黄芪IV在大鼠角质形成细胞中下调β-catenin，以抵抗LiCl诱导的增殖和迁移

摘要

再上皮化是伤口愈合的关键步骤。中医,，黄芪膜几百年来，Bge一直被用于治疗多种溃疡性伤口。最近的研究证实该药物的活性化合物为黄芪甲苷(astragaloside IV, as -IV)，但其对角质形成细胞作用的分子机制尚不清楚。在这项研究中，我们使用了体外用氯化锂(LiCl)诱导培养的小鼠角化细胞建立溃疡样创面模型，研究AS-IV治疗的效果。用MTS/PMS比色法检测其对细胞增殖的影响，用创面愈合划痕实验检测其对细胞迁移的影响，用流式细胞仪检测其对细胞周期的影响，用免疫印迹法和免疫荧光法检测其对蛋白表达的影响。LiCl强烈抑制细胞增殖和迁移，上调β-catenin表达，增殖细胞核抗原(PCNA)表达下调。AS-IV处理减弱了对增殖和迁移的抑制，显著降低了增强β-catenin表达，PCNA和β微管蛋白的表达。因此，AS-IV介导小鼠角质形成细胞增殖和迁移通过调节WNT信号通路。下调β-catenin增加角质形成细胞迁移和增殖是AS-IV促进溃疡创面愈合的机制之一。

1.介绍

所有动物的皮肤为病原体和环境毒素的进入提供了一个保护屏障。皮肤细胞还包含丰富的分子基础结构，涉及免疫系统过程，进一步防御疾病或对底层器官的伤害。因此，皮肤创伤不仅影响皮肤稳态，而且是一种系统性威胁;因此，伤口愈合过程对一般的健康和幸福至关重要[1］.伤口愈合过程是复杂的，尚未完全理解;然而，已知许多潜在的条件，例如糖尿病，癌症和血管疾病，可以延长或阻止该过程。在这些情况下，由简单的事故或跌倒引起的正常创伤可以成为溃疡性的慢性伤口，显着影响一个人的生活质量和增加死亡风险。

几个世纪以来，世界的医生已经找出了将促进和加速伤口愈合的方法和治疗剂[2］.通常，皮肤伤口愈合过程可分为三个重叠，但不同的阶段：炎症期，增殖相（新生发生，组织形成，再皮细胞化）和组织重塑阶段[3.- - - - - -5］.再上皮化被认为是伤口愈合的关键一步，这一过程的损伤已被证明会导致慢性伤口的发展[6］.

传统中医，黄芪膜长期以来，Bge一直被用于治疗溃疡性伤口。目前，该药物的主要活性化合物为黄芪甲苷IV (AS-IV)，为3-O-β-D-xylopyranosyl-6-O -β- d -glucopyrano - cycloastragenol(化学结构见图1)，得到纯化。对AS-IV生物学特性的研究表明，AS-IV具有强烈的抗炎活性，包括抑制NF-κB活化和下调粘附分子表达[7］.此外，许多其他药理活性已被证实，包括抗糖尿病和抗氧化活性[8］.然而，AS-IV促进伤口愈合的确切机制仍有待阐明。为了开发这种中草药作为善意治疗剂治疗异常伤口愈合，有必要获得一个涉及细胞和分子机制的详细了解。

众所周知，激活β-catenin/c-myc途径可抑制角质形成细胞迁移和分化，从而损害创面愈合[9］.先前的胚胎学模型研究表明，给药氯化锂(LiCl)可以诱导类似Wnt/的信号通路β连环蛋白激活。具体来说，LiCl治疗抑制GSK-3β通过诱导Ser-9磷酸化活性[10，进而稳定游离胞质β连环蛋白。因此，体外用LICL治疗培养的角质形成细胞允许受阻伤伤愈合的分子过程的受控实验分析。

激活β-Catenin和C-Myc已在慢性伤口的表皮中临床检测。因此，已经提出了这些分子可以用作愈合受损的标记，并且可以代表治疗干预的有用靶标[9］.在之前的一项研究中，我们证明了糖尿病性皮肤溃疡可以通过中药鸡尾酒有效地治疗，包括黄芪膜(费)。我们假设其作用机制可能涉及抑制Wnt信号通路[11］.本研究旨在调查AS-IV对Wnt/的潜在影响βlicl诱导下原代角质形成细胞的-连环蛋白信号。这些发现揭示了AS-IV在皮肤创面愈合中的积极作用β-catenin表达。

2.材料和方法

2.1。化学品和试剂

AS-IV(纯度99.2%)购自中华人民共和国上海国家药品和生物制品控制研究所，在室温DMSO中以20 mg/mL的原液浓度完全溶解。DAPI购自罗氏诊断公司(Indianapolis, IN, USA)。溴脱氧尿苷(BrdU)检测试剂盒购自BD Biosciences公司(San Diego, CA, USA)。LiC1 (pro analysis grade)来自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。抗体β-catenin和GAPDH购自细胞信号技术（贝弗利，MA，USA）。豚鼠抗K14购自RDI-FITZGERALD（奥克林，美国NJ奥克林）。抗体反对β-Tubulin购自Sigma-Aldrich。免疫荧光二抗，Alexa Fluor 488-缀合（绿色）和Alexa Fluor 594缀合（红色）来自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。除非另有说明，否则胎牛血清（FCS）和其他细胞培养试剂来自Gibco（Invitrogen）。

2.2。细胞培养

原代小鼠角质形成细胞由新生小鼠制备，如前所述[12]，并在37°C、5% CO的环境中培养₂在Cnt-07培养基中加入适当的补品(瑞士伯尔尼Cellntec)。

２.３.细胞增殖(MTS/PMS)和BrdU掺入试验

使用MTS / PMS方法测定细胞增殖。简而言之，细胞（1×10^3.96孔培养板(Nunclon;Nunc Roskide、丹麦)。过夜孵育后，细胞在没有或存在LiCl和AS-IV的情况下进行处理。各浓度作为单个处理组，对照组只含DMSO。每组6口重复井。培养板孵育0、24、48、72 h后，100μ每孔加入MTS/PMS工作液L，再继续孵育角质形成细胞4 h。吸光度(一个使用分光光度计(Beckman Coulter;迈阿密，佛罗里达，美国)490海里。AS-IV对角质形成细胞生长抑制率的影响按以下公式计算:%抑制率= [A₄₉₀治疗组的价值]/[（A₄₉₀对照组值)×(100%)]。50%抑制浓度(IC₅₀)根据至少三个独立实验的剂量反应数据确定。每天使用Coulter计数器（Beckman Coulter-Z2）和台盼蓝染料排除试验测定细胞数量和细胞活力。对于5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入试验，如上所述接种细胞并进行血清饥饿。用不同浓度的PBS或LiCl处理12小时后 h在含10%FBS的培养基中，细胞与BrdU再孵育2小时 H使用基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的显色试剂盒（BD Biosciences；（美国加利福尼亚州圣地亚哥）根据制造商提供的协议。

2.4. 蛋白质印迹分析

培养细胞的裂解液如前所述制备[13］.如前所述，全细胞蛋白提取物通过SDS-PAGE分离并电转移到膜上进行特异性抗体检测[14］.

2.5。在体外划痕测定

当小鼠角质形成细胞达到100%融合时，将细胞转移到基础KBM培养基(Life Technologies, Inc.， Grand Island, NY, USA)中并孵育24小时。然后用8μG / ml丝霉素（ICN，Irvine，CA，USA）为1小时，然后用基础介质洗涤。施用糖原合酶激酶3（GSK3）的抑制剂，用于活化WNT信号传导。由于LiCl还可以有效地阻断EGF刺激的迁移，因此使用EGF诱导的细胞迁移作为阳性对照。如前所述在处理过的细胞培养物中进行划痕，拍摄培养物。然后，混合物20 μmol/L LiCl加或不加25 ng/mL EGF和80μ将G / ml AS-IV加入到培养物中并培养24小时，48小时或72小时。细胞被重拍，并且对预处理图像的比较用于定量地确定如前所述的细胞迁移程度。简而言之，测量由移动到刮擦伤口区域的电池覆盖的距离。针对每个实验条件进行了三十次测量。每个条件和每个时间点分析三张图像。

2.6。流式细胞术用于细胞周期分析

细胞按1.5 × 10的密度电镀⁶培养24 h后，将培养液改为无血清培养液。饥饿16-18 h后，G细胞同步化₀细胞周期的一个阶段。然后将不同的实验试剂添加到无血清培养基中，并孵育到指定的时间。单元格(1 × 10⁶通过胰蛋白酶化收获，在冷PBS中洗涤两次，并在冰上固定在70％的醇中30分钟。在3次冷PBS洗涤后，将细胞重悬于1ml克里希南染色溶液中[15然后在4°C的温度下过夜。第二天，细胞通过96微米孔径的尼龙网过滤，并用流式细胞仪(BD Biosciences)分析总共10000个染色细胞核。使用配套的ModFit分析程序(BD Biosciences)制作DNA直方图，该程序绘制并统计拟合G₀-G₁S和G₂- m阶段。每个条件重复三次。

2.7。免疫荧光染色

将细胞在8孔室载玻片（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Ma，USA）上培养并用不同浓度的AS-IV进行治疗24小时。然后用4％多聚甲醛固定细胞，用0.3％Triton X-100渗透化，并在百事事术中消化（实验室视觉，Thermo Fishific）。通过在10％正常的山羊血清中孵育细胞加入0.1％NP-40，载入粗蛋白质提取物中的非特异性结合。通过与初生孵育过夜来进行特异性蛋白质的检测。Alexa Fluor 488-或594缀合的二抗用于免疫荧光染色，用Leica SP2共聚焦显微镜（Deerfield，IL，USA）获得图像。

2.8。统计分析

除非另有说明，数据以至少三个独立实验的平均值±SD表示。使用Student’s进行统计分析t -测试，以及价值被认为意义重大。

3.结果

3．1.AS-IV可减弱licl诱导的角朊菌生长抑制

为了研究Wnt信号通路在角质形成细胞中的正常功能，我们使用LiCl激活Wnt/β连环蛋白信号通路。采用MTS/PMS法和DNA合成过程中BrdU掺入量测定，检测LiCl对角质形成细胞增殖的影响。如图所示2(一个)用不同浓度(0~40.0 mM/L)的LiCl处理角质形成细胞24、48、72 h。对照组是亚融合和同步角质形成细胞单独用DMSO溶剂处理指定的时间。与对照组相比，licl处理的角质形成细胞表现出一致的生长迟缓。半数最大(50%)抑制浓度(IC₅₀)值(图2(一个)分别为25.85±5.03、16.16±0.95和12.35±1.38 mM。低浓度的LiCl (<5 mM)不能抑制角质形成细胞的生长。高浓度的LiCl (>5 mM)对角质形成细胞增殖产生显著的剂量依赖性抑制作用(图)2(一个)、圆)。BrdU掺入实验也显示BrdU阳性细胞对不同剂量LiCl的反应呈浓度依赖性下降。如图所示3.（a），LICL治疗后的BRDU阳性细胞10毫米（57.91±6.57％），20mm（23.48±3.19％）和40毫米（9.67±2.45％）明显小于那些DMSO治疗对照组（71.81±6.79％;全部)．在所有剂量下，licl处理均不影响细胞活力(图)4 (c))．这些数据明确地证实了LiCl能够以浓度和时间依赖性的方式对角质形成细胞产生有效的生长抑制作用。这些结果也表明，氯化锂处理可抑制角质形成细胞增殖而不影响其生存能力。

探讨AS-IV在角质形成细胞过表达中的作用β-catenin，我们用AS-IV和LiCl孵育细胞72 h。如图所示2（c）和2（d）， as - iv处理可减弱LiCl对细胞增殖的抑制作用，证明LiCl组490 nm处的光密度(OD)明显高于DMSO对照组()．同样，BrdU试验显示，AS-IV处理可提高阳性细胞的百分比(从23.48%提高到31.05%;数字3.（e） ），表明AS-IV能够促进DNA合成。

3.2。LiCl诱导角质形成细胞的衰老变化

LiCl治疗还导致角质形成细胞的明显形态改变，包括体积增大、扩散和扁平外观。在licl处理的培养中未观察到凋亡特征的圆形细胞(图)2 (b)). 使用细胞活力测定法，我们测量了不同剂量氯化锂（从10 毫米至40毫米 48分钟 H如图所示4，以20%的剂量进行氯化锂处理 毫米和40毫米 mM导致细胞尺寸增大（图4(一)，红色箭头)，表明高浓度的LiCl可改变角质形成细胞的形态。经licl处理的角质形成细胞平均直径更大(10 mM, 16.45±1.36)μM20 毫米，16.59±0.36 μm;40 mM, 17.72±1.01μM)明显高于对照组(15.23±0.97)μ米)。

３．３．AS-IV减弱licl诱导的角质形成细胞S期细胞周期阻滞

LiCl诱导的生长抑制可能是由细胞周期效应产生的。因此，通过使用荧光激活的细胞分选测量克里希勒染色的细胞的DNA含量来确定LiCl处理和对照细胞的细胞周期分布。如图所示5，LiCL处理的细胞在S相中表现出比对照细胞的较高比例的细胞。生成直方图以可视化不同LICL浓度产生的细胞周期分布百分比（图5（b）)和不同的曝光时间(图5（c）)．有趣的是，当licl处理的细胞暴露于AS-IV时，诱导的细胞周期阻滞在S期显著减弱。具体来说，经licl处理的角质形成细胞中S期细胞的百分比在AS-IV暴露时从48.81±7.43下降到35.28±2.14 ()．

3.4。AS-IV衰减LiCl诱导的过度表达β连环蛋白在角化细胞

我们研究了AS-IV对β-采用两种标准检测方法，即免疫荧光染色和westernblot分析，检测原代角质形成细胞中连环蛋白的表达。与预期一样，表皮生长因子孵育的角质形成细胞显示正常β-catenin的膜表达，而LiCl处理的细胞表现出明显的核表达β连环蛋白染色。LiCl-induced核β-catenin因as - iv暴露而减弱，证据是显著减少β-catenin核染色（图6(一))．类似地，Western印迹分析表明LiCL处理的角质形成细胞表达超过5倍β-连环蛋白比对照细胞多。此外，AS-IV暴露在licl处理的细胞中导致的细胞数量减少了近3倍β-对照组中的连环蛋白（图6 (b)此外，与DMSO对照相比，LiCl下调了50%的PCNA，而AS-IV上调了80%(图)6 (c))．

3．5．AS-IV可减弱licl诱导的角化细胞迁移抑制作用

检测licl是否诱导过表达β-连环蛋白可影响创面愈合过程中角质形成细胞的迁移体外伤口划痕试验。用LiCl、LiCl和EGF(阳性对照)和/或AS-IV孵育角质形成细胞72 h。观察角质形成细胞向划痕区域迁移并量化距离。如图所示7而LiCl和AS-IV促进了60%的迁移，可能是通过下调活化的细胞β连环蛋白。

3.6。AS-IV衰减LICL引起的下调β微管蛋白

微管蛋白是细胞迁移的关键中介[16］.以确定氯化锂处理是否受影响β-微管蛋白表达，我们用LiCl单独或AS-IV孵育原代角质形成细胞。的变化β-微管蛋白表达水平通过免疫荧光法进行评估，然后用aβ-微管蛋白特异性抗体（图8(一个))，免疫印迹法(图8（c）)．β-微管蛋白在大多数未处理的原代角质形成细胞中表达，但licl处理减少β微管蛋白的表达。如图所示8（b），β-微管蛋白仅在15%的LiCl处理的细胞中表达，而在27%的LiCl和AS-IV处理的细胞中表达。在dmso处理的对照培养中，80%的细胞表达β微管蛋白。总之，我们的研究结果表明，LiCl能够引起β-微管蛋白，通过AS-IV治疗至少部分溶解。因此,过度的β-连环蛋白在伤口愈合过程中可能通过减少而损害愈合β-微管蛋白表达，随后抑制角质形成细胞迁移。由于AS-IV可以减弱licl诱导的下调β-微管蛋白，可能是一种有希望的治疗药物，以改善迁移和促进伤口愈合。

4.讨论

在发达国家，0.2%至1%的人口受到慢性静脉溃疡的影响[17］.在中国，有报道约1.5%-3.0%的外科住院患者因慢性难治性伤口住院。无法愈合的慢性伤口不仅降低了患者的生活质量，增加了进一步感染和死亡的风险，而且还对医疗保健系统造成了巨大的经济负担。本研究描述的实验表明，AS-IV能够通过调节细胞迁移和细胞增殖来修复慢性皮肤创面。

在许多已知的影响伤口愈合的生物分子中，Wnt信号被认为是至关重要的，因为它介导了整个生命周期的皮肤发育，并可以对伤口愈合过程产生积极和消极的影响。LiCl是一种特征明确的GSK3抑制剂，可以有效激活Wnt信号通路体外［10］.大量研究表明，氯化锂对不同类型的细胞具有显著不同的作用。例如，LiCl被证明可以通过激活Wnt/来刺激培养红细胞的增殖β-连环蛋白信号通路[18］.此外，licl可刺激MCF-7人乳腺癌细胞增殖，并引起磷酸肌醇代谢物表达的显著变化[19］.相反，通过破坏E2F-DNA相互作用和随后的E2F介导的基因表达来施用LiCl抑制前列腺癌细胞增殖[20.］.LiCl还通过诱导G2/M细胞周期阻滞抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖[21］.Mao等报道LiCl处理可诱导G₂/M在不影响原代牛主动脉内皮细胞活力的情况下[22］.这些研究表明，在不同的环境下，LiCl可以介导多种细胞功能。在这里，我们证明了LiCl可以诱导细胞增殖和迁移抑制，并导致小鼠原代角质形成细胞S期阻滞(图)5)．

WNT信号通路激活在伤口愈合中的重要作用得到了很好的认可[23，24］.众所周知，Wnt信号通路通过规范或调节多种细胞功能，包括细胞命运、极性和分化β-连环蛋白稳定途径和/或平面细胞极性或非正则途径[25］.此外，Wnt信号曾被证明介导成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移[26］.表皮的主要细胞成分，表皮的主要细胞组分在伤口愈合过程中具有几个关键作用。出现在慢性伤口的非热损伤边缘的角蛋白细胞已显示过表达β-连环蛋白，被认为与正常健康的角质形成细胞不同。

在正常伤口愈合过程中，再上皮化阶段包括在伤口表面覆盖一层上皮，这涉及表皮角质形成细胞的分化、增殖和迁移。研究表明β-连环蛋白和c-myc通过抑制角质形成细胞迁移和改变其分化，从而促进受损伤口愈合。

本实验室前期研究也表明含有黄芪成分的中药复方可能对Wnt信号通路有调节作用[11］.然而，潜在的机制仍不明确。AS-IV是著名中草药黄芪的主要植物化学成分，黄芪是从黄芪干根中提取的，是中医中广泛应用的治疗糖尿病和炎症的中草药[7］.因此，本研究的目的是确定AS-IV对创面愈合过程中角质形成细胞增殖和迁移的影响。

在这份报告中，我们证明了用一种GSK-3抑制剂LiCl治疗原发性角质形成细胞β和Wnt信号通路的激活剂，诱导稳定和核易位β-Catenin与细胞增殖和迁移抑制相关。此外，LiCl治疗在S期中显着诱导细胞周期停滞。MTS / PMS和细胞活力测定显示LiCl诱导细胞生长迟缓而不影响细胞活力;似乎这种效果是诱导衰老的表型的结果。SAS-IV治疗LiCl诱导的角质形成细胞导致S相中减毒的生长延迟和减少量的细胞。这些新发现导致我们假设这一点β-连环蛋白在受损创面愈合过程中过度表达可能是角化细胞增殖和迁移功能失调的原因。

在我们的研究中，BrdU掺入法被用来测定DNA合成活性，作为一种间接评估细胞增殖的方法。BrdU分析表明，AS-IV治疗能够增加BrdU阳性细胞的百分比（图1）3.(e))，表明AS-IV能有效促进角质形成细胞DNA合成活性。角化细胞迁移对皮肤伤口愈合至关重要。在创面划痕实验中，单独使用LiCl可抑制角质形成细胞的迁移能力。有趣的是,β在licl诱导的角质形成细胞培养中，划痕创面边缘-catenin上调。AS-IV有效地减弱了licl诱导的迁移抑制效应(图)7)．此外，我们发现角蛋白酶开始从非核心迁移β-Catenin阳性细胞，表明迁移β-catenin阳性细胞被阻断，AS-IV治疗改善细胞迁移相关β-catenin表达。

总之，使用licl作为激活wnt /的工具/β-catenin信号通路，我们已经证明了Wnt/的功能相关性β-角质形成细胞增殖和迁移中的连环蛋白信号。重要的是，我们还为AS-IV在伤口愈合治疗中的应用提供了证据，并揭示了其在伤口愈合再上皮化阶段的作用。这些与AS-IV相关的发现为AS-IV在角质形成细胞中的增殖作用的显著调节的分子机制提供了新的见解，这可以促进慢性伤口的上皮化和愈合[27］.进一步阐明as - iv对伤口愈合过程中涉及的其他分子和细胞的影响，将有助于促进as - iv药物的临床应用。

缩写

AS-IV：	黄芪甲苷IV
氯化锂:	氯化锂
DMSO溶液:	二甲亚砜
GSK-3:	糖原合成酶激酶3
MTS / PMS：	3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)- 2h四唑，内盐/吩嗪乙硫醚
PI:	碘化丙啶
BrDU:	5-bromo-2的脱氧尿苷
PBS:	磷酸缓冲盐
集成电路50：	半最大（50％）抑制浓度
PCNA:	增殖细胞核抗原。

致谢

本研究由来自中国国家科学基金会（NSFC）的补助金（No.81102596和30973751）支持。来自上海市教育委员会创新计划（第12YZ067）和上海市教育委员会大学的创新研究团队（第二阶段），也得到了上海科技委员会（第12YZ067）的创新计划的补助金（NO.14.1404700）。

参考文献

1. X. J. Wang，G. Han，P. Owens，Y. Siddiqui和A. G. Li，“TGF的作用β-介导的皮肤伤口愈合炎症，”皮肤病学研究研讨会学报，卷。11，不。1，pp。112-117，2006。视图:出版商的网站|谷歌学术
2. P. R. Cavanagh, B. A. Lipsky, A. W. Bradbury和G. Botek，《糖尿病足溃疡的治疗》，兰蔻，第366期。9498，页1725-1735,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术
3. A. J. Singer和R. A. F. Clark，“皮肤伤口愈合”，新英格兰医学杂志，第341卷，第2期。10，页738-746,1999。视图:出版商的网站|谷歌学术
4. G. C. Gurtner, S. Werner, Y. Barrandon, M. T. Longaker，《伤口修复与再生》，自然，第453卷，第7193号，第314-321页，2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术
5. S. Schreml, R. M. Szeimies, L. Prantl, M. Landthaler，和P. Babilas，《21世纪的伤口愈合》，美国皮肤病学会杂志，卷。63，否。5，pp。866-881,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
6. C. amendment, A. Mann, P. Schirmacher, M. Blessing，“角质形成细胞对TGF的抗性”β介导的生长限制和凋亡诱导加速皮肤伤口的重新上皮，“细胞科学杂志，卷。115，没有。10，pp。2189-2198,2002。视图:谷歌学术
7. W. J. Zhang，P. Hufnagl，B.R.Binder和J.Wojta，“黄芪苷IV的抗炎活性通过抑制NF-介导κB活化与粘附分子表达血栓形成和呼吸性，第90卷，第5期，第904-9142003页。视图:谷歌学术
8. J. Yu，Y.张，S. Sun等，“黄芪IV对大鼠糖尿病周围神经病变的”抑制作用“加拿大生理学和药理学杂志，卷。84，否。6，PP。579-587，2006。视图:出版商的网站|谷歌学术
9. O. Stojadinovic，H.Brem，C.Vouthounis等，“慢性伤口的分子发病机制：作用β-连环蛋白和c-myc在抑制上皮化和伤口愈合中的作用，”美国病理学杂志号，第167卷。1，页59-69,2005。视图:谷歌学术
10. P. S. Klein和D. A. Melton，“锂对发育影响的分子机制”，美国国家科学院学报第93卷第5期16，第8455-8459页，1996。视图:出版商的网站|谷歌学术
11. F.-L。李洪辉，邓洪伟。“中药外敷对糖尿病性溃疡的影响及其表达β-连环蛋白，c-myc和K6 "中华中西医结合杂志，第十七卷，第二期4，页261 - 266,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
12. S. H. Yuspa, P. Hawley-Nelson, J. R. Stanley, H. Hennings，《表皮细胞培养》，移植程序，第12卷，第2期3，补充1,114-122页，1980。视图:谷歌学术
13. J. Sambrook，E. F. Fritcech和T. Maniatis，分子克隆:实验室手册，冷泉港实验室出版社，美国纽约，1989。
14. F-L。李，R。徐，Q-C。Zeng等人，“丹参酮IIA通过细胞周期阻滞和凋亡抑制角质形成细胞的生长：银屑病的潜在治疗机制，”循证补充和替代医学，第2012卷，文章编号927658，共14页，2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术
15. A. Krishan， "用碘化丙啶染色法快速流式细胞荧光分析哺乳动物细胞周期"《细胞生物学杂志》，第66卷，第188-193页，1975年。视图:谷歌学术
16. P. Friedl, K. Wolf和J. Lammerding，《细胞迁移中的核力学》，《细胞生物学最新观点》，第23卷，第2期。1, pp. 55-64, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
17. M. Simka和E. Majewski，“静脉腿部溃疡的社会和经济负担：专注于微粉化纯化的黄酮类化分数辅助治疗的作用”美国临床皮肤科杂志，第4卷，第4期。8，页573-581,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术
18. A. S. Rao, N. Kremenevskaja, J. Resch，和G. Brabant，“锂通过激活Wnt/刺激培养的甲状腺细胞增殖β-catenin信号，“欧洲内分泌学杂志，第153卷，第153期6, 2005。视图:出版商的网站|谷歌学术
19. W. V. Welshons, K. S. Engler, J. A. Taylor, L. H. Grady，和E. M. Curran，“在MCF-7人乳腺癌细胞中，锂刺激增殖和磷酸肌醇代谢物的改变，”细胞生理学杂志，第165卷，第165号1，页134-144,1995。视图:出版商的网站|谷歌学术
20. A. Sun, I. Shanmugam, J. Song, P. F. Terranova, J. B. Thrasher，和B. Li，“在前列腺癌中，锂通过中断E2F-DNA相互作用抑制细胞增殖，随后减少s期基因表达，”前列腺，卷。67，没有。9，pp。976-988，2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
21. 王金生，王春林，温建飞，王永军，胡彦斌，任海忠，“锂离子诱导人食管癌Eca-109细胞周期阻滞，”世界胃肠病学杂志第14卷第2期25，第3982-3989页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
22. C. D. Mao, P. Hoang, P. E. DiCorleto，“锂抑制牛主动脉内皮细胞周期进展和诱导p53稳定”，生物化学杂志第276卷第2期28，页26180 - 26188,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术
23. C. Fathke, L. Wilson, K. Shah等，“Wnt信号在皮肤伤口愈合过程中诱导上皮细胞分化”，BMC细胞生物学， 2006年第7卷第4条。视图:出版商的网站|谷歌学术
24. “Wnt信号通路对创面愈合的影响”，张德龙，顾丽娟，刘玲等，“Wnt信号通路对创面愈合的影响”，生物化学与生物物理研究通讯，第378期。2，页149 - 151,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术
25. M. T. Teh, D. Blaydon, L. R. Ghali等，“WNT16B在人表皮角质形成细胞增殖和分化中的作用”，细胞科学杂志，第120卷，第2期，第330-339页，2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术
26. S. S. Cheon, A. Y. L. Cheah, S. Turley et al， "β-Catenin稳定失调间充质细胞增殖、运动性和侵袭性，并导致侵袭性纤维瘤病和皮肤增生性伤口。美国国家科学院学报，卷。99，没有。10，pp。6973-6978,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术
27. I. Pastar，O. Stojadinovic和M. Tomic-Canic，“角质形成细胞在慢性伤口愈合中的作用”外科手术技术国际，第17卷，第105-112页，2008年。视图:谷歌学术

版权

版权所有©2012李福伦等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。