文摘

因为癌细胞逃避凋亡的能力往往限制了放疗和化疗的疗效,自噬是新兴替代目标,促进细胞死亡。因此,我们怀疑Rottlerin,天然多酚化合物和抗增殖效果在一些细胞类型,可以在MCF-7乳腺癌细胞诱导细胞死亡。化疗的MCF-7细胞株是一个很好的模型/无线电电阻,抗细胞凋亡和自噬,由于半胱天冬酶3基因的删除,高的抗凋亡蛋白bcl - 2的表达,和低表达的自噬Beclin-1蛋白质。的贡献自噬和凋亡的细胞毒性效应Rottlerin被光检测,荧光,通过免疫印迹分析和电子显微镜检查和凋亡和自噬的标记。通过比较caspases-3-deficient ()和caspases-3-transfected MCF-7细胞(),我们发现Rottlerin诱导经典之中,bcl - 2, Beclin 1 -, Akt,和ERK-independent自噬死亡前,caspases-mediated细胞凋亡在后者,不饿死了条件,在没有其他任何治疗。这些发现表明,Rottlerin可以为不同的癌症细胞毒性细胞,细胞凋亡能力和抗细胞凋亡。

1。介绍

某些形式的细胞死亡是生物程序,因此,他们可以从药理学上调制。这些知识刺激这些细胞事件的研究在医学各领域,特别是在抗癌疗法的发展。

目前,程序性细胞死亡(PCD)是指细胞凋亡(I型PCD)和自噬(II型PCD)。

直到最近,细胞凋亡被认为是细胞死亡的主要机制,针对化疗和放射治疗。然而,频繁的放松管制的癌症细胞的凋亡通路构成一个严重的临床问题,而且,作为替代路线的细胞死亡,自噬正成为一个新的抗癌药物的重要目标。

自噬是典型的生理生存机制允许将有毒碎片,错误折叠的蛋白质,和受损的细胞器在双层膜自噬小体,使他们对溶酶体降解。除了细胞垃圾,限制坏死和炎症,大分子的回收也构成一个有效的替代能源压力期间,如饥饿和缺氧。然而,当这种生存策略不成功,可以激活细胞死亡程序。事实上,根据细胞类型和级别的侮辱,自噬可以逐渐转向细胞凋亡和坏死,或同时发生,或导致细胞死亡本身。

因此,矛盾的是,抑制和大规模的刺激自噬能阻碍细胞生存和增加细胞死亡(1]。

在先前的研究中,我们发现Rottlerin,卡玛拉的天然多酚纯化粉(2),可以作为抗肿瘤剂由多种机制,如Akt和ERK-independent MCF-7细胞细胞周期阻滞(3),转录因子的功能抑制NFB在MCF-7 HT-29细胞(4),在HaCaT角化细胞(5和血管生成抑制6]。其他几个研究已经报道的抗癌潜力Rottlerin在不同的人类恶性肿瘤细胞。例如,Rottlerin糖分会让癌细胞凋亡刺激(7- - - - - -9),促进自噬在特定的细胞类型(10- - - - - -12]。

Rottlerin,然而,具有许多生物活性的主要分子的行动目标和机制Rottlerin可以杀死癌细胞是不可预测的13,14]。Rottlerin,事实上,是一个非常多才多艺的物质作为PKC已经使用了几十年δ抑制剂(15),尽管最近它已经表明Rottlerin并不抑制体外激酶,但其他几个酶(16)激活BK钾离子通道(17和作为一个线粒体解偶联剂18]。

当前研究的起点是观察Rottlerin不仅抑制增殖,但也杀死了MCF-7细胞,在不饥饿条件,在没有其他任何治疗。

MCF-7细胞株是一个有趣的模型为研究抗癌药物的功效,因为这个细胞凋亡阈值由于高半胱天冬酶3基因删除(19和bcl - 2超表达20.]。此外,Beclin-1,酵母的哺乳动物直接同源Atg6 / Vps30与一个关键的角色在自噬体的形成21),表示在MFC-7细胞基底水平低(22),因此他们后面也引发了对自噬规范途径。此外,MCF-7细胞转谷氨酰胺酶2 (TG)不足(23),因此它们是耐火的TG 2 downregulation-mediated后自噬被描述在其他癌细胞Rottlerin治疗(10]。

因此,我们想知道是否发生自噬和凋亡的死亡细胞,以及是否一个是前面的其他原因,最终导致细胞死亡。

2。材料和方法

2.1。材料

最低基本培养基(MEM),胎牛血清(的边后卫)、抗生素、二甲亚砜(DMSO), 3-methyladenine (3-MA)和monodansylcadaverine (MDC)来自σ(意大利米兰)。烧瓶和文化板块来自Steroglass(意大利米兰)。Rottlerin是从Calbiochem(意大利米兰)。米/哺乳动物蛋白质提取试剂和停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒来自皮尔斯(意大利米兰)。半胱天冬酶抗体9,半胱天冬酶3、PARP bcl - 2, Beclin-1, LC3 SQSTM1 / p62,β肌动蛋白是细胞信号技术(Celbio、米兰、意大利)。设备和试剂对蛋白质测定和免疫印迹分析来自表达载体(意大利米兰)。硝基和ECL西方墨点法系统来自通用电气医疗集团(意大利米兰)。

2.2。细胞培养条件

细胞,来源于人类乳腺腺癌的胸腔积液,由史Zooprofilattico Sperimentale德拉伦巴蒂大区e戴尔'Emilia-Romagna,(意大利布雷西亚)。细胞被一种礼物从r博士美国Janicke [24]。细胞生长和维持在25厘米²组织培养瓶在空气湿润空气(95% / 5%股份有限公司₂)在MEM含有10%的边后卫37°C, Na-Pyruvate(1毫米),glutamin(2毫米),和抗生素(100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,250 ng / mL两性霉素B)。达到subconfluence后,细胞治疗的表示浓度Rottlerin或车辆(DMSO)在完全培养基含有2.5%的边后卫表示时间。

2.3。Sulforodamine (SRB)测定

SRB Rottlerin的细胞毒性评价的比色测定。这个分析,最初被Skehan et al。25细胞蛋白质含量来确定细胞密度)措施。细胞被播种在96孔板一式三份,培养4 - 6 h在37°C允许依从性,和孵化20μM Rottlerin 24 - 72 h或增加浓度(0.1 -100μ米)的Rottlerin 24 h。治疗后,介质是吸气,细胞被洗两次与PBS和固定的100μL /冷10%三氯乙酸(TCA)。板是在4°C孵化前30分钟轻轻洗四次与自来水删除柠檬酸,生长介质,和死细胞。它允许在空气干燥,然后100年μL 0.4%的w / v SRB溶解在1%乙酸在水被添加到每个30分钟。在染色的最后时期,游离SRB被以1%醋酸洗四次。板又风干了,200μL 10毫米的水三基地(pH值10.5)添加到每个溶解cell-bound染料。盘子被移液混合30分钟上下完全溶解染料。光密度(OD)被记录在一个微型板块分光光度计在550 - 580海里。

2.4。直接细胞计数

细胞被播种在一式三份6-well盘子和培养4 - 6 h在37°C到允许的依从性。孵化后20μM Rottlerin 24 - 72 h或增加浓度(0.1 -100μRottlerin 24 h M),细胞使胰蛋白酶化,在MEM resuspended,彩色混合(1:1)与4%台盼蓝染料溶液(PBS稀释)。细胞排斥台盼蓝的数量(被认为是可行的)计入伯克室后5分钟内染色。

2.5。形态学Study-Fluorescent显微镜

分析凋亡细胞死亡,赫斯特33342染色。染料自由穿过等离子体膜,特别结合t基地区域的DNA,并发出荧光。和板材,培养24-well 18 h和24 h在MEM 2.5%的边后卫有或没有Rottlerin (20μ33342米),是沾染了赫斯特(10μ在PBS g / mL)在黑暗中在室温下30分钟。孵化后,细胞研究激励机制和460海里排放在355 nm倒置荧光显微镜(300年尼康Eclipse TE,德国)。完整的核均匀染色,而凋亡细胞核展览团hypercondensed染色质。形态变化发生在Rottlerin-treated也相差显微镜下观察细胞,使用CCD相机连接到显微镜拍照。

2.6。形态学Study-Transmission电子显微镜(TEM)

TEM被用来确定细胞内超微结构组件的治疗和控制细胞。经过18 h (20μM Rottlerin治疗,细胞,培养在6-well板块,使胰蛋白酶化固定在2.5%戊二醛在PBS, pH值为7.4,在4°C。然后他们被洗四氧化锇在PBS和后缀1.33% 2 h在4°C。在PBS几个洗后,样品在分级醇脱水,转移到甲苯,嵌入在环氧树脂812树脂。树脂被允许在烘箱中聚合为24小时60°C。超薄部分是沾acetate-lead铀酰柠檬酸和评估在飞利浦10厘米透射电子显微镜(飞利浦、埃因霍温、荷兰)。每个独立观察进行了6 - 7次样本。

2.7。检测自噬空泡与Monodansylcadaverine (MDC)

24-well板上培养的细胞为6,18和24小时MEM 2.5%的边后卫有或没有20μM Rottlerin。治疗后,自噬空泡被孵化发现细胞在37°C包含50在PBS为10分钟μ争取民主变革运动,一种广泛使用的专用示踪自噬空泡(26]。孵化后,细胞被洗了四次PBS和立即分析激励机制和525海里排放在380 nm倒置荧光显微镜(300年尼康Eclipse TE,德国)。

2.8。bcl - 2沉默和超表达

细胞转染使用霓虹灯转染系统(生活技术,100μL, 1100 V 30 ms 2脉冲,转染效率~ 70%、可行性与40 ~ 80%)纳米bcl - 2核(σ,EHU135281)或1μ克pcDNA3 bcl - 2表达载体(山本的礼物等。27])和播种6-well盘子。转染24小时后,细胞治疗Rottlerin (1, 10μ米)或车辆(DMSO)为进一步24小时为免疫印迹分析和处理。为了更好的揭示bcl - 2的最终角色Rottlerin自噬作用,低浓度的Rottlerin。

2.9。蛋白质的提取

细胞培养在25厘米²培养瓶,在大约70 - 80%的融合,服用20μM Rottlerin不同次为37°C。治疗后,细胞用PBS洗净,然后用0.1毫升的m /哺乳动物细胞溶解蛋白质提取试剂含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的鸡尾酒。震动了10分钟后,溶解产物收集和转移到1.5毫升离心管。在14000×g细胞碎片被离心分离颗粒状,持续15分钟。上层清液被转移到新管,蛋白质浓度测定用Bio-Rad蛋白检测试剂。

2.10。免疫印迹分析

细胞提取物,每个包含40μ克总蛋白质,是解决预制SDS-polyacrylamide梯度凝胶4% - -20%。在硝化纤维膜蛋白是electrotransferred被封锁了5%脱脂奶粉在TBS含有0.1%渐变20 1 h在室温下。然后,探讨了这些墨迹一夜之间主要的多克隆抗体在4°C。

洗后,辣根peroxidase-conjugated添加免疫球蛋白是在室温下为1.5 h。β肌动蛋白被用作加载控制。这些墨迹是由ECL胶卷暴露。免疫反应性的乐队是由图像量化分析软件。

2.11。统计分析

所有实验至少重复三次。数据被表示为±SD方法。Rottlerin-treated和控制细胞之间的差异进行了分析使用学生的测试,的概率被认为是有意义的。

3所示。结果

3.1。Rottlerin杀死MCF-7^{3 def}细胞

因为我们之前发现Rottlerin干涉3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT)可行性测试(28),在当前的研究中,Rottlerin细胞毒性细胞被国储局分析评估。如图1(一),24小时的治疗0.1 -100μM Rottlerin诱导细胞毒性剂量依赖性的IC50大约20μm .如图1 (b),20μRottlerin治疗24 - 72 h,时间依赖性,诱导细胞毒性,也降低了初始种子细胞的数量(图1 (c)),证明降低多孔性在Rottlerin-treated文化中,除了生长抑制,细胞死亡。

这些结果已经证实通过台盼蓝排斥试验和直接的细胞计数在伯克室(数字1 (d)- - - - - -1 (e))。

3.2。Rottlerin MCF-7不诱导细胞凋亡^{3 def}细胞

接下来,我们调查是否Rottlerin发生凋亡。作为显示在图2(一个)免疫印迹分析显示,尽管略有减少凋亡蛋白bcl - 2,没有观察到激活半胱天冬酶9 24小时的治疗。虽然聚的乳沟ADP-ribose聚合酶(PARP)后发生18 h和24小时的治疗,与赫斯特33342年的核染色(图2 (b)),在同一时间点,没有透露任何典型的凋亡核变化。然而,使用TEM超微结构分析显示一些核形态改变,如染色质凝集和边缘化细胞治疗Rottlerin 24 h(图3 (c)),表明晚发型(caspase-3独立)细胞凋亡可能导致细胞死亡。然而,由于Rottlerin造成的损失大约50%的细胞在24 h,我们得出的结论是,大多数死于非凋亡机制。

3.3。在MCF-7 Rottlerin诱发自噬^{3 def}细胞

接下来,我们解决问题是否Rottlerin会诱导自噬在同一个细胞。如数据所示3(一个)和3 (b)细胞与甲苯胺蓝染色和相衬显微镜显示大量的存在细胞质液泡Rottlerin 18 - 24 h后治疗。TEM的超微结构分析证实了大液泡,堆积在细胞质的存在(图24小时后治疗3 (c))。评估细胞vacuolisation是否引用自噬,我们通过MDC染色检测自噬体的形成。如图4(一)在荧光显微镜下,液泡沾MDC出现点的结构分布在细胞质中,随着时间的增加,从6到24 h后Rottlerin治疗,从而确认其自噬的本性。为了进一步证实这一结果,我们检查如果有水平的提高autophagosomes-associated lipidated LC3-II形式,特定的自噬在哺乳动物细胞标记29日]。免疫印迹分析细胞溶解产物进行了使用一个anti-LC3抗体检测LC3-I和LC3-II。如图4 (b)在控制细胞,我们发现存在LC3-I和LC3-II乐队,导致的微LC3-II / LC3-I比率约为0.2,可能代表基准面存在于静息细胞的自噬。Rottlerin治疗后,LC3-II / LC3-I比率增加非常迅速(1 h)达到18 h,随着时间的推移,持续(约4倍高于控制后24 h)。这种暂时的行为表明,自噬发生前和独立于凋亡过程。为了排除LC3的积累是由于抑制,而不是诱导自噬,我们测量了sequestosome-1 (SQSTM1) / p62蛋白质,自噬流量的一个标志。如图4 (c)免疫印迹分析显示,已故的自噬过程中退化(18 - 24 h)。

3.4。Rottlerin诱发Beclin-1-Independent自噬在MCF-7死亡^{3 def}细胞

随着Beclin-1自噬体形成的一个关键角色,协调其他自噬蛋白的定位preautophagosomal膜,我们评估其参与Rottlerin-induced自噬。如图5(一个),本研究中使用的MCF-7细胞系表达Beclin-1在非常低的水平,就像许多其他MCF-7积累(22),最重要的是,Rottlerin不诱导细胞发生自噬的表达死亡。此外,尽管Rottlerin bcl - 2表达下调(图2bcl - 2),无论是沉默还是过度导致改变Rottlerin-increased LC3 I / II比率(图5 (b))。因此,监管bcl - 2是一个并行效果,也没有在Rottlerin-induced自噬功能的作用。符合Beclin-1独立性,3-MA(5毫米),抑制了第三类PI3K (Vps34) / Beclin-1复杂,因此autophagosom形成(30.],并不影响LC3II代两个单独使用时,结合Rottlerin 6 h(图5 (c))。

3.5。在MCF-7 Reexpression半胱天冬酶3恢复凋亡能力

我们初步评估了Rottlerin细胞毒性。如图6(一),20μM Rottlerin治疗18和24小时,时间依赖性,降低种子细胞的初始数量约80和65%,分别。所显示的赫斯特33342染色(图6 (c)),大多数Rottlerin-treated细胞显示核团凝聚染色质,表明apoptosis-like变化。在相差显微镜下,Rottlerin-treated显示额外的凋亡细胞的改变,比如细胞舍入和收缩(图6 (b))。提供进一步的证据,Rottlerin引发的凋亡途径细胞,关键apoptosis-related蛋白质的表达进行了评估。如图6 (d),还存在激活9和3和PARP乳沟18至24小时后观察Rottlerin治疗,表明Rottlerin引发了内在凋亡通路细胞。此外,bcl - 2蛋白水平的下降被发现在18和24小时的时间点,可能由于Rottlerin抑制NFb .此外,适度增加LC3-II Rottlerin曝光后观察,表明弱自噬的发生程序还在细胞。

4所示。讨论

有越来越多的证据表明,大多数癌症的一个主要潜在缺陷是正常的细胞凋亡的抑制作用。抗肿瘤细胞凋亡导致更高的生存能力和提高恶性肿瘤的潜力,允许突变积累,有利于转移,癌细胞呈现耐火材料治疗和宿主防御。

超表达生存的分子的原因往往是一种内在的化学抵抗多种化疗药物(31日]。NFκB通常是在癌症、转录本构的关键分子参与细胞周期控制,和细胞凋亡促进增殖和恶性细胞的生存32]。NFκB确实是一个转录因子对细胞周期蛋白D1,生存素,IAP1, IAP2 XIAP、bcl - 2,和许多其他监管分子(33]。

之前我们已经证明了MCF-7 Rottlerin强烈抑制乳腺癌细胞增殖,通过一个涉及NF的机制κ(差别B抑制和细胞周期蛋白D1对这些3]。

自从NFκB是一个很好的抗癌治疗的目标也由Rottlerin及其抑制已经记载了人类结肠腺癌HT29细胞(4),预计Rottlerin打断癌症恶化的过程在不同层次和不同的细胞。

我们,首先,证实Rottlerin,除了逮捕增长,实际上MCF-7细胞死亡。虽然这个细胞系是抗细胞凋亡,由于还存在3不足和bcl - 2超表达,Rottlerin展出时间和剂量依赖性细胞毒性效应的IC50大约20μ24小时后。

下一步是评估凋亡的发生死亡,最终caspases-3-independent。尽管适度bcl - 2蛋白表达下降,与NF一致κB抑制,没有明显的细胞凋亡被发现的迹象细胞。事实上,半胱天冬酶9解理完全缺席,赫斯特33342年染色后未能发现核形态变化Rottlerin曝光只要24小时。然而,在18 h和24小时时间点,85 KDa PARP片段被免疫印迹检测到,可能通过激活半胱天冬酶生成7,虽然无法处理半胱天冬酶9,从而激活半胱天冬酶级联传播,据报道有效打通PARP [34]。此外,超微结构分析显示改变染色质结构24 h后,建议后期出现细胞凋亡可能发生在少数(约一半)幸存下来细胞。

另一方面,垂死的细胞显示细胞质液泡的早期和广泛的积累随着时间的推移,自噬的标志,Rottlerin后治疗。autophagosomal性质的证据证实了MDC LC3标签和西方墨点法,以及自噬清除证实了西方墨点法SQSTM1 / p62。

bcl - 2蛋白,除了其抗凋亡作用,也是防止细胞发生自噬,通过抑制autophagy-promoting蛋白Beclin-1 [35]。一致,一项研究报道,bcl - 2沉默siRNA足以诱发MCF-7细胞自噬死亡(20.]。然而,我们发现Rottlerin-induced自噬不是由于Beclin-1脱抑制,差别bcl - 2后对这些因为Beclin-1 Rottlerin表示在显著水平和诱导。此外,bcl - 2沉默或超表达并不影响发生的自噬对Rottlerin甚至药物浓度较低(1和10μ米)。

这些结果完全符合的绝对不存在3-MA Rottlerin-induced转换的LC-3I LC-3II,虽然间接证实Beclin-1不扮演任何角色。

此外,虽然Rottlerin最近报道促进自噬通过抑制PI3K / Akt / mTOR通路在胰腺癌干细胞(36],我们排除可能的负调节一种蛋白激酶(ERK)在Rottlerin-induced自噬活动,因为我们之前研究Rottlerin-treated MCF-7未能透露任何细胞激酶的磷酸化状态的变化(3]。

总的来说,这些发现表明,一个不寻常的在MCF-7细胞自噬通路由Rottlerin触发。

为了澄清是否自噬诱导是唯一策略Rottlerin采用杀死MCF-7细胞,我们接触到Rottlerin MCF-7细胞系,还存在稳定转染3。在这种情况下,所有在场凋亡特征;事实上,乳沟半胱天冬酶3、半胱天冬酶9和PARP细胞圆缩,核染色质凝结发生Rottlerin 18 - 24 h后治疗。根据从适度增加LC3II 3-24 h时间进程,疲软的程序也激活自噬细胞,可能为生存和/或凋亡延迟的目的。这也是很惊人的发现提出的降低Rottlerin-treated细胞死亡率细胞。

我们的结果与先前的部分协议之间的比较研究和Fenretinide细胞,视黄酸的合成衍生物,引发自噬在前和细胞凋亡在后者,因此确认,根据其caspase-3地位,MCF-7细胞可能II型和I型纤毛运动之间切换37]。然而,Fenretinide强烈不同于Rottlerin自噬诱导机制。事实上,这种药物,与Rottlerin不同,引发了规范自噬死亡计划通过增加Beclin-1表达式。

相反地,另一个之间的比较研究和细胞已经表明,白藜芦醇的天然多酚诱导自噬在Beclin-1-silenced去世细胞,这表明Rottlerin和白藜芦醇绕过Beclin-1激活自噬在MCF-7细胞的活动(38]。

5。结论

我们已经表明,Rottlerin能够触发caspase-dependent或自噬,caspase-independent MCF-7细胞死亡的细胞,根据功能的可用性半胱天冬酶3。

而凋亡过程似乎遵循古典线粒体途径,自噬的死亡,被bcl - 2, Beclin-1,引发的一种蛋白激酶ERK独立,似乎不在经典里的信号级联。研究正在进行中重建事件链从现象学的分子机制。

然而,目前的研究结果表明,Rottlerin作为多目标的概念抗癌药物可能是广义MCF-7细胞之外,其他类型的癌症细胞,细胞凋亡能力和抗细胞凋亡。然而,对于一个以证据为基础的应用程序,进一步的临床前研究癌细胞具有不同背景的强烈要求。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢博士r ., Janicke请提供caspases-3稳定转染MCF-7细胞,山本k博士bcl - 2质粒的礼物,和c . Aldinucci博士g . Belmonte和d·弗兰的技术支持。这项工作是一个正在进行的研究项目的一部分“Rottlerin重新定位:从民间医学在癌症治疗现代观点,”支持的史Toscano肿瘤(ITT) Regione托斯卡尼(2010年格兰特),通过授予IGA MZD NT13573-4/2012, GA CR P301/12 / P407项目FNUSA-ICRC(没有。欧洲区域发展基金CZ.1.05/1.1.00/02.0123)。