KWLL可降低气道高反应性翼状粉尘螨- 挑战小鼠

摘要

尿液治疗在古代文明中普遍实践，包括印度，中国和希腊。中药昆基昆虫，人类尿的沉淀，已在中国使用哮喘症状数千年。然而，KWLL施用其免疫疗法的作用机制尚不清楚。本研究试图阐明常规挑战挑战的小鼠的KWLL药理Dermatophagoides pteronyssinus（der p）。BALB / C小鼠在DER P脑内（I.T.）挑战之前口服kwll（1g / kg）。通过重复Der P引发过敏气道炎症和重塑（50 μg/只小鼠）在1小时内挑战6次 评估气道超敏反应、组织学肺特征、细胞因子和各种基因的表达谱。KWLL通过下调支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-5的蛋白表达，降低Der p诱导的气道高反应性，抑制嗜酸性粒细胞浸润KWL还通过下调BALF中的IL-17A来抑制中性粒细胞募集。KWL有效地减少了肺中的炎症细胞、杯状细胞增生以及IL-6和IL-17A的mRNA表达。KWL通过免疫调节IL-5、IL-6和IL-17A来降低过敏性哮喘小鼠的气道炎症和高反应性d IL-17A。

1.介绍

哮喘发病率急剧增加，其发病率和死亡率急剧增加。现在是世界上常见的慢性疾病，特别是在发达国家，2005年的哮喘死亡了255,000人[1.,2.]。在过去几十年里，儿童哮喘患病率增加了大约3倍，目前全球有3亿人受到影响[3.]然而，哮喘的诊断和治疗比其他慢性病更困难，因为哮喘患者具有复杂的异质性综合征和药物反应[4.].大多数哮喘患者联合使用类固醇和β2-肾上腺素能激动剂作为标准疗法[5.,6.]。不幸的是，长期吸入这些药物的患者会产生严重的副作用，有些患者对这些药物反应不令人满意[7.]。

因此，越来越多的患者寻求补充和替代医学(CAM)，如中医(TCM)、草药产品、针灸、呼吸技术和顺势疗法[8.]。最近，有几篇文献表明，中医治疗哮喘是安全有效的[9].根据商汉伦由人尿沉淀物制成的中药KWLL，已被用于治疗肺病相关的证候[10.]。此外，从中世纪到近代，不同文化中也有许多关于尿疗法的实践记录，这些国家都把尿称为“血液中的黄金”和“长生不老药”[11]然而，KWL在哮喘中的作用机制尚不清楚。

过敏性哮喘是由一系列和重复的炎症过程导致的，炎症过程涉及多种类型的白细胞、肥大细胞和巨噬细胞，这些细胞浸润到肺组织，这些细胞分泌许多不同的细胞因子、趋化因子和生长因子[12]总之，这些细胞和介质在哮喘患者中的相互作用和功能导致异常的肺结构和呼吸困难，构成哮喘的基本特征[13]尤其是IL-17A，一种细胞，增加气道平滑肌的收缩力，这有助于过敏原诱导的哮喘气道高反应性[14]。

我们之前开发了一种过敏性哮喘小鼠模型，其表现出与过敏性哮喘患者相似的症状，包括血清中IgE水平高、气道高反应性、气道炎症和重塑[15]我们用这个小鼠模型来研究KWLL对哮喘可能的免疫调节作用。

2.材料和方法

2.1.小鼠和试剂

小鼠实验由中国医科大学机构动物护理和使用委员会批准（编号：100-138-N），并且所有小鼠治疗均符合中华民国国家科学委员会的指南。从中华民国国家实验动物中心购买了五周龄的无BALB/c病原体的雄性小鼠。如前所述制备了粗Der p[15]。

2．2.KWLL准备

KWLL粉末（图1（a）)由凯泽制药有限公司(GMP制药公司，台南，台湾)从7 ~ 12岁男童的尿液沉淀中收集。约10-18 L尿液可产生1 g KWLL。将KWLL溶于蒸馏水用于小鼠给药，使用前保存在−20℃。

2.3.微波辅助酸消化

用于微波加速的反应系统（Marsxpress，CEM公司，马修，NC，USA）用于消化KWLL的酸化样品。系统的全功率约为2.45GHz的频率微波能量。该系统配备了40艘转盘。根据制造商的规格预先校准仪器。微波系统的参数为600W的功率（100％），加热至5.5分钟的175℃，保持4.5分钟，然后冷却1小时。

２.４.电感耦合等离子体光发射光谱法

使用了连续的Jobin Yvon ULTIMA 2000光谱仪，正向功率为1 kW，配备meinhard型雾化器和Scott喷雾室。流速:等离子体气体，12 L/min;鞘气，0.2 L/min;雾化气体，约0.6 L/min(每天优化);样品导入，1 mL/min。铜的波长为324.754 nm;Ca的波长为396.847 nm;Na的波长为568.821 nm。KWLL包含这三个标准元素(参见图)1（b））.

2.5.过敏原激发和气道炎症评估

过敏性气道炎症和重塑由重复的Der p（1）引起 毫克/毫升，50 μL /鼠标）在PBS挑战每周一次5周（共6剂）。在Der P组，Balb / c小鼠（)灌胃，气管内灌胃Der p。KWLL组在Der p接种前30 min灌胃KWLL (1 g/kg)， PBS组灌胃，气管内灌胃PBS。腹腔注射氧嗪(200μg/小鼠）和氯胺酮（2 mg/只小鼠），上次激发后三天，如前所述[15,16].BALF和血清储存于−80°C，直到进一步分析。在白细胞总数计数后，用Liu染色法（生物技术，台湾）以盲法测量白细胞的差异计数。

2.6。测量气道高反应性

根据制造商的方案(Buxco Electronics, Inc, Troy, NY, USA)测量气道反应性，如前所述[15]。

2.7.肺标本的组织学

石蜡包埋的组织在5-μm，分别用PAS和H&E染色。组织部位的识别是在400倍放大倍数下进行的。气道炎症程度表现为炎症细胞浸润。采用5分评分系统(0 - 4级):0级(无炎症细胞);1级,< 25%;2级,25% - -50%;三年级,50% - -75%;4级,≥75%;5级，≥75% [17]。

2.8。胶原蛋白分析

从100 mg小鼠肺组织中提取胶原蛋白，在液氮中均质。用胶原蛋白测定试剂盒(bicolour, Belfast, UK)测定提取上清。

2.9.流式细胞术分析

将PerCP结合抗鼠CD3、PE和/或FITC结合抗鼠CD4、FITC结合抗鼠CD8和FITC结合抗鼠CD25（BD Pharmingen）用于FACScan染色^5.)染色，染色细胞用FACScan (Becton-Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA)进行分析。

2.10。Der p特异性IgG1、IgG2a/2b和总IgE的测定

血清总IgE（1 : 2稀释）和Der p特异性IgG1和IgG2a/2b（1 : 通过ELISA（BD Pharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）测量稀释液（4）。使用生物素抗鼠IgG1和IgG2a/2b抗体（美国加利福尼亚州圣地亚哥市BD Pharmingen）检测Der p特异性IgG1和IgG2a/2b，结果以OD表示_450.．

2.11.细胞因子水平的ELISA

细胞因子IL-5、IL-6、IL-12和IL-17A的数量使用市售的ELISA Ready-SET-Go!Kit (eBioscience, San Diego, CA, USA)。IL-13和IFN-γ酶联免疫吸附试验(ELISA DuoSet!)Kit(研发系统，阿宾顿，英国)。根据制造商的方案，用该反应检测细胞因子浓度。

2.12。定量实时聚合酶链反应(qPCR)

按照Invitrogen生命技术公司的协议，用Trizol试剂提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)将总RNA样本逆转录为cDNA。采用1μL的cDNA，一个快速启动的通用SYBR绿色主试剂盒（罗氏），和一套先前报道的特定基因引物[15]。

2.13。统计分析

结果显示为平均值±标准误差。学生们-检验用于估计组间值的差异。的值被认为意义重大。

3.结果

3.1。KWLL在哮喘小鼠模型中抑制了危险的气道高反应性

首先，我们使用重复的Der p刺激小鼠模型来研究口服KWLL对过敏原诱导的气道高反应性的影响。为了确定哪个剂量是最合适的浓度和减少动物牺牲为后续实验，增强暂停(Penh)值作为气道反应性的选择标志。此外,老鼠连续服用剂量的增加KWLL(1克/公斤:1 x, 2 g / kg: 2 x,和4 g / kg: 4 x) 30分钟之前挑战Der p。我们发现,老鼠在Der金边值p组高于PBS组尤为显著的差异的最大剂量乙酰甲胆碱。然而，在最大剂量methacholine (50 mg/mL)下，1X (1 g/kg)组的Penh值也显著低于Der p组(图)2.）.

3.2.KWLL可减轻Der p诱导的气道炎症

在后续研究中，每接种一次Der p，每隔1周给BALB/c小鼠口服1 g/kg KWLL，最后一次攻毒后72小时处死小鼠。PBS小鼠BALF中未检测到嗜酸性粒细胞。然而，在Der p组中，BALF中总细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞明显高于PBS小鼠(图)3.）.在KWLL组中，BALF中总细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞明显低于Der p组。

３．３．KWLL改善Der p诱导的肺病理

气道炎症、增生杯状细胞和胶原沉积是哮喘患者的典型特征。Der p组肺组织组织学切片显示炎性细胞和增生杯状细胞增多(图)4(一))，与PBS组比较。与Der p组相比，KWLL组炎症细胞和增生性杯状细胞明显减少。然而，在胶原沉积水平方面，KWLL组与Der p组无显著差异(图)4（c））.

3．4．KWLL影响BALF t细胞亚群和血清抗体

我们使用单克隆抗体通过流式细胞术测定KWLL对t细胞亚群的影响(图)5（a））.结果显示，Der p组CD3的百分比明显增加⁺CD4⁺和CD4⁺CD25⁺T细胞比PBS组。相比之下，KWLL组小鼠在CD3的百分比上显示出没有显着差异⁺CD4⁺和CD4⁺CD25⁺T细胞与Der p组小鼠相比。然而，CD3的水平⁺CD8⁺三组小鼠BALF中的T细胞没有显著差异，但我们发现CD3的百分比⁺CD4^-CD8^-(双阴性)T细胞在KWLL组高于Der p组。

为了评价KWLL对反复激发Der p小鼠体液免疫应答状态的影响，我们采集了血清，并检测血清中Der p特异性IgG1、IgG2a/2b和总IgE抗体(图)5（b））.与PBS组小鼠相比，Der p组小鼠血清中Der p特异性IgG1、IgG2a/2b和总IgE水平显著升高。而KWLL组与Der p组相比，Der p特异性IgG1、IgG2a/2b及总IgE浓度均无显著差异。

3．5．KWLL抑制Der p诱导的BALF促炎和细胞因子的蛋白生成

为了分析KWLL对t细胞的影响，我们评估了KWLL对BALF中t细胞细胞因子分泌的影响。结果表明，KWLL不仅能显著降低Der p诱导的表达细胞因子，如IL-5、IL-6和IL-13与Der p组小鼠相比，类细胞因子IL-17A（图6（a））.此外，Kwll组小鼠略微减少干扰素的细胞因子水平-γ虽然生产的差异不显着，但是由Der P诱导的IL-12诱导的诱导诱导的诱导的诱导的。

3.6。KWLL调控Der p诱导的肺组织促炎细胞因子和趋化因子的基因表达

KWLL组的IL-6（下降0.62倍）和IL-17A（下降0.51倍）合成水平明显低于Der p组（图6（b））.我们发现，Der p组小鼠的MCP-1、eotaxin和IL-1表达水平显著升高β比在PBS组中。但是，IL-1的表达水平βKWLL组中的eTotaxin和MCP-1 mRNA略微下降，但生产的差异不显着（数据未显示）。

4.讨论

在本研究中，我们发现，在我们的过敏性哮喘小鼠模型中，KWLL治疗抑制了气道高反应性并减少了气道炎症细胞。与Der p组相比，kwll处理组BALF中巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的总数和百分比明显减少。此外，肺组织学分析显示，除胶原沉积程度外，KWLL治疗还减少了增生杯状细胞和炎症细胞的数量。因此，KWLL对Der p变应原致敏和受激小鼠气道高反应性降低的作用可能与其对气道嗜酸性粒细胞和中性粒细胞及肺杯状细胞增生等炎症细胞浸润减少的作用有关。

最近的研究报告了T细胞在哮喘炎症反应的协调中的重要作用，使它们成为潜在的临床应用治疗靶点[18–20]在这项研究中，我们发现口服KWL治疗组BALF中的淋巴细胞数量比Der p组显著增加（图3.).KWLL治疗对两组间的同型转换没有任何影响和抗体(图5（b）)我们推测口服KWLL可引起双阴性（CD3）的增加⁺CD4^-CD8^-) T细胞和少量CD25⁺CD4⁺细胞，而不是CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺t细胞亚群(图5（a）)因此，KWL对过敏原致敏小鼠的免疫调节作用可能通过调节和激活治疗小鼠的T细胞亚群来实现。

嗜酸性粒细胞是炎症晚期起始的主要效应细胞，IL-5在嗜酸性粒细胞的分化、生长、存活和炎症部位的招募中具有特定的作用[11,21,22]此外，哮喘气道高反应性和气道重塑的增加可能是由于炎症气道中IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的产生增加所致[23]在目前的研究中，我们发现KWL治疗降低了BALF中IL-5、IL-6和IL-13的水平（图6（a））.因此，通过这些调制细胞因子如IL-5、IL-6和IL-13, KWLL治疗可减少嗜酸性粒细胞浸润和气道高反应性。然而，KWLL处理对eotaxin和MCP-1的基因表达没有影响(数据未显示)，这也与嗜酸性粒细胞浸润有关。

在过敏性哮喘患者中发现升高的IL-17A浓度，并且这种发现与哮喘的严重程度相关[24–27]最近，IL-17A在气道炎症、中性粒细胞募集、气道高反应性和气道重塑中起着关键作用[28，它也会增强细胞介导的哮喘患者气道中的嗜酸性嗜酸性炎症[29]。IL-6在改变Treg和之间的平衡中也发挥了关键作用因此，调节IL-6和IL-17细胞因子的产生和活性可能是治疗各种自身免疫和炎症性疾病的有效方法[30]在我们的研究中，KWL治疗导致BALF中IL-6和IL-17A细胞因子的分泌减少，并下调这些细胞因子在肺部的mRNA表达。这些结果表明KWL通过调节但不调节IL-1的基因表达β（数据未显示）。

此外，我们未发表的数据还显示，在小鼠中，增加剂量(1、2和4倍)的KWLL不仅会增加IL-17A的蛋白分泌和基因表达(数据未显示)，而且还会连续增强气道高反应性(图)2.）.因此，我们推测KWLL通过下调IL17减少了气道高反应性，这是依赖的剂量。

总之，在慢性哮喘小鼠中给予KWLL可增加T细胞，减少嗜酸性粒细胞和中性粒细胞向肺部的募集。这种免疫调节作用可能导致炎症和气道高反应性的减少，并与IL-5、IL-6和il - 17的下调相关。因此，本研究首次提供了KWLL对哮喘缓解状态具有免疫调节作用的证据。然而，尚未对其药理活性成分进行鉴定。中药对慢性哮喘患者的分子作用机制有待进一步研究。

缩写

BALF：	支气管肺泡灌洗液
d der p：	Dermatophagoides
信息技术。	气管内的
中医药：	中国传统医学。

利益冲突

所有作者均声明没有利益冲突。

作者的贡献

林志强和王世德对这项工作的贡献不相上下。

致谢

中华人民共和国国家科学委员会基金资助项目(no . NSC 100-2320-B-039-017);中国医科大学基金资助项目(no . CMU98-N2-11);中华人民共和国中医药科学委员会基金资助项目(no . CCMP 94-RD-043);台湾经济部基金资助项目(no . 101-EC-17-A-10-S1-156)。

参考文献

1. H. Hammad和B. N. Lambrecht，“树突状细胞和气道上皮细胞在先天和适应性免疫反应之间的界面”，过敏第66期5，pp。579-587，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
2. S. Makino和H. Sagara，“哮喘概念的演变和当前哮喘管理指南的影响”，过敏、哮喘与免疫学研究，第2卷，第3期，第172-176页，2010年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
3. 李晓明，“用中药的草药干预治疗哮喘和食物过敏，”西奈山医学杂志，第78卷，第5期，第697-716页，2011年。查看在：谷歌学术搜索
4. D. J. Adamko, B. D. Sykes和B. H. Rowe，《哮喘的代谢组学:新的诊断潜力》，胸部，第141卷，第5期，第1295-13022012页。查看在：谷歌学术搜索
5. I.P.Hall，“Theβ受体激动剂争议重新审视。”《柳叶刀》，第363卷，第9404号，第183-184页，2004年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
6. a . Sheth, S. Reddymasu，和R. Jackson，“系统性皮质类固醇导致哮喘恶化:一个病例报告和文献综述，”普通内科杂志，第21卷，第2期，第11-13页，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
7. 李晓明，“儿童过敏性疾病的补充和替代医学，”过敏反应与临床免疫学的最新观点，第9卷，第5期。2，页161-167,2009。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
8. C. A. Slader，H.K.K.Reddel，C.R.Jenkins，C.L.L. Armor和S. Z.Bosnic-Anticevich，“哮喘互补和替代医学用途：谁在使用什么？”Respirology，第11卷，第4期，第373-387页，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
9. 李新民，“中药治疗哮喘和过敏的疗效及作用机制”，《中国中医杂志》，过敏与临床免疫学杂志，卷。123，没有。2，pp。297-306，2009。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
10. 李东源，林吉明，Y.C.Eric等，“人类尿液的影响与台湾家庭饮水动机，”台湾中医药杂志，第一卷，第一期，第62-72页，2001年。查看在：谷歌学术搜索
11. V. Savica，L. A.Calò，D. Santoro，P. Monardo，A. Mallamace和G. Bellinghieri，“尿液治疗通过世纪，”肾脏学杂志》，第24卷，第2期17, pp. S123-S125, 2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
12. S.J.Galli、M.Tsai和A.M.Piliponsky，“过敏性炎症的发展，”自然界，第454卷，第2期。7203页，445 - 454,2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
13. S.Verstraelen、K.Bloemen、I.Nelissen、H.Witters、G.Schoters和R.V.D.Heuvel，“与过敏性哮喘有关的细胞类型及其在体外模型中评估呼吸致敏性的应用，”毒理学体外第22卷第2期6，第1419-1431页，2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
14. M.Kudo，A.C.Melton，C.Chen等人，“由αβT细胞驱动小鼠气道高度反应性，并增强小鼠和人类气道平滑肌收缩。”自然医学，卷。18，不。4，pp。547-554,2012。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
15. L. J. Lin，C.林，S. D. Wang，Y.P. Chao，以及S. T.Kao，“u-gui-wan的免疫调节作用Dermatogoides-pteronyssinus-诱发哮喘，”循证补充和替代医学， 2012年第4期，文章编号476060,12页，2012年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
16. 王淑东，林丽娟，陈春林等，“小青龙汤减轻重复性气道过敏炎症和气道重塑翼状皮甲慢性哮喘小鼠模型民族药物学杂志，第142卷，第2期，第531-538页，2012年。查看在：谷歌学术搜索
17. S. SAW，S.L.S.KALE和N.ARORA，“丝氨酸蛋白酶抑制剂衰减过敏气道疾病小鼠模型中的卵泡诱导的炎症”公共科学图书馆一号，第7卷，第7号，物品编号e41107，2012年。查看在：谷歌学术搜索
18. F. D'Acquisto和T. Crompton， "$\text{光盘}{3.}^{+}\text{光盘}{4.}^{-}\text{光盘}{8.}^{-}$（双阴性）T细胞：免疫反应的救护者或恶棍？“生化药理学，第82卷，第4期，第333-340页，2011年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
19. B. D. Medoff, S. Y. Thomas, A. D. Luster，《过敏性哮喘中的T细胞贩运:来龙去路》，免疫学年度回顾，卷。26，pp。205-232,2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
20. J. Kearley, D. S. Robinson和C. M. Lloyd，“CD4⁺CD25⁺调节性T细胞反向建立过敏气道炎症并防止气道重塑，“过敏与临床免疫学杂志第122卷3，页617-e6, 2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
21. P.S.Foster，A.W.Mold，M.Yang等人，“调节肺中嗜酸性粒细胞积聚的元素信号，”免疫审查，第179卷，第173-181页，2001。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
22. M.E.Rothenberg和S.P.Hogan，“嗜酸性粒细胞，”免疫学年度回顾，第24卷，第147-174页，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
23. L.Cosmi、F.Liotta、E.Maggi、S.Romagnani和F.Annunziato，“Th17细胞：哮喘发病机制中的新角色，”过敏第66期8, pp. 989-998, 2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
24. S. T. Holgate和R. Polosa，《过敏和哮喘的治疗策略》，自然评论免疫学，卷。8，不。3，第218-230,2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
25. A. Barczyk, W. Pierzcha和E. Sozañska，“痰中白细胞介素-17与气道对甲胆碱的高反应性相关，”呼吸医学，卷。97，没有。6，pp。726-733，2003。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
26. S. Molet, Q. Hamid, F. Davoine等人，“IL-17在哮喘气道中增加，并诱导人类支气管成纤维细胞产生细胞因子，”过敏与临床免疫学杂志，第108卷，第108号3，页430-438,2001。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
27. S. Schnyder-Candrian，D. Togbe，I. Couillin等，“白细胞介素-17是成熟过敏哮喘的负调节因子”，《实验医学杂志》，第203卷，第12期，第2715-2725页，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
28. A. Lindén，“白细胞介素-17与气道重塑”，肺部药理学与治疗学第19卷第2期1，页47 - 50,2006。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
29. S. J. Park和Y. C. Lee，《白介素17调控:治疗哮喘的一种有吸引力的方法》，呼吸研究， 2010年第11卷，第78条。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
30. A. Kimura和T. Kishimoto，《IL-6: Treg/Th17平衡的调节者》欧洲免疫学杂志，卷。40，不。7，pp。1830-1835,2010。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索

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