文摘

鞣花单宁(ETs)从石榴汁(PJ)生物活性多酚与chemopreventive潜在对抗前列腺癌(PCa)。ETs是不完整,但部分水解在肠道吸收,鞣花酸(EA)。结肠微生物群落可以转换EA urolithin (UA), EA和UA PJ消费后进入循环。在这里,我们研究了EA和UA的影响细胞增殖,细胞周期和细胞凋亡在du - 145和曲泽androgen-independent PCa细胞和EA和UA的组合是否影响细胞增殖。EA表明更大的抗增殖效果在两个细胞系存在剂量依赖的相关性而UA。EA诱导细胞周期阻滞在S期和减少细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白D1的水平。UA诱导G2 / M逮捕和增加细胞周期蛋白B1和cdc2 tyrosine-15磷酸化,表明失活的细胞周期蛋白B1 / cdc2激酶复杂。EA细胞系的诱导细胞凋亡,而UA proapoptotic少明显的影响只在du - 145。Cotreatment低浓度的EA和UA大大减少细胞增殖,曲泽细胞表现出合作评估isobolographic指数分析和组合。这些数据提供的信息石榴代谢物的PCa预防复发,支持肠道癌症预防flora-derived代谢物的作用。

1。介绍

前列腺癌(PCa)是第二个最常见的癌症,在男性癌症死亡的第二大原因,美国每年有超过300000例诊断(1]随着全球越来越发病率由于全球人口的增长和老龄化2]。大约有30%的男性PCa与手术或放射治疗复发性疾病的证据,在男性的一个子集,前列腺特异性抗原(PSA)水平在治疗后继续上升(3]。在这种情况下,上升的PSA代表肿瘤生长,男人用更短的PSA值翻倍是认为有更多的快速增长的肿瘤(4,5]。第二阶段的研究石榴汁(PJ)的影响在男性PSA手术或放疗后上升的主成分分析表明,消费8盎司的PJ PSA倍增时间显著增加,从15岁到54个月,建议PJ代谢物在PCa细胞生长的抑制作用[6]。

PJ以及石榴提取物(PE)包含一个家庭几个高分子量(ca.1000道尔顿)可水解的单宁(例如,punicalagin punicalin)称为鞣花单宁(ETs),收到越来越多的关注对他们潜在的无毒chemopreventive饮食代理几个恶性肿瘤,包括PCa (7]。ETs是不完整的人类胃肠道吸收,但水解,生成不同的代谢物包括鞣花酸(EA),在30分钟和5小时后消费之间的循环PJ或PE (8,9]。通过人类结肠微生物区系的行动,EA部分转化为代谢产物包括hydroxy-6H-benzopyran-6-one衍生品,主要urolithin (UA)(图1)。EA和UA都吸收,运输血液中,共轭在肝脏,在glucuronidated形式排泄尿液PJ消费后12到56个小时(10,11]。

越来越多的实验证据表明,PE抑制肿瘤血管生成(12),延迟从androgen-dependent过渡到androgen-independent表型,通过核factor-kB-dependent凋亡机制在体外在肿瘤组织切除阉割严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠前列腺Cancer-4洛杉矶(LAPC-4)人类PCa异种移植13]。以前的在体外研究表明,石榴代谢物,EA和UA,抑制PCa细胞增殖(14,15)和受影响的多个信号通路在几个细胞类型(16- - - - - -18]。例如,UA肿瘤特异性细胞色素P450的活动和表达减少,CYP1B1,在22个rv1 PCa细胞(19),而通过caspase-dependent EA诱导细胞凋亡通路(15和细胞周期阻滞在G1期细胞周期蛋白依赖性激酶抑制p21蛋白(20.]。此外,EA癌症细胞系表现出选择性抗增殖活动而不影响人类的非肿瘤细胞的生存能力21,22]。其他在体外研究表明,特定的组件PJ抑制生长和迁移的激素依赖性和hormone-refractory PCa细胞生长及其趋化作用对基质细胞衍生因子1α(SDF1α)[23]。

由不同的细胞蛋白细胞周期进程严格监管包括细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)及其调控细胞周期蛋白伙伴24]。像其他形式的癌症,PCa肿瘤细胞获得突变基因直接调节细胞周期,导致一个无限制的细胞增殖(25- - - - - -28]。事实上,损失或衰减的G2 / M检查点,控制细胞周期蛋白B1 / cdc2 (Cdk1)复杂,已被证明是密切参与肿瘤的转换(24)和管制过度的进化相关的细胞周期蛋白D1可能androgen-independent疾病PCa (29日,30.]。因此,治疗肿瘤细胞通常会导致细胞周期机械的故障导致的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。为了提高我们的理解在androgen-independent PJ代谢物的作用机制PCa癌细胞,当下在体外研究旨在阐明EA及其主要microflora-derived代谢物的影响,UA、细胞增殖、细胞周期分布,细胞凋亡,细胞cycle-related控制蛋白的表达。此外,我们检查的抗增殖作用cotreatment EA和UA评估其潜在的协同,添加剂或敌对的交互。

2。材料和方法

2.1。化学品和抗体

鞣花酸是购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国),而urolithin合成在我们实验室如前所述[9]。化学物质都溶解在DMSO和存储−20°C。抗体的细胞周期蛋白B1,细胞周期蛋白D1, p-cdc2 (Tyr.15)β肌动蛋白从细胞购买信号(美国贝弗利,MA)。CellTiter-Glo发光细胞生存能力分析工具从Promega购买公司(美国麦迪逊,WI)。膜联蛋白V细胞凋亡检测设备是来自BD Pharmingen(美国圣地亚哥,CA)。

2.2。细胞培养

Androgen-independent PCa细胞系,du - 145和曲泽,来自美国类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。细胞系都维护在rpmi - 1640中补充10%胎牛血清,2%谷酰胺,1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL,弗雷德里克,医学博士,美国)。细胞被用来通过20以下,保持在37°C调湿有限公司5%₂在37°C,亚文化在1:4通过胰蛋白酶化4分钟37°C (Gibco-BRL)。每个实验之前,细胞被切换完成RPMI苯酚red-free介质,对照组服用适量的DMSO溶液。

2.3。细胞生长抑制试验数据分析和组合

细胞增殖是决定使用CellTiter-Glo (ATP)试验(Promega)根据制造商的指示。简单,细胞被播种到96 - opaque-walled板的密度每在100年12000个细胞μL (RPMI苯酚red-free完全培养基。24小时后,介质是小心地删除和细胞治疗在完全培养基24,48岁,72年、96年和120年与EA(从15到60小时μmol / L), UA(从15到90年μmol / L)或DMSO溶液。cotreatments EA和UA的影响评估在72小时治疗曲泽细胞与EA(从1.875到30μmol / L)和UA(从5到180μmol / L)。与其他测试浓度是一致的在体外研究[14,15,21]。DMSO的数量在所有规范化治疗。在指定的时间点,细胞在室温下保持30分钟,和100年μL的化验试剂添加到每个。内容是混合2分钟使用一个轨道振动诱导细胞溶菌作用。10分钟后在室温下孵化,发光是使用一个微型板块读者阅读(SpectraMax双子座EM、分子器件、桑尼维尔,美国)。集成电路的计算₄₀和集成电路₅₀然后执行。组合效果评估通过确定组合指数(CI)使用isobologram方程导出了周和Talalay31日]。一般来说,一个CI值< 0.9表示合作,一个值在0.9和1.1之间表示可加性,和CI值> 1.1表示对立。isobologram,和仅代表EA的剂量和UA产生抑制细胞生长所需的40% (IC₄₀),和是所需的剂量的EA和UA结合产生同样的效果(集成电路吗₄₀)。右侧的IC₄₀添加剂线代表拮抗剂作用,而左边代表了协同效应。

2.4。蛋白质的提取和免疫印迹分析

du - 145和曲泽镀在60毫米菜完全RPMI phenol-red-free媒介。细胞治疗与不同浓度的EA(15、30和45μmol / L)或UA(30、60和90μmol / L) 48和72小时。治疗后,细胞被洗冷PBS,收获,和细胞溶解产物里帕也准备了缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.4,150毫米氯化钠,2毫米EDTA,特里同1%,和0.1% SDS),含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1% v / v) (Sigma-Aldrich),磷酸酶抑制剂鸡尾酒(1% v / v) (Sigma-Aldrich)和20毫米N-ethylmaleimide (Sigma-Aldrich), 40分钟在4°C。细胞溶解产物离心10分钟14000 rpm在4°C,和上层的收集。细胞溶解产物进行了分析,采用BCA蛋白质测定蛋白质含量与牛血清白蛋白作为标准。溶菌产物被混合4 x摩门教的缓冲区(表达载体)和加热10分钟在70°C。

55 - 65μg全细胞蛋白质的溶解产物分离使用4 - 12% sds - page (NUPAGE表达载体),转移到PVDF膜,和阻塞1小时T-TBS牛奶5%,含0.1% Tween-20(σ)。PVDF膜被孵化一夜之间在4°C的不同主要抗体T-TBS 5%的牛奶,然后处理特定的辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit或anti-mouse二级抗体。β肌动蛋白是用作内部加载控制。光密度测量的乐队在免疫印迹分析使用一个软件(Bio-Rad)数量进行。

2.5。细胞周期分析

du - 145和曲泽细胞被镀在100毫米菜红phenol-free RPMI完全培养基和治疗有或没有不同浓度的EA或UA 48岁,72年,96个小时。2分钟孵化后胰蛋白酶,附着和漂浮细胞被收集。1×10⁶细胞然后用冷PBS旋转下来洗一次。每个小球resuspended于500年μL(低渗的PI染色溶液含有0.1% (w / v)柠檬酸钠,0.3% (v / v)特里同x - 100, 0.1毫克/毫升π,和0.02毫克/毫升核糖核酸酶a样本在4°C蒙在鼓里收购前20分钟。收购进行FACScan流式细胞分析仪与CellQuest软件。每样品共计20000事件。数据分析使用ModFit LT软件(Topsham真实软件,Inc .,我,美国)。

2.6。检测细胞凋亡

2.6.1。膜联蛋白V / PI染色

du - 145和曲泽细胞被镀在100毫米菜红phenol-free RPMI完全培养基,然后处理或不不同浓度的EA(15、30和45μmol / L)或UA(30、60和90μmol / L) 48和72小时。治疗后,信徒和漂浮细胞收集。1×10⁶细胞被离心分离,颗粒与冷PBS洗一次。凋亡细胞与膜联蛋白V-FITC和π双重染色,使用膜联蛋白V细胞凋亡检测装备,BD Pharmingen(美国圣地亚哥,CA),根据制造商的指示。染色后,在黑暗中样本孵化20分钟在4°C,和流动仪进行了分析。数据采集和分析进行了FACScan血细胞计数器(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)使用CellQuest软件。细胞早期凋亡的膜联蛋白V积极和π消极,而晚期凋亡的细胞都是膜联蛋白V和π积极。

2.7。统计分析

报告所有数据的平均数±标准差和代表至少有三个独立的实验。统计分析采用方差分析和图基的事后Statistica软件(美国塔尔萨好统计软Inc .)。团体被认为是显著的区别。

3所示。结果

3.1。EA和UA不同抑制细胞增殖的du - 145和曲泽前列腺癌细胞

细胞生长抑制的敏感性的增加浓度的EA(从15到60μmol / L)和UA(从15到90年μmol / L)检查在24、48、72、96和120小时du - 145和曲泽,两个androgen-independent PCa细胞系。治疗与EA和UA细胞系细胞生长降低时间和剂量依赖性的方式(图2)。然而,EA的测试浓度和UA展出微分效应两个细胞系。治疗后与EA, IC₅₀在96小时μmol / L DU145细胞,而在曲泽IC₅₀得到的浓度μ在48小时内mol / L,μ在96小时(mol / L数据2(一个)和2 (c))。集成电路与UA治疗后,在96小时₅₀是μmol / L(图2 (b))在du - 145细胞,而在曲泽UA没有达到50%的细胞生长抑制浓度(图进行测试2 (d))。

这些数据表明,曲泽细胞更敏感比du - 145 EA治疗,而治疗UA相比表现出更强的抗增殖效果du - 145年曲泽细胞。

3.2。EA和UA诱导细胞周期阻滞在S和G2 / M期

观察到的差异的EA和UA治疗细胞增殖建议不同这两个化合物的作用机制。通过使用FACScan流式细胞分析仪,我们首先研究EA和UA是否可能影响细胞周期。治疗后30和45μmol / L的EA 72小时,du - 145和曲泽显示显著增加细胞的S期相比,DMSO控制(DMSO控制与EA 30μmol / L, du - 145细胞,%与%;在曲泽细胞中,%与%,与控制)。另一方面,治疗60和90μmol / L的UA诱导显著积累细胞G2 / M期(飞往洛杉机的联合航空90班机μmol / L, du - 145年,%;在曲泽细胞中,%,与控制(图3))。治疗与EA导致减少细胞的百分比在G1和G2,而UA导致减少的百分比在G1和S期细胞。这些事件被观察到48、72和96小时表明EA和UA对细胞周期的影响持续超过96小时。

为了研究分子机制参与观察EA和UA对细胞周期的影响,细胞周期蛋白D1的变化,细胞周期蛋白B1, cdc2磷酸化tyrosine-15被免疫印迹了。激活细胞周期蛋白B1 / cdc2复杂(也称为有丝分裂促进因子(强积金))是一个必要的推动进入有丝分裂细胞周期一步G2期,和细胞周期蛋白B1 / cdc2复杂控制的一系列可逆磷酸化cdc2 [32]。由cdk-activating激酶磷酸化的cdc2苏氨酸- 161 (CAK)和由cdc25C磷酸酶去磷酸化的cdc2 tyrosine-15所需的强积金激活(33]。另一方面,如果tyrosine-15磷酸化的cdc2凌晨/ Mik1 Myt1酪氨酸激酶发生,强积金仍不活跃导致G2 / M细胞周期阻滞(34,35]。治疗48和72小时后,在30浓度,60岁,90μmol / L, UA诱导cdc2磷酸化tyrosine-15和细胞周期蛋白的积累B1(图4(一)),符合观察G2 / M细胞周期阻滞。另一方面,在15浓度,30和45μmol / L, EA治疗诱导减少细胞周期蛋白B1和周期蛋白D1的表情,逮捕符合s阶段,没有cdc2 tyrosine-15磷酸化的证据(图4 (b))。综上所述,这些数据表明,EA和UA的调制有着截然不同的影响导致逮捕的细胞周期调节蛋白的细胞周期在两个不同的阶段。

3.3。EA和UA对细胞凋亡的影响

我们进一步研究了EA和UA对细胞凋亡的影响使用膜联蛋白V-FITC / PI双染色法。与15日du - 145细胞的治疗后30和45μmol / L的EA 72小时,细胞的百分比在细胞凋亡的早期和晚期阶段增加浓度的方式,相对于控制(DMSO控制与EA 45μmol / L,%与%,du - 145),而治疗30、60和90年μmol / L的UA导致更少的明显proapoptotic活动相比,EA(图5),在测试浓度无显著差异(DMSO控制与飞往洛杉机的联合航空90班机μmol / L,%与,)。在EA曲泽细胞,治疗导致显著增加凋亡细胞的数量只在最高浓度测试(DMSO控制与EA 45μ16.05 mol / L,而%,),而UA的最高浓度测试没有造成明显的细胞凋亡(DMSO控制与飞往洛杉机的联合航空90班机μmol / L, NS, 7.72%比5.72%)。

3.4。Cotreatment EA和UA协同抑制曲泽细胞增殖

因为EA和UA引起了不同的细胞周期和细胞凋亡反应,我们进一步研究了不同剂量的组合UA和EA曲泽细胞增殖寻求协同的证据,添加剂,或敌对的交互。我们第一次评估的影响UA浓度的增加(从15到180μ7.5 mol / L)单独或结合μmol / L的EA 72小时。showen的人物6(一),没有一个剂量的UA感应IC测试₅₀。然而,低浓度的EA和治疗UA相比显著减少细胞增殖控制相结合,以及与个人剂量的EA和UA(图6(一))。此外,曲泽细胞与不同浓度的EA治疗72小时(从1.875到30μmol / L)和UA (5 - 180μmol / L),单独或组合。以来的最大抑制细胞生长与UA曲泽细胞达到158的浓度是40%μmol / L,我们使用了集成电路₄₀isobolographic分析的协同作用而不是典型的集成电路₅₀。因此,集成电路₄₀计算和协同效应的评估使用isobolographic分析。结果isobologram方程,用三种不同浓度的EA和UA,每个剂量抑制曲泽细胞增长40% (IC₄₀),演示了一个协同抑制作用的EA和UA如图6 (b),意味着三个CI =。

4所示。讨论

PJ以及PE含有可水解的ETs采取行动抑制癌症细胞生长(36]。当摄入,这些资产在肠道迅速水解,导致血液EA上升30分钟后开始消费,持续几个小时8,9]。EA是肠部分转换成其他生物活性代谢物,包括UA由二期代谢酶和人体尿排出后48小时内消费PJ的8,10,11]。在动物模型中,口服后合成UA,高水平的UA被发现在小鼠前列腺组织(14]表明UA对前列腺健康的潜在作用。然而,生物利用度和新陈代谢等代谢产物的石榴,以及在其他水果,依赖于结肠微生物群落,充分理解这些变量是正在进行的调查的主题。等有多个目标的行动在PCa包括NF -κB激活、血管生成和雄激素合成(12,13,37]。因此,类似于其他植物,生物活性并不能从单一等,但多个单宁的产品中发现的天然产品。反过来,这些资产有多种效果。然而,消化和吸收ETs并不是唯一的潜在来源生物活性。与大豆异黄酮和绿茶一样,肠道细菌代谢的代谢产物也证明抗增殖活动在癌细胞38- - - - - -40]。

的可能性之间的协同作用摄取PJ植物化学物质和微生物代谢产物是一个新颖的概念而不是以前探索和启发当下EA的抗增殖行为分析及其主要代谢物UA。

在这项工作中,我们表明,EA和UA抑制androgen-independent PCa细胞增殖以时间和剂量依赖性的方式。然而,UA和EA的作用机制表现为他们调节不同的细胞内分子目标的能力,最终导致不同的影响细胞周期控制和细胞凋亡。G1 / S和G2 / M检查点是关键步骤调节的细胞通过细胞周期和损失这些检查点致癌过程是至关重要的41,42]。我们的实验表明,UA诱导细胞周期阻滞于G2 / M期的主要机制几乎没有对细胞凋亡的影响,同时,除了细胞周期阻滞在S期,EA也表现出显著pro-apoptotic活动在两个细胞系du - 145年更大的影响。事实上,治疗与45 du - 145μ诱导mol / L的EA 72小时%的细胞凋亡(与控制%),而在曲泽凋亡细胞的比例%(与控制%)如图所示的膜联蛋白V / PI双染色。这种差异在凋亡反应这两个细胞系之间可能代表了潜在的分子成分变化showen之前在体外研究证明du - 145和曲泽proapoptotic刺激的反应是不一样的,即使du - 145和曲泽androgen-independent细胞系(43,44]。Skjøth和伊辛认为,PTEN / AKT通路的障碍,加上低p38MAP激酶,发现曲泽细胞,可能是负责观察电阻曲泽细胞凋亡的诱导,而功能性PTEN / AKT通路,如DU145发现,会促进细胞进入细胞凋亡(44]。选定的细胞周期调节蛋白的分子分析表明,UA的影响和在G2 / M和S EA阶段被关联到一个不同的表达细胞周期调控分子动力学,如细胞周期蛋白D1,细胞周期蛋白B1,磷酸化cdc2 tyrosine-15。在G2 / M检查点,cdc2结合细胞周期蛋白B1形成的细胞周期蛋白B1 / cdc2复杂有丝分裂的主要酶活性负责启动(45,46]。然而,复杂的形成是不够的调节有丝分裂的开始。去磷酸化的cdc2 tyrosine-15网站通过cdc25c磷酸酶是一个关键事件激活这个复杂而cdc2磷酸化tyrosine-15诱发其失活(47,48]。在我们的实验中,我们证明了在G2 / M期细胞积累UA治疗48和72小时与持续增加cdc2磷酸化在tyrosine-15强烈建议抑制细胞周期蛋白B1 / cdc2复杂G2期,因此被捕。这也证实了细胞周期蛋白D1蛋白表达,通常堆积在G2期,维护在G1,镇压在S期(49,50]。我们与以前的研究结果一致表明其他饮食植物制剂,如芹黄素和萝卜硫素,抑制细胞周期蛋白B1 / cdc2复杂的通过增加磷酸化cdc2尽管高浓度的细胞周期蛋白B1 (49,50]。另一方面,符合S期细胞的积累,EA减少细胞周期蛋白D1的表达和细胞周期蛋白B1,没有任何证据表明他在tyrosine-15 cdc2磷酸化水平上升。细胞周期蛋白D1,连同其约束力的伙伴到CDK6,促进细胞周期进程(51,52),但最近的研究表明,细胞周期蛋白D1也可能作为转录调制器通过调节一些转录因子的活动到活动的独立(53]。细胞周期蛋白D1的过度表达是一种常见的事件引起的肿瘤细胞,可以通过基因扩增或有缺陷的监管在转译后的级别(54,55]。

因此,细胞周期蛋白D1的重要性在癌症化学预防的一个有吸引力的目标,和几个自然衍生化合物可以诱发肿瘤细胞周期蛋白D1的退化(56]。

这些影响的EA和UA控制细胞周期和细胞凋亡可能因此解释不同的抗增殖活动个人剂量的EA和UA,以及协同效应组合的低浓度的EA和UA曲泽细胞。

事实上,如图6(一),7.5μmol / L的EA结合15μmol / L的UA终于诱导细胞生长抑制的50%,而没有一个剂量的UA感应IC测试₅₀。EA和UA的潜在协同效应的进一步调查,证实了isobolographic CI的分析和计算是小于0.9 ()如图6 (b)。

5。结论

在二期临床试验中,PJ导致倍增时间的延长与复发PCa男性血清PSA升高,符合直接PJ代谢物对PCa细胞生长的影响(3]。

增加血清PSA水平的解释是复杂的潜在来源的PSA从正常细胞和PCa细胞,而崛起的PSA水平在男性超过几个月确诊复发PCa只来自PC细胞,和疾病进展的PSA水平作为指标(57]。人类PCa的复杂性和缺乏明确的生物标志物使初级预防营养干预的研究极其困难的。因此,PCa的预防复发的挑战是初级处理后androgen-independent的抑制肿瘤的生长。然而,由于先进的PCa和多样性的能力,以适应不断变化的环境,针对单一途径不能确保长期影响由于PCa细胞可能激活代理激酶或替代途径。反过来,癌细胞可能产生耐药性靶向抑制剂。因此,抑制多种途径可能是一个令人鼓舞的策略来避免不良反应与目标冗余。

在目前的研究中,我们报告PJ代谢物抑制细胞增殖的PCa细胞通过两个不同的机制的行动,而且他们可能实现协同交互抑制androgen-independent PCa细胞生长。这个合作表明PJ也可能获得的潜在chemopreventive源产品的肠道菌群代谢可以进一步放大特定的生物活性成分的抗增殖作用包含在PJ。此外,我们的研究结果提供额外的洞察的作用机制PJ代谢物的PCa预防复发。

缩写

EA:	鞣花酸
等:	鞣花单宁
PJ:	石榴汁
体育:	石榴提取物
主成分分析:	前列腺癌
UA:	Urolithin。

确认

作者的责任如下:罗伯特Vicinanza进行研究设计,在细胞培养实验中,数据和统计分析和准备手稿;宿州农村张执行化学试剂的制备;苏珊·m·亨宁参加了手稿的准备;大卫·希参与了研究设计的讨论结果,和准备的手稿。作者要感谢Narine Abgarayan为协助细胞培养实验。这项研究的部分支持由“基金会罗马Sapienza。”