小鼠实验经中国医科大学动物保护与使用委员会批准(编号:070901)。100-138-N)，所有小鼠治疗均符合中华民国国家科学委员会指南。5周龄雄性小鼠购自中华民国国家实验动物中心，BALB/c特异性无致病性。Crude Der p的制备如前所述[ 15］．

KWLL粉(图 1(一))由凯泽制药有限公司(GMP制药公司，台南，台湾)从7 ~ 12岁男童的尿液沉淀中收集。约10-18 L尿液可产生1 g KWLL。将KWLL溶于蒸馏水用于小鼠给药，使用前保存在−20℃。

使用微波加速反应系统（美国北卡罗来纳州马修斯CEM公司MARSXpress）消化KWLL的酸化样品。该系统的全功率约为1200 频率为2.45时的微波能量W 该系统配备了一个40个容器的转台。该仪器根据制造商的规范进行了预校准。微波系统的参数为600 功率（100%）W，加热至175°C超过5.5 最小值，保持4.5 分钟，然后冷却1分钟 H

使用了连续的Jobin Yvon ULTIMA 2000光谱仪，正向功率为1 kW，配备meinhard型雾化器和Scott喷雾室。流速:等离子体气体，12 L/min;鞘气，0.2 L/min;雾化气体，约0.6 L/min(每天优化);样品导入，1 mL/min。铜的波长为324.754 nm;Ca的波长为396.847 nm;Na的波长为568.821 nm。KWLL包含这三个标准元素(参见图) 1 (b)）．

反复服用Der (1 mg/mL, 50 mg/mL)可诱发过敏性气道炎症和气道重塑 μ在Der p组中，BALB/c小鼠( n ＝ 6 )灌胃，气管内灌胃Der p。KWLL组在Der p接种前30 min灌胃KWLL (1 g/kg)， PBS组灌胃，气管内灌胃PBS。腹腔注射氧嗪(200 μG /小鼠)及氯胺酮(2毫克/小鼠)，如先前报告[ 15， 16］．BALF和血清保存在−80°C，直到进一步检测。在总白细胞计数后，用Liu染色(生物技术，台湾)盲法测定白细胞的差异计数。

根据制造商的方案(Buxco Electronics, Inc, Troy, NY, USA)测量气道反应性，如前所述[ 15］．

石蜡包埋组织于5℃切片- μm，分别用PAS和H&E染色。组织部位的识别是在400倍放大倍数下进行的。气道炎症程度表现为炎症细胞浸润。采用5分评分系统(0 - 4级):0级(无炎症细胞);1级,< 25%;2级,25% - -50%;三年级,50% - -75%;4级,≥75%;5级，≥75% [ 17］．

从100 mg小鼠肺组织中提取胶原蛋白，在液氮中均质。用胶原蛋白测定试剂盒(bicolour, Belfast, UK)测定提取上清。

使用percp偶联的抗鼠CD3、PE和/或fitc偶联的抗鼠CD4、fitc偶联的抗鼠CD8和fitc偶联的抗鼠CD25 (BD Pharmingen)进行FACScan染色。BALF细胞(1 × 10⁵)染色，染色细胞用FACScan (Becton-Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA)进行分析。

采用ELISA法(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)检测血清总IgE(1:2稀释)和Der p特异性IgG1和IgG2a/2b(1:4稀释)。使用biotin antimouse IgG1和IgG2a/2b抗体(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)检测Der p特异性IgG1和IgG2a/2b，结果以OD表达₄₅₀．

细胞因子IL-5、IL-6、IL-12和IL-17A的数量使用市售的ELISA Ready-SET-Go!Kit (eBioscience, San Diego, CA, USA)。IL-13和IFN- γ酶联免疫吸附试验(ELISA DuoSet!)Kit(研发系统，阿宾顿，英国)。根据制造商的方案，用该反应检测细胞因子浓度。

按照Invitrogen生命技术公司的协议，用Trizol试剂提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)将总RNA样本逆转录为cDNA。采用1 μL的cDNA，一个FastStart Universal SYBR Green Master kit (Roche)，和一个特定基因引物集，如前所述[ 15］．

结果显示为平均值±标准误差。学生的 t -检验用于估计组间值的差异。的值 P < 0．05 被认为是显著的。

首先，我们使用重复的Der p刺激小鼠模型来研究口服KWLL对过敏原诱导的气道高反应性的影响。为了确定哪个剂量是最合适的浓度和减少动物牺牲为后续实验，增强暂停(Penh)值作为气道反应性的选择标志。此外,老鼠连续服用剂量的增加KWLL(1克/公斤:1 x, 2 g / kg: 2 x,和4 g / kg: 4 x) 30分钟之前挑战Der p。我们发现,老鼠在Der金边值p组高于PBS组尤为显著的差异的最大剂量乙酰甲胆碱。然而，在最大剂量methacholine (50 mg/mL)下，1X (1 g/kg)组的Penh值也显著低于Der p组(图) 2）．

在后续研究中，每接种一次Der p，每隔1周给BALB/c小鼠口服1 g/kg KWLL，最后一次攻毒后72小时处死小鼠。PBS小鼠BALF中未检测到嗜酸性粒细胞。然而，在Der p组中，BALF中总细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞明显高于PBS小鼠(图) 3.）．在KWLL组中，BALF中总细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞明显低于Der p组。

气道炎症、增生杯状细胞和胶原沉积是哮喘患者的典型特征。Der p组肺组织组织学切片显示炎性细胞和增生杯状细胞增多(图) 4(一))，与PBS组比较。与Der p组相比，KWLL组炎症细胞和增生性杯状细胞明显减少。然而，在胶原沉积水平方面，KWLL组与Der p组无显著差异(图) 4（c））．

我们使用单克隆抗体通过流式细胞术测定KWLL对t细胞亚群的影响(图) 5（a））．结果显示，Der p组CD3的百分比明显增加⁺CD4⁺和CD4⁺CD25⁺与PBS组相比，KWLL组小鼠的CD3百分比没有显著差异⁺CD4⁺和CD4⁺CD25⁺T细胞与Der p组小鼠相比。然而，CD3的水平⁺CD8⁺BALF中的T细胞在三组小鼠之间没有显著差异，但我们发现CD3的百分比⁺CD4⁻CD8⁻(双阴性)T细胞在KWLL组高于Der p组。

为了评价KWLL对反复激发Der p小鼠体液免疫应答状态的影响，我们采集了血清，并检测血清中Der p特异性IgG1、IgG2a/2b和总IgE抗体(图) 5（b））．与PBS组小鼠相比，Der p组小鼠血清中Der p特异性IgG1、IgG2a/2b和总IgE水平显著升高。而KWLL组与Der p组相比，Der p特异性IgG1、IgG2a/2b及总IgE浓度均无显著差异。

为了分析KWLL对t细胞的影响，我们评估了KWLL对BALF中t细胞细胞因子分泌的影响。结果表明，KWLL不仅能显著降低Der p诱导的表达 T H 2 细胞因子，如IL-5, IL-6, IL-13 T H 17 与Der p组小鼠相比(图) 6（a）).此外，KWL组小鼠的 T H 1 IFN-的细胞因子水平 γ与Der p组小鼠相比，Der p诱导的IL-12产生过多，尽管产生差异不显著。

与Der p组相比，KWLL组的IL-6(下降0.62倍)和IL-17A(下降0.51倍)合成水平显著降低(图) 6（b））．我们发现，Der p组小鼠的MCP-1、eotaxin和IL-1表达水平显著升高 β与PBS组相比，IL-1的表达水平 βKWLL组小鼠的eotaxin和MCP-1mRNA的表达量略低于Der p组小鼠，但差异不显著（数据未显示）。