电针口面穴反射调节大鼠胃功能的神经通路

摘要

针灸对胃肠功能具有反射调节作用，其特点是有节段性。本实验研究了口面穴电针(EA)对大鼠胃肌电活动的神经通路。结果表明，ST2电刺激促进GMA的峰突，与四肢电刺激相似，与腹部电刺激相反。兴奋效应分别被眶下神经、迷走神经复合体损伤和迷走神经切开术所消除。此外，在孤束核内注射l -谷氨酸可减弱兴奋作用。综上所述，迷走神经背侧复合体参与了口面穴EA对胃功能的反射调节，而nts -迷走神经背侧运动核(DMV)抑制连接可能是其必需的。

1.介绍

针灸已应用于诊所，治疗胃肠道（GI）疾病在中国数千千年，Zusanli Acupoint（ST36）被视为一种经典的穴位，以治疗中医教科书治疗GI疾病。最近，许多临床和实验研究表明，针灸可有效治疗GI疾病和调节GI功能，包括胃动力，胃酸分泌和胃部肌电活动（GMA）[1- - - - - -7］.但值得注意的是，针灸在不同的部位会产生不同的效果。例如，针刺四肢可通过迷走神经传出增强胃肠道运动[2，3.，7，而腹部针灸则通过交感神经传导抑制胃肠道运动[4，提示针刺对胃肠道的反射调节具有节段性。在这些研究中，研究人员注意到脊髓上结构参与了这个过程，背侧迷走神经复合体(DVC)可能是一个重要的候选者[1，2，4］.在我们以前的作品中，ST36或Orofacial acupoints的电针（EA）促进了GMA并在孤立菌（NTS）的细胞核中诱导C-FOS表达[2，8，9］.同时电生理数据显示，NTS中存在体脏器趋同神经元，同时对针刺刺激和胃胀反应[10］.DVC可能是针刺调节胃功能的主要靶点。

DVC由NTS和DMV组成，前者接收来自胃肠道的初级传入信号，后者包含支配胃肠道的迷走神经传出神经元。因此，DVC被认为是调控GI功能的副交感神经节前中枢。解剖和电生理数据表明，NTS和DMV之间存在兴奋性和抑制性突触连接。然而，大多数研究集中在抑制连接上，其中NST神经元的兴奋会抑制DMV中投射到胃肠道的突触后神经元，影响迷走神经的输出[11- - - - - -16］.因此，这些连接，尤其是抑制性连接，可能在GI功能的调控中发挥重要作用。

Sibai（ST2）位于胃部，主要用于治疗眼睛和胃肠病疾病[17］.阳白(GB14)为对照，位于膀胱经上，主要用于治疗头痛、眼疾[17］.本研究以大鼠口面穴(ST2和GB14)电刺激对GMA的反射调节及其神经通路为研究对象，探讨电刺激对胃肠道的作用机制。

2.实验的程序

2．1．实验设计

本研究共分为五个部分:(1)观察电刺激对GMA的影响。同时选取位于前额，瞳孔正上方2.5 cm处的GB14作为对照。(2)通过眶下神经(ION)研究电刺激在ST2点对GMA的传入通路。(3)探讨DVC在DVC损伤后EA效应中的作用。(4)探讨微注射l -谷氨酸钠对EA作用的影响。(5)观察迷走神经切断术后EA效应的传出通路。

2．2.动物

成年Sprague-Dawley大鼠雌雄均有，体重在220 - 250克之间。每只大鼠饲养于控制环境条件下(25±1℃，相对湿度40-60%，上午7:00 -晚上19:00，光-暗循环12 h/12 h)，食物和水可自由取用。实验程序按照广州中医药大学动物护理与使用委员会的指南进行。

2．3.胃电极植入

手术过程与之前报道的相似[2］.在快速过夜后，将动物用氨基甲酸酯（1g / kg，I.p.）麻醉，并使剖腹手术露出胃。将一个2mm长的环铂电极缝合到胃窦的前壁上的浆膜表面，约0.5cm至幽门括约肌，另一个约1.5cm至此。通过皮下隧道将与电极连接电极的电线。最后关闭腹腔。

２.４.GMA的录音

如前所述进行GMA记录[2］.实验是在给大鼠大约5天从手术中完全恢复后开始的。实验前禁食24小时，用氨基甲酸乙酯(1g /kg, i.p。)麻醉。放大器的低截止频率和高截止频率分别为10 Hz和30 Hz，慢波和尖峰脉冲叠加在慢波中连续记录至少10 min。

2．5．事务的离子

电刺激前5天进行离子预处理。采用腹腔注射氨气(1克/公斤)麻醉动物。在眶下孔上方的皮肤上做垂直切口，在解剖显微镜下暴露双侧离子。用于离子的交易，将暴露的离子连接在具有丝缝合线的两个单独的点处，横断两种连接之间的神经束。对于假操作在美国，只暴露了离子，没有接受任何治疗。

2．6．DVC病变

老鼠用氨基甲酸酯(1 g/kg, i.p)麻醉，并以俯卧位固定在立体定向装置(SR-6N, Narishige, Japan)中。取寰枕膜及小脑，显露髓质背侧。Obex被定义为后叶和菖蒲之间的点，在那里中央管开始打开进入第四脑室[18］.以此为参考点，将绝缘钨电极插入DVC中，施加2ma阴极电流10 s。DVC的坐标为背侧至obex 0.5 - 0.7 mm，双侧中线外侧0.5 mm，脑干表面背侧0.4 mm [18］.假性病变，电极插入相同的位置，没有电流。

2.7。将L-谷氨酸的显微注射到NTS中

老鼠用氨基甲酸乙酯麻醉，如上所述暴露髓质背侧。在ST2电刺激前，将l -谷氨酸(5 nmol/50 nl) (Sigma，美国)微注射到NTS(坐标:鼻侧至obex 0.5 - 0.7 mm，双侧中线外侧0.5 mm，脑干表面背侧0.3-0.4 mm)。在相同的位置注射生理盐水作为对照．

2.8。迷走神经切断术

电刺激前，大鼠用尿烷麻醉(1 g/kg, i.p.)，并进行迷走神经切开术。将贲门附近食道周围的双侧迷走神经(VN)与周围组织小心分离，分别于两点用丝线缝合结扎，切断两结扎间的神经束。对于假操作，VN仅暴露并没有接受任何治疗。

2.9。EA治疗

大鼠用氨基甲酸乙酯麻醉(1 g/kg, i.p。)并固定在塑料盒中。2根不锈钢针(外径0.28 mm)分别皮下刺入两侧ST2或GB14穴位5 mm，静置20 min。电刺激采用医用EA设备(型号为G6805-2，中国上海)。刺激参数的频率分别为2和20赫兹，强度足够强，仅能引起口面部区域的轻微抽搐。ST2和GB14分别位于眶下孔和前额瞳孔正上方2.5 cm处[19］.

2.10。组织学

微注射结束时，用50 nl 2% pontamine天蓝色标记微注射部位。然后大鼠通过升主动脉灌注100ml生理盐水和400ml 4%多聚甲醛。取出脑干，在同一固定液中固定6-8小时，在20%蔗糖溶液中浸泡过夜。冷冻切片机(CM1850，徕卡，德国)在−20°C下获得冷冻横切面。最后在显微镜下用中性红染色确定微管的位置。

DVC病变按上述方法灌注固定大鼠，冷冻横切面苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下识别病变部位。

2.11。统计分析

数据以均值±均值标准误差(SEM)表示，显著性水平设为．结果采用配对样本或独立样本进行分析测试。在异常分布或异方差的情况下，结果处理非参数检验(曼-惠特尼)．

3.结果

3．1.EA口面穴对GMA的影响

在ST2的EA产生了每分钟的尖峰簇数量的显著增加；而GB14的EA则没有．ST2电脉冲后的峰突变化显著高于GB14电脉冲(图1)．

3．2．离子交易对EA诱导GMA的影响

离子交易后，EA在ST2未产生任何GMA变化．在假操作组中，ST2 EA诱发了峰值暴增，这与EA在ST2时的变化类似。ION交易后峰值爆发的变化明显低于假操作组(图2)．

3．3.DVC损伤对EA诱导GMA的影响

DVC电损伤后，ST2点EA对峰突无影响．在假病变组中，ST2处EA产生了明显的spike burst数量增加．DVC损伤后峰突的变化明显低于假性损伤组(图3.)．

3．4．谷氨酸微注射对EA诱导GMA的影响

经微注射l -谷氨酸预处理后，ST2 EA对峰突无明显影响持续约5-10分钟。正常盐水显微注射对ST2在EA引起的尖峰爆发的变化没有影响．组织学显示所有微注射均位于NTS内。谷氨酸微注射后的峰突变化明显低于生理盐水微注射的峰突变化(图4)．

3．5．迷走神经切开术对EA诱导GMA的影响

双侧迷走神经切断术后，ST2电刺激对峰突无影响．假手术不影响EA在ST2诱导的GMA兴奋作用．迷走神经切开术后突波的变化明显低于假手术时(图5)．

3.6。组织学

图示DVC的电解损伤和NTS的微量注射部位6和7,分别。

4。讨论

众所周知，来自皮肤和/或肌肉的体细胞输入引起自主功能的改变，这被称为体-自主反射，以节段为特征。在麻醉大鼠中，捏腹部皮肤可抑制胃动力，捏四肢可增强胃动力[20.- - - - - -22］.针灸作为身体刺激的一种，也有类似的效果。针刺腹部和下胸部可通过交感神经传出抑制胃运动，而针刺肢体可通过迷走神经传出促进胃运动[4，23］.此外，在人类和/或动物中，肢体EA加速胃排空和增强GMA，这也是由迷走神经介导的[6，24］.在本研究中，在口面穴(ST2) EA产生了GMA簇的数量增加，这在双侧迷走神经切开术后被消除。GI运动受GMA控制，GMA由慢波(慢节奏)和尖波(快节奏)组成。慢波决定了胃肠道收缩的频率和传播，而脉冲活动叠加在慢波上，是收缩的电对应物。当出现尖峰时，胃肠道收缩总是发生。因此，口面穴电刺激(ST2)对胃运动产生兴奋作用，迷走神经参与了这一过程，与四肢电刺激相似，与腹部电刺激相反。提示针刺对胃功能的反射调节和穴位与脏腑的特殊关系都具有节段性。

在本研究中，EA在ST2对GMA的兴奋作用分别通过离子交易、DVC损伤和迷走神经切断术被消除，提示由ION-DVC- vn组成的神经通路对这种反应是必不可少的。ST2位于眶下孔，受眶下神经支配，眶下神经与DVC无直接投影。我们之前的研究表明，ST2 EA诱导大鼠NTS中c-fos表达，抑制内脏疼痛，这是由扁桃体旁核介导，并被离子交易所消除[8，9］.DVC作为副交感神经节前中枢，在EA对胃肠道功能的调节中起重要作用。解剖学证据表明，EA在ST-36诱导的体细胞传入物传递到NTS并作用于DMV，促进胃运动[23］.此外，DMV胃投射神经元的NMDA受体参与了EA at BL21对大鼠胃排空的调节[25］.我们之前的工作也表明，ST36的EA增强了GMI，同时抑制了Substance的释放，该规定因迷走神经的活动而取消[2］.

另一个有趣的问题是，EA在ST2诱导的口-面体输入直接作用于DMV神经元，或通过NTS间接作用于DMV神经元。电生理和解剖数据表明，NTS和DMV之间存在大量突触连接，抑制连接是调节GI功能的关键[11- - - - - -16］.众所周知，DVC中的许多神经递质和神经调质参与了GI功能的调节，其中谷氨酸是一个主要的候选物质。在迷走神经反射中，GI感觉输入终止于NTS并释放谷氨酸，谷氨酸主要作用于非nmda受体，激活NTS中的抑制性神经元投射到DMV，最终抑制DMV神经元[26- - - - - -28］.几组研究人员已经表明，在DVC中微量注射谷氨酸对胃运动产生抑制或兴奋作用。似乎谷氨酸微注射入NTS可引起胃抑制[29，30.]，而DMV微注射谷氨酸可引起胃兴奋[31，32］.电生理数据表明，DMV中肠敏感神经元室旁核的激活可能是其对NTS神经元影响的间接结果[33］.已经证明，NTS接收内脏和躯体的感觉传入物，并在躯体-内脏加工过程中发挥重要作用[2，8- - - - - -10］.EA在肢体的体细胞输入通过NTS通过NTS作用于DMV，促进胃动力，腹部EA通过NTS作用于腹腔外侧髓质（RVLM）和抑制胃动机[23］.本研究中，在NTS中微注射谷氨酸可抑制EA在ST2诱导的GMA兴奋，提示NTS-to- dmv抑制连接参与了EA在ST2对副交感神经运动输出的调控。

综上所述，ION-NTS-DMV-VN神经通路参与了EA在口面穴对胃功能的反射调节，其中NTS-DMV抑制连接可能是必不可少的。

致谢

中国国家基础研究计划得到支持（973课程; 2010亿元人才，NCET-09-0083），中国国家自然科学基金（NO.30873239）和盖东自然科学基金委员会（没有。9351040701000001）。

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