学中的基准处理。

2.材料和方法

2.1。精油

十八件精油（Cinnamomum verum.，Cymbopogon citratus，牛至属植物紧统，胸腺vulgaris.CT百里香，Satureja蒙大拿，尤金尼亚caryophyllus，Cymbopogon martinii var．Motia.，樟树CT芳樟醇,、，胸腺vulgaris.CT thujanol,牛至属植物marjorana，薰衣草花stoechas，白千层属灌木cajuputi，白千层属灌木alternifolia，罗勒，Melaleuca QuinquenerviaCT桉树脑,樟树CT桉树脑和迷迭香属officinalisCT Cineole）由法国Pranarôm科学提供。这些EO的主要组成部分列于表中1．

2．2.菌株和培养条件

链球菌Pyogenes本研究使用CIP 104226菌株(法国巴斯德研究所收集)。该菌株是临床分离自儿童咽炎发作后咽部。

2．3.磁盘扩散分析

如已经描述的圆盘扩散方法研究了抗微生物活性[5］．将细菌悬液调整至细菌细胞密度为1.0 × 10⁸UFC/mL(或0.5麦克法兰浊度单位)。用无菌拭子浸泡在这种细菌悬浮液中，接种绵羊血琼脂(Biomerieux)的整个表面。6每个EO的L施用于无菌地放置在接种板上的无菌纸盘（BioMerieux）上。然后，将平板在室温下温育15分钟。只有一张光盘是每平笔测试的。在CO中的37°C孵育24小时后₂抑菌区以毫米计。阿莫西林(25g/disc, Bio-Rad)作为细菌抑制的阳性对照。所有实验都是重复三次。计算缓蚀直径的平均值，将EOs分类如下:链球菌对于直径小于8mm的不敏感(0)，对于直径8 - 14mm的中等敏感(+)，对于直径14 - 20mm的敏感(++)，对于直径大于20mm的非常敏感(++)[5，6］．

2．4．最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定

检查具有较大抑制直径（> 20mm）的精油，用于抗微生物活性链球菌。采用Courvallin等人所描述的标准化方法，通过肉汤稀释法在脑心肉汤(BH, Biomerieux)中估计最低抑制浓度(MIC) [7］．简而言之，将每个EO在DMSO（DiMéthylsulfoxyde）中稀释：40％（v / v）Cinnamomum verum.对于其他EOS测试的80％（v / v）。根据EO测试的，在蒸馏水中进行系列稀释液，其浓度范围为0.025％至1％（v / v）。一毫升a链球菌培养液(10⁶在2.9 mL脑心汤中加入各EO稀释剂0.1 mL。制备不含EO的对照品。37℃搅拌孵育24小时后，密闭试管上测定MIC为抑制可见细菌生长的EO的最低浓度。

测定最低杀菌浓度(MBC)为10无菌从无明显浑浊的试管中取细菌接种物L，并将其涂于羊血琼脂上[7］．MBC被认为是较低浓度的EOs，使EO处理后的原始接种物在羊血琼脂表面的生长小于0.1%。每个MIC和MBC值都是从三个独立的实验中获得的。用MBC/MIC比测定EOs的抑菌效果;当比例小于4时，被认为是杀菌EO，当比例大于4时被认为是抑菌EO [8］．

3.结果

3.1。精油组成

如表所示1，精油的选择根据其化学成分，特别是主要成分。的主要成分Cinnamomum verum.和Cymbopogon citratus醛。牛至属植物紧统，胸腺vulgaris.CT百里香，Satureja蒙大拿，尤金尼亚caryophyllus， 和罗勒属basilicum主要含有酚类衍生物。分析马提尼水仙花，樟树CT芳樟醇,、，胸腺vulgaris.CT thujanol,牛至属植物马约拉那， 和白千层属灌木alternifolia萜烯醇。主要化合物为酮类化合物薰衣草花stoechas．至少，从它们的化学类型来看，白千层属灌木cajuputi，Melaleuca QuinquenerviaCT桉树脑,樟树CT桉树脑和迷迭香属officinalisCT桉树脑主要含有桉树脑，一种单萜醚。

３．２．抗菌活性筛选

用圆盘扩散法测定被试物生长抑制带的结果链球菌应变如图所示1．我们的结果表明EOs来自肉桂，香橼，胸腺CT麝香草酚,牛至属植物紧统， 和Satureja蒙大拿是最活泼的油脂链球菌，缓蚀带平均范围为48.0 mm ~ 35.0 mm(+++)。链球菌是敏感的(++)尤金尼亚caryophyllus和马提尼水仙花(表示对应的抑制直径。， 18.3和15.3毫米)。大部分EOs均表现出中等的抑制活性(+)链球菌(指抑制直径由13.0至9.0毫米不等):樟树CT芳樟醇，薄荷，胸腺CT thujanol，牛Origanum majorana, Lavandula stoechas，白千层，互叶白千层。四种EOs对被试菌株无显著活性(0)(抑菌带直径6.3 - 0.0 mm):罗勒， 和Melaleuca QuinquenerviaCT桉树脑,樟树CT桉树脑和迷迭香属officinalisCT桉树脑．几乎所有精油的抑菌圈均显著低于阳性对照阿莫西林(47.3±2.5 mm)。

3．3．MIC和MBC值的测定

以5种精油(肉桂，香橼，胸腺CT麝香草酚,牛至属植物紧统， 和Satureja蒙大拿），用肉汤稀释测定测定麦克风值（图2）。Cinnamomum verum.EO主要由芳香醛组成是最有效的链球菌(0.19% (v / v))。麦克风的Cymbopogon citratus以萜醛为主的含量为0.93% (v/v)。富芳香酚的EOs的mic范围为0.57 ~ 0.90% (v/v)。

关于MBC，在大多数情况下，它靠近麦克风，表明对良好的杀菌活性链球菌（桌子2），MBC与麦克风的比率范围为1.02至1.53。

4.讨论

即使芳香植物和药用植物从古代就被用作天然疗法，并被认为是合成药物的替代品，也需要进行科学研究来评估精油的抗菌活性。

这项工作的目的是聚焦于可用的EOs链球菌并比较它们的抗菌活性链球菌这是一种导致人类扁桃体炎的细菌。18个EOs已被选择组成。事实上，在文献中有报道称，以芳香酚或醛类为主的EOs对呼吸道病原体具有主要的抗菌活性，其次是萜醇类EOs。含萜醚、酮或氧化物的EOs活性较弱[9，10］．然后，例如，百里香，肉桂，柠檬草，茶树，薰衣草，牛至，丁香，棕榈，或cajeput EOs被认为是有效的链球菌［9- - - - - -12而牛至、罗勒、薄荷、迷迭香和薰衣草精油则可以抑制另一种革兰氏阳性细菌，金黄色葡萄球菌［13］．

本研究采用标准纸片法筛选出5种具有较强抑制活性的挥发油链球菌18种精油中。所得结果与文献一致，以醛类或酚类为主成分的EOs抗氧化效果最好链球菌。

结果表明，肉桂具有较强的抗肿瘤活性链球菌与其他测试的EOs相比。这些结果与之前的工作一致[10，11］．因此,Cinnamomum verum.含肉桂醛（芳香醛）的EO显示出最高的活动。此外，含有芳香族酚，碳酸和胸腺酚的EOS非常有效（+++）链球菌应变测试。其他含有酚类衍生物的油(含丁香酚的丁香和含雌二醇的罗勒)活性较低(++)。如图所示3.，这些结果可以直接与EOs中主要芳香酚类衍生物的结构联系起来。特别是，游离酚的存在似乎增加了对链球菌．罗勒精油主要含雌二醇，不含游离酚。令人惊讶的是，在抗菌活性较强的精油中，丁香没有被选中。事实上，以前的研究已经表明，丁香精油的抑菌活性链球菌几乎和百里香EO一样[11］．我们的研究结果与以往的研究存在差异，可能是因为EOs的成分没有严格定义，而是由质量和数量不同的有机物组成的复杂混合物[14］．

通过抑菌活性测定，研究了5种精油的抑菌活性。在本研究中，mic的结果是可靠的，以直径的抑制区观察圆盘扩散法，与Cinnamomum verum.是更有效的EO，其次是其他四个被测试的EOs。所有测试的EOs均显示出杀菌活性在体外(MBCs几乎等于MICs)，但需要进行药代动力学和药效学研究来表征抗菌活性在活的有机体内及其临床疗效[15］．

在比较EOs和抗生素的抗菌活性和细胞毒性时，必须谨慎对待。确实，由于EOs的化学成分复杂多变，受化学类型或培养条件等多种因素的影响，了解EOs的抗菌活性机制和控制其细胞毒性仍有困难。正如后面讨论的，精油的抗菌和细胞毒活性至少有一部分是非特异性的，但与针对膜的亲脂化合物有关。

筛选具有抗菌作用的EOs, Fabio等人报道，在Vero细胞上显示抗菌活性的EOs的mic高于无毒浓度[11］．必须对EOs的细胞毒性进行研究，特别是过量使用的可能性以及与药物的相互作用。此外，必须强调的是缺乏临床研究(毒性、药代动力学等)。

含酚或醛的EOs治疗剂量通常为每天几滴(每天3次，每次2滴)每个操作系统．应避免吸入这种刺激的EOS。应该注意到关于eos等混合物的药代动力学预测是困难的[14］．然而，由于精油是亲脂性和挥发性化合物，它们可以迅速到达系统腔体，并部分通过呼吸途径被清除，即在扁桃体炎的感染部位[16］．

抗菌治疗链球菌扁桃体炎有几个目的;其中包括减少传播给家庭成员。事实上，与这种细菌引起的散发性侵入性感染的年发病率相比，感染指数患者的家庭接触者的侵入性感染(例如菌血症和肺炎)的风险似乎有所增加[17］．然而，大约20-30%使用青霉素的抗生素治疗未能根除病原体[3.，4］．这种治疗失败不是由于对青霉素的耐药性表型[18]但可以与各种假设有关，如共谋咽喉菌群之间的微生物相互作用链球菌，青霉素在扁桃体的渗透和扩散较差，或重新获得链球菌来自联系人[2］．在此背景下，可以研究EOs与抗生素的协同作用。在非特异性的作用模式下，EOs可以帮助控制产生β -内酰胺酶的细菌，导致青霉素治疗无法根除链球菌(查阅详情请参阅[19])。

Fadli等人的研究对这种有前景的组合策略进行了说明。在80种EOs/抗生素组合中，71%显示协同作用。例如，人们注意到，卡瓦罗与环丙沙星联用时显示出协同效应[20.］．此外，这种替代策略可能很有趣，因为在理想情况下，它可以减少抗生素的剂量，从而减少治疗的不良影响。然而，协同效应必须进行评估在体外和在活的有机体内因为效果是可变的，取决于许多因素，如EO的成分，暴露时间，或EO的活性成分的作用模式。对EOs作用机制的研究尚未完全建立。研究樟属革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌或者芽孢杆菌）以及代谢活动和细菌复制能力的降低[21，22］．Carvacrol暴露引起形态学改变，如细胞表面结构的改变[23，24］．然而，由于EOs的成分是亲脂的，各种生物的膜可能是靶向的，但蛋白质目标似乎不是特异性的;特别是酚醇或醛会干扰与膜结合或相关的酶蛋白，使其停止活性。EOs的成分也可以干扰细菌或哺乳动物线粒体的电子传递链，并改变能量生产[25］．

结论

综上所述，我们发现了一些精油的抑菌活性链球菌,特别是Cinnamomum verum.EO但我们需要进一步调查在临床菌株上的实际应用中评估杀菌性质，并评估治疗施用的可能性。FRONTING认为没有证据表明这些EOS的潜在临床应用，需要进一步研究，以确定它们是否可以有效地替代抗生素或者，也许是组合使用。额外的在活的有机体内研究和临床试验将有助于证明和评估这些油在扁桃体炎背景下的潜力。

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