文摘
背景。脑缺血是产生脑损伤及相关行为赤字,包括内存赤字和运动障碍。证据表明,EA显著促进神经功能的恢复,从而提高生活的质量。客观的。证据的儿茶酚胺参与人类的神经可塑性。更好地了解多巴胺(DAergic)调制在这个过程很重要。方法。共有72名成年男性Sprague-Dawley (SD)老鼠被分为6组:正常,模型,EA spiperone集团EA + spiperone集团和培高利特。大脑中动脉阻塞(MCAO)模型用于所有6组除正常组。行为评估是由1,3,5,MCAO后7天。脑梗塞面积的百分比也决定MCAO后7天。蛋白质酪氨酸羟化酶(TH)和生长- 43 (GAP-43)荧光双标记在纹状体中执行。结果。在这项研究中,我们发现,EA在穴(GB20)穴位导致显著改进基于行为评估。TTC染色和GAP-43免疫荧光标记结果表明,EA治疗减少缺血损伤和促进神经可塑性与模型组相比。D2R-selective受体激动剂培高利特,显示了类似的结果,但这些结果被D2R-selective拮抗剂逆转,spiperone。我们还发现有更多colocalization GAP-43和表达和TH EA和培高利特组比另一组。结论。这些结果表明,诱导的神经可塑性EA在DAergic D2受体介导的神经元。
1。介绍
脑血管损伤是世界上最普遍的疾病之一,尤其是在发达国家和发展中国家不断提高生活水平,如中国。可以缺血性或出血性中风,但超过80%的中风病例是由脑缺血引起的(1]。
脑缺血是产生脑损伤及相关行为赤字,包括内存赤字和运动障碍。大脑中动脉闭塞据报道发生在10 - 15%的中风患者(2]。主要领域受到中产动脉阻塞大脑皮质,海马和纹状体(3]。内存和电动机赤字与中断相关的血液流向这些领域(4- - - - - -8]。
中风的幸存者往往受到严重影响,长期残疾,包括麻痹和中断的更高的认知功能,如言论自由和内存。一些患者甚至可能有精神疾病,如抑郁症。个人有这样的障碍往往需要大量的长期护理的医疗保健专业人士和家庭。
由于脑血管疾病的高,广泛的社会影响,研究方法有极大的兴趣增加脑血管疾病的治愈率,减少财政负担的政府机构和家庭的影响,并改善缺血性患者的生活质量。
尽管许多神经保护药物已被证明减少梗死体积,提高神经复苏与中风动物模型在基础研究,很少有积极作用在临床试验显示9,10]。目前的治疗有很大差距,我们的期望。目前,没有临床形态表明承诺中风的治疗功效。因此,应该开发新策略建立更好的预防措施和治疗严重的疾病。
中药(中药)成功几个世纪以来一直用于治疗各种疾病,从工业和学术界在中国吸引了越来越多的关注11- - - - - -13]。
EA是基于传统的针灸疗法,结合现代电疗法。针灸对不同的大脑区域是已知的有利影响,和EA一直被视为一种进步对传统针灸。证据表明,EA显著促进神经功能的恢复,从而提高生活质量(14]。
大量研究证实针灸可以有利于从缺血性卒中患者在康复期15]。动物实验(16)也表明,针灸可以加速恢复功能和帮助治疗在脑缺血再灌注脑组织损伤。多巴胺在这一过程中起着重要的作用。
一些关键概念发展有效的康复干预机制中风的异质性以及塑料过程导致神经损伤后功能恢复。
DAergic神经元受到调制由多种因素。的一些因素的内在规定中央DA在身体活动包括TH神经传递,D1, D2受体。
证据的儿茶酚胺参与人类的神经可塑性。地区差异观察多巴胺在突触可塑性的作用17)可以解释为多巴胺含量和多巴胺受体亚型分布的差异,导致不同程度的多巴胺受体激活在LTP或感应。
多巴胺神经元对缺血后神经可塑性很重要。电针刺激(EA)显著促进神经功能的恢复。之前的研究表明,多巴胺D2受体诱导的神经可塑性起着重要的作用。神经功能的恢复与神经可塑性相关,密不可分。鉴于EA的复苏和多巴胺系统的重要性在缺血后神经可塑性,我们假设多巴胺D2受体可能发挥重要作用引起的神经保护EA。反映了疾病的进展和恢复,应结合组织病理学行为观察。更好的理解DAergic调制对理解缺血后神经可塑性的过程很重要。
2。材料和方法
2.1。动物
共有72名成年男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(8 - 9周内,300±20 g,上海实验动物中心,中国科学院上海、中国)生长在4 - 6组每笼受控条件下(23±1°C, 50%±10%相对湿度,12/12人力资源替代光/暗周期,以及食物和水随意)前至少1周的实验。所有动物都小心处理,预防感染,减少压力。
实验协议机构批准的动物保健和使用委员会。所需的最小的动物数量和持续时间的观察获得可靠的数据。
2.2。环境适应和分组
根据随机数字表,老鼠被分为6组:正常,模型,EA spiperone集团,EA + spiperone集团和培高利特集团,每组12个老鼠。大脑中动脉阻塞(MCAO)模型建立了6组除正常组。spiperone D2R拮抗剂,是由腹腔注射D2R拮抗剂组和EA + spiperone组为7天每天一次。培高利特,D2R受体激动剂是由培高利特组腹腔注射7天每天一次。EA是一天一次申请7天在EA组和EA + spiperone组。在这项研究中,spiperone和培高利特的剂量选择的根据我们的初步研究和先前的报告。行为评估进行了1,3,5,MCAO后7天。脑梗塞面积也决定MCAO后7天。时间表的药物治疗、外科手术和行为测试如图1。
2.3。试剂
10%水合氯醛;硫酸庆大霉素注射液;肝素钠溶液1%;D2R受体激动剂培高利特(P8828,σ,美国);D2R拮抗剂spiperone(σ,108587年,美国);GAP-43抗体(G9264,σ,美国);抗体(ab6211 Abcam,美国)。
2.4。仪器
sd - 78双相情感凝结器;G6805-2电针刺激仪器(上海华谊医疗器械厂);YP1201N电子天平(上海精密科学仪器和平衡厂);40 - 90 - 8 c鼠温度控制垫(弗雷德里克·哈,美国);针灸针(0.25毫米直径和13毫米长,苏州针灸供应工厂)。
2.5。感应MCAO大鼠模型
插头线准备了3.0厘米尼龙单丝(4 - 0)缝合(DG,美国)。附近的技巧被加热的火焰,然后用生理盐水洗净,放置在管装满了肝素钠1%解决方案。
建立了大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,根据文献[1]。简单地说,老鼠与水合氯醛麻醉(400毫克/公斤,i.p)。右颈总动脉(CCA)和颈内动脉(ICA)是通过颈部中线切口暴露。pterygopalatine动脉结扎接近它的起源。尼龙长丝缝合是先进的从右侧颈外动脉,通过CCA和ICA 18±0.5毫米的距离阻止大脑中动脉(MCA)的起源,直到一个轻微的抵抗。正确的MCA闭塞了90分钟。之后,脑血流量(CBF)恢复了撤军的尼龙线。直肠温度保持在37°C - 37.5°C和手术后。虚假的组接受相同的手术没有插入的尼龙线18,19]。
2.6。行为评估
研究人员和助理他并没有参与这个实验神经赤字。
2.6.1。神经赤字指数测试
神经功能缺损评分(NFDS)标准(3]:老鼠没有不对称活动,0分;老鼠无法拉伸左侧前肢举起尾巴时,1分;左前肢不能直向下伴随着左肩的绑架,2分;左前肢靠近胸壁,3分;老鼠向左转在自由活动,4点;伴随着明显的左前爪子推回来,5点;老鼠只能向左旋转原点,6分;四肢无法支持体重在左边,和老鼠只能躺在左边,7点。
2.6.2。平衡梁测试(《)
老鼠被放置在一个木制的酒吧300毫米×25毫米。老鼠可以用四脚保持平衡和走过的木酒吧,0点;老鼠不能走过木酒吧,但可以用四脚保持平衡,1分;老鼠的爪子握的木制酒吧或者老鼠的身体摇酒吧,2分;一个肢体从酒吧,3分;两个四肢滑从酒吧,4分;老鼠试图保持他们的平衡但滑,5分;老鼠无法保持平衡,挂在杆上掉下来,6分;老鼠掉下来直接没有试图保持他们的平衡,7分(20.]。
2.6.3。肢体位置测试
在这项研究中,感觉运动整合是由一名调查员评估在7天时间内忽视老鼠的治疗方案。在前肢放置测试(把)、动物轻轻地举行的躯干和慢慢地向桌面,直到背前爪表面很少接触边缘。正常动物迅速把前肢放在桌子上。性能之间的得分0(正常)和10(最大障碍)。同样,后肢放置测试(HPT)评估动物把hindpaw放在一个表的能力应对光刺激,得分-范围(20.,21]。
2.7。EA干预方案
鼠穴的位置(20 g)是类似于人体枕骨下斜方肌和胸锁乳突肌的肌肉之间的空洞。两个不锈钢针头垂直地8毫米插入穴(20 g)和连接到EA工具。参数如下:2赫兹的频率连续波,和电流强度为3.0 mA(示波器检测),有轻微抖动的鼠耳廓。EA持续了20分钟,停了10分钟,然后重新开始另一个20分钟。
2.8。梗死面积评估
神经功能评价后,每组6老鼠深感腹腔麻醉的剂量400毫克/公斤水合氯醛,然后斩首。每个大脑被切成2毫米部分使用矩阵啮齿动物的大脑切片机(遏制- 4000 c;ASI仪器,沃伦,美国MI)。部分是沾染了2、3、去除氯(TTC)(南京绿色合成生化有限公司,南京、江苏、中国)。的百分比为代表的整个大脑梗塞区脑梗死的程度。串行日冕部分准备和浸泡在2% TTC磷酸盐缓冲剂在37°C在黑暗中10分钟。正常脑组织被染成红色,而梗塞组织没有彩色(白色)。浸泡在4%多聚甲醛的部分磷酸缓冲30分钟,按顺序排列,并扫描。红色和白色染色领域是使用计算机彩色多媒体图像分析系统测量的(美国国家卫生研究院图像1.46 J r)。梗死的百分比由方程给出:%梗塞面积=梗塞面积/总面积片×100 (22]。
2.9。双Immunofluorescent标签
与水合氯醛麻醉后(60毫克/公斤体重),每组6大鼠与固定剂含有4%多聚甲醛灌注transcardially 0.1磷酸盐缓冲剂(pH值7.3)。一夜之间,大脑被删除和存储在相同的固定剂。他们以30%蔗糖溶液渗透并将其保持在4°C。标本被迅速冷冻和分段vibratome (30μ低温恒温器部分)。为了研究TH和GAP-43纹状体之间的关系,荧光双标记。在PBS (pH值7.3)清洗后,纹状体部分在室温下培养30分钟在PBS山羊血清稀释10%。他们培养48 h在4°C的抗血清对TH和GAP-43稀释1:1000和1:分别100年PBS。在PBS洗涤后,他们孵化1 h与猪抗血清的混合物在室温下针对小鼠抗血清免疫球蛋白共轭Cy3稀释1:100年,山羊抗血清免疫球蛋白的兔抗血清共轭,异硫氰酸荧光素(FITC)稀释1:100年的PBS。DAPI作为一个额外的核复染色。部分是安装在玻璃幻灯片。图像分析的双immunofluorescent标签是由SP5-AOBS共焦激光扫描显微镜(徕卡微系统,曼海姆,德国)通过20×0.5 40×1.2 NA NA空中目标和油浸目标,使用激光激发在488和561海里。图像与图像J软件组装成蒙太奇(NIH;http://rsb.info.nih.gov/ij/)和Adobe Photoshop 7.0(美国奥多比系统,山景,CA)。阳性细胞的大小分布配置文件决定使用NIH图像软件。感兴趣的soma的神经元是手动了,和他们的大小确定。只有部分的区分核的神经元数(23,24]。
2.10。统计分析
数据表示为平均数±标准差。数据从所有组比较使用单向方差分析其次是事后分析的意义Student-Newman-Keuls多重比较检验。一个概率小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。行为评估
72只老鼠都包含在结果分析,没有任何动物实验过程中迷路。NFDS和《分数可能反映了神经赤字和平衡能力在老鼠大脑功能受损。MCAO之前,NFDS,该剧将所有组的得分0。在实验中,我们观察到神经赤字MCAO后加重。这种情况是稳定的,直到再灌注后24小时。NFDS和《分数1,3,5,7天后再灌注数据所示2和3。有显著差异在NFDS和平衡木测验分数MCAO(之前和之后)。EA和培高利特干预后,NFDS和《分数在EA组和培高利特组改善更明显比模型组()。NFDS和《分数spiperone组恶化再灌注后3天,明显不同于模型组。NFDS和《分数的EA + spiperone组明显改善与spiperone只有组。(数据2和3)。
把一对分数变化类似于NFDS和基础体温的变化出现在1,3,5,7天后建模。把需要和HPT的分数都是0正常组在每一天。神经赤字MCAO后加重。EA和培高利特提高分数较模型组()。spiperone组中把需要减少,HPT分数3天后再灌注;然而,这些分数明显改善在EA + spiperone组。(数据4和5)。
3.2。TTC染色
TTC染色可能反映了老鼠大脑的神经功能缺损。有显著差异在正常和病变区域之间的老鼠模型组()。干预与EA和培高利特后,病变区EA和培高利特组与模型组相比明显降低()。的面积spiperone组病变恶化,显示模型组无显著差异。spiperone和EA组病变的面积减少了,但是没有与spiperone组相比差异显著(表1和数字6和7)。
3.3。双Immunofluorescent标签(GAP-43和TH Immunocolocalization)
如图8,colocalization实验表明TH-positive细胞(绿色)和GAP-43-positive(红色)与纹状体的某些神经元。双免疫染色显示,只有三分之一的TH-positive细胞GAP-43产生,这意味着colocalization只是部分。EA和培高利特导致DAergic GAP-43表达增加神经元缺血而发生之后7天模型组((图)(数据未显示)8、职责)。两组之间没有差异的动物(数据没有显示)。colocalization GAP-43和TH减少spiperone组相比,EA和培高利特集团()。的确,没有GAP-43 / TH double-labeled细胞可见spiperone组。这种效果可以由EA部分逆转。没有发现显著差异在co-localization模型组和EA + spiperone集团()。
显微照片显示神经元在大鼠纹状体与TH双标签后抗血清(绿色)所示,GAP-43抗血清(红色所示)正常的数据8(一)-8(c)、模型数据8(d) -8(f), EA的数字8(g) -8(我),培高利特的人物8(j) -8(左),spiperone数字8(m) -8(o)和EA + spiperone组数据8(p) -8(r)。TH免疫反应性和GAP-43 spiperone治疗后下降而EA或培高利特治疗增加了这些神经元的免疫反应性。有colocalization TH和GAP-43(黄色)在某些神经元的模型图8(f), EA图8(我),培高利特图8(l)和EA + spiperone图8(r)组。比例尺是30μm。
4所示。讨论
虽然两个系统评价表明,没有足够的证据支持索赔,针灸对中风后功能恢复有积极的影响(15,25),特定的临床研究显示,针灸是一种有效的治疗缺血性中风(26]。许多最近的临床试验证实,针刺可以改善平衡功能(27)和痉挛的状态(28在中风患者减少肌肉痉挛状态,改善运动功能与中度或重度慢性中风幸存者肌肉痉挛状态(29日]。Lewith et al。30.)系统地研究和回顾了文献,观察针灸如何影响大脑活动的功能性磁共振成像和正电子发射断层扫描,发现特定和很大程度上可预见的大脑区域的激活和解除激活发生在中国传统针灸疗法应用于某些特定的穴位。此外,46%的中风幸存者在美国使用某种形式的补充和替代医学(CAM)治疗。针灸是最经常使用的凸轮疗法在中风幸存者31日]。然而,针灸的有利影响中风患者需要更多高质量的证据(32]。结合电疗法、EA是由针灸针插入穴位,然后改变电刺激参数,包括刺激频率、电流强度、脉冲宽度、脉冲间隔。因此,EA不仅继承了传统针灸的好处,还结合了电刺激的生理效应(33]。
大量的动物研究表明,EA可以减少神经细胞凋亡,促进细胞增殖,增加脑血流量(CBF),并改善卒中后神经功能(34- - - - - -36]。这些结果为进一步的转化研究提供一些证据。
最近的证据表明,一氧化氮,5 -羟色胺,儿茶酚胺和氨基酸如谷氨酸和γ酸氨基丁酸(GABA)是针灸的神经生物学效应的介质,但目前他们的角色仍知之甚少。因此,获取更多的信息关于针灸的神经生物学机制应该研究在未来的目标19]。
经常有神经保护药物研究在动物和临床研究之间的差异。许多药物在动物实验工作但没有出现在临床研究。在临床前研究中,测定神经保护已经严重依赖评估梗塞体积(而不是功能结果),短期(而非长期)端点,(而不是扩展)时间短为药品监督管理局窗口,和保护脑灰质(而不是灰色和白色物质)。当前的方法已经被评估。新概念在缺血性病理生理学应该鼓励研究人员认为除了缺血的hyperacute阶段和考虑可替换主体疗法利用大脑的神经可塑性和修复能力(37]。缺血后的重组功能领域和方法评估功能的恢复应该弥补上述不足。
功能恢复中风后依靠神经可塑性和神经科学的研究越来越关注研究这个神经可塑性(38]。神经可塑性的能力被定义为神经元和电路修改(1)其功能活动(短期或长期势差/抑郁)和/或(2)他们的突触组织按照活动的变化(39,40]。神经可塑性是出席所有点在一个人的寿命:开发、成年,受伤后,在记忆形成和/或学习,等等。
尽管神经可塑性特别强烈和在开发过程中一个关键过程,它在成年后仍然存在且必要的41]。神经可塑性的维护活动也是必要的损伤后的神经恢复,如中风(42]。
行为检查是主要的手段来确定脑缺血性损伤后早期神经死亡也是一种评估神经功能的恢复造成的神经可塑性。自巴隆et al。43开发他们的评价标准由脑缺血引起的神经赤字在动物,这种神经功能缺损评分已经大大提高,现在广泛应用于估计不同治疗方法的疗效在许多种类的动物44]。我们的研究显示,老鼠快速下降MCAO后行为得分。《和NFDS分数显著提高干预与EA和D2R受体激动剂后,这表明这些化合物促进脑缺血性损伤后神经功能的恢复。把需要和HPT分数变化出现类似于NFDS和《分数变化1,3,5,7天后建模。Spiperone把需要和HPT分数降低再灌注后3天。把需要和spiperone HPT分数提高。EA可以促进神经营养因子的表达(15),有效改善功能性神经损伤,促进大脑的可塑性。研究表明,D1R可以增强会,增加神经损伤(4]。
有必要把行为的观察和组织病理学为了客观地反映疾病的进展和治疗。TTC染色结果表明,EA和D2R受体激动剂可以减少梗死面积。此外,D2R拮抗剂可能增加梗死区。每组的梗死面积与MCAO应该相似,但实际上,有一个显著区别EA组和模型组,类似于培高利特之间的差异组和模型组。这些结果表明,EA和培高利特可能挽救缺血半影和减少梗塞体积通过减少或阻止脑缺血和再灌注后继发损伤。相反,spiperone加剧二次伤害。EA可以部分降低spiperone的有害影响。我们的研究结果表明,D2R扮演着一个重要的角色在EA的injury-reducing效应治疗缺血和再灌注。
除了减少缺血损伤后,DAergic神经元对缺血后神经可塑性很重要。研究表明,内生DA发挥生理作用通过博士和TH。多巴胺受体分为两类:D1-like D2-like。D1受体功能主要是突触后heteroreceptors non-DAergic神经元。相比之下,D2受体有双重角色在DA受体和神经突触后受体(45]。
更好的理解DAergic神经可塑性调制对理解康复过程非常重要,不仅在动物身上,也在人类身上。证据的儿茶酚胺参与人类的可塑性。正如前面所示的,安非他命(儿茶酚胺再摄取阻滞剂)稳定use-dependent运动皮层可塑性,加速中风患者运动功能的恢复,改善学习和巩固语言材料(46- - - - - -48]。最近的研究表明,单剂量左旋多巴的应用极大地提高了汽车在健康受试者记忆的形成以及慢性中风患者(49]。
有协议,多巴胺会增加门冬氨酸电流通过D1受体(50]。D1和门冬氨酸受体都建议有助于LTP的机制诱导营地的积累和PKA的激活51]。
D2受体诱导的神经可塑性的重要性被描述在动物实验52]。此外,它表明D2受体确定纹状体的神经可塑性改变老鼠的方向(53]。在健康的人类,D2拮抗剂、SULP主要D2拮抗剂,氟哌啶醇,54受损的学习。这进一步增加了行为证据的重要性D2受体神经可塑性的人类。
进一步评估DAergic神经元在神经可塑性的作用,细胞定位GAP-43形成的评估在DAergic神经元通过双免疫染色实验(TH和GAP-43 immunohistofluorescence)缺血7天后执行。根据先前的研究,酪氨酸羟化酶被广泛接受为DAergic神经元的标记(55]。GAP-43是calmodulin-binding磷蛋白质中发现越来越多的轴突和生长锥的神经元和轴突再生。GAP-43的表达可能指示存在再生或神经可塑性的过程,如长期势差。GAP-43被认为是一个有用的标记的神经连接和神经可塑性或再生神经纤维(56]。
EA和培高利特导致DAergic GAP-43表达增加神经元。Spiperone下降了。这可以部分逆转spiperone EA的影响。这项研究的结果是额外的证据plasticity-enhancing D2受体的影响活动后缺血和支持的假设对卒中后康复,肾皮质DAergic治疗可以提高塑料重组。事实上,一些研究报告DAergic药物的有益影响,当结合运动学习范例或理疗的卒中后康复(57]。
之前的研究表明,经颅直流电刺激(tDCS)导致调制皮层网络的可塑性,应用弱直接通过头皮表面的电流。DA必须引起这种神经可塑性和它还加强和巩固它51,57]。EA治疗用于我们的研究应用弱直接电流穴位附近的头皮和产生类似的结果。此外,我们的研究结果表明,神经可塑性由EA是由DAergic神经元内D2受体的活性。
总之,目前的研究表明DAergic神经元发挥重要作用在缺血后神经可塑性变化的感应,通过D2-like受体,受体中扮演一个重要的角色在EA治疗缺血。虽然已取得重要进展的理解DAergic神经元功能,识别DAergic神经元在中枢神经系统的神经可塑性机制是决定未来的研究的先决条件和康复策略。有针对性的保护DAergic神经元可以代表小说和令人兴奋的方式加强卒中后neuroregenerative反应(37]。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作得到了中国国家基础研究计划(973计划、2009 cb522900),中国国家自然科学基金(81001547)和上海重点学科建设项目(S30304)。