文摘
咖啡酸苯乙基酯(角),一个活跃的组件从蜜蜂的蜂巢中提取,展品抗炎和抗癌活动。然而,角影响的分子机制口腔癌细胞转移尚未阐明。在这项研究中,我们调查了潜在机制的影响角SCC-9口腔癌细胞的入侵能力。结果表明,减毒SCC-9角细胞迁移和入侵noncytotoxic浓度(0μM - 40μ米)。免疫印迹和明胶zymography分析结果进一步表明,角表达下调矩阵metalloproteinase-2 (MMP-2)蛋白表达和抑制其酶活性。角对其抑制效果MMP-2表达式和活动的移植组织抑制剂metalloproteinase-2 (TIMP-2)和有说服力地减少迁移减少粘着斑激酶(FAK)磷酸化,激活下游信号分子p38 MAPK和物。这些数据表明,角可能会被用作chemoagent防止口腔癌转移。
1。介绍
口腔癌与高度的局部侵袭性和高地区宫颈癌淋巴结转移率。口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的头颈部癌症和特点是预后不良和低存活率(1]。转移是癌症死亡的主要原因,涉及到多个进程包括装修和降解细胞外基质(ECM)的2]。各种蛋白酶,如基质金属蛋白酶(MMPs),组织蛋白酶、纤溶酶原激活物(PA),参与肿瘤细胞之间的交互和ECM (3,4]。基质金属蛋白酶的功能结构蛋白的降解ECM和调节多种细胞功能包括增长,入侵、转移和血管生成5]。在不同基质金属蛋白酶被认为是参与人类疾病,调查人员深入调查了明胶酶(MMP-2和MMP-9)。矩阵metalloproteinase-2和MMP-9的主要酶参与降解基底膜的主要结构成分,IV型胶原蛋白(6,7]。多项研究表明,明胶酶过表达在多种人类癌症,如乳腺癌[8),胰腺(9)、前列腺癌(10)、肺(11)和口头(12癌症。以前的研究也发现显著增加尿液和血浆浓度MMP-2在癌症患者13,14],MMP-2和MMP-9被认为是预测的风险或转移或复发癌预后标记(15]。
咖啡酸苯乙基酯(角)是蜜蜂蜂胶提取物的活性成分之一16]。先前的研究已经表明,角产生抗氧化、抗炎、抗癌活动(17]。此外,抑制角类二十烷酸合成,抑制花生四烯酸的释放从细胞膜17,18]。其抗炎活性cox - 2表达的差别来源于对这些19,20.]。Chuu等人发现,角抑制人类前列腺癌的细胞增殖的抑制一种蛋白激酶(21]。其他研究已经表明,角通过激活诱导细胞凋亡的抑制Fas和伯灵顿,NF -B (22,23]。然而,它对OSCC入侵和转移的影响及其潜在机制尚未完全阐明。
这项研究调查了治疗角之间的关系和入侵SCC-9口腔癌细胞。我们的研究结果表明,角抑制口腔癌细胞的迁移和入侵,可能通过抑制FAK磷酸化及其下游p38和物信号通路。结果还表明,角的anti-invasive活动在一定程度上是由MMP-2表达式和活动的规定,降低口腔癌的能力细胞降解细胞外基质的组成部分。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和斗篷的治疗
人力舌鳞状细胞癌SCC-9细胞系获得写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯),培养在杜尔贝科修改鹰的媒介补充营养混合物,由F-12火腿的介质(生活技术,大岛,纽约,美国),10%胎牛血清(美国UT Hyclone实验室、洛根),2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。细胞培养都维持在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。角治疗,适当数量的股票解斗篷被添加到培养基实现指定的浓度,然后孵化与细胞显示时间,而二甲亚砜溶液没有角作为空白试剂。
2.2。测定细胞活力(MTT试验)
细胞生存能力实验,微量培养四唑(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化)的细胞毒性进行比色测定,以确定角(3]。SCC-9细胞被播种在24-well板的密度细胞/好,角处理浓度0到40之间μ在37°C M 24和48 h。曝光时间后,媒体被移除,细胞被洗与磷酸盐(PBS)然后孵化20μL MTT(5毫克/毫升)(西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)4 h。活细胞数量每盘成正比甲瓒的生产,可以测量spectrophotometrically在563纳米以下与异丙醇溶解。
2.3。膜联蛋白V / PI双染色
一个FITC膜联蛋白V凋亡检测工具是用来量化细胞数量在不同阶段的细胞死亡。简单地说,细胞被resuspended在100年μL 1 x绑定缓冲(0.01玫瑰/氢氧化钠(pH值7.4),0.14 M氯化钠,CaCl和2.5毫米2)。增加5μL (FITC膜联蛋白V和5μLπ,孕育了细胞悬液在室温下15分钟在黑暗中。400年之后,μL 1 x绑定缓冲被添加到每个管后1小时内通过流式细胞术分析。
2.4。体外伤口关闭
SCC-9细胞(1×105细胞/)在6-well盘子镀24 h,受伤的抓挠,吸管,然后孵化DMEM培养基含有0.5%的边后卫,有或没有治疗角(0、5、10、20和40μM)为0,24、48和72 h。细胞被拍到使用相差显微镜()。
2.5。细胞迁移和入侵检测
细胞迁移和入侵化验根据杨et al。描述的方法(4]。治疗后角(0、5、10、20和40μM) 24 h,幸存细胞收获和播种Boyden室(神经探针,Cabin John,医学博士,美国)在104细胞在无血清培养基和培养24小时37°C。入侵检测,10μL基底膜基质(25毫克/ 50毫升;美国BD生物科学,MA)应用于8μm孔隙大小聚碳酸酯膜过滤器,室底部包含标准的媒介。过滤器被风干5 h在层流罩。入侵细胞被固定为100%甲醇和彩色染色为5%。光学显微镜下细胞的人数统计。中描述的迁移进行了分析入侵检测没有涂层的基底膜基质3]。
2.6。由明胶Zymography MMP-2测定
MMP-2的活动条件测量介质的凝胶zymography蛋白酶化验如前所述[3]。短暂,收集媒体的一个适当的体积(调整至关重要的细胞数量)与SDS样品准备缓冲没有沸腾或减少和受到0.1%明胶和8% SDS - page电泳。经过电泳,凝胶是用2.5% Triton x - 100然后孵化反应缓冲区(40毫米Tris-HCl, pH值8.0,10毫米CaCl2,0.01%的南3)12 h 37°C。然后凝胶染色与考马斯亮蓝r - 250。
2.7。总细胞溶解产物的制备
总细胞溶解产物制备、细胞与PBS冲洗两次,刮0.2毫升的寒冷里帕缓冲含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,然后在4°C涡10分钟。细胞溶解产物受到10000 rpm的离心10分钟在4°C,和不溶性颗粒被丢弃。总蛋白浓度的细胞溶解产物和核分数由布拉德福德决定试验(3]。
2.8。免疫印迹分析
细胞溶解产物分离在10%聚丙烯酰胺凝胶和转移到硝化纤维膜。5%脱脂牛奶的污点随后被孵化Tris-buffered盐水(20毫米三,137毫米氯化钠,pH值7.6)1 h阻止非特异性结合,然后一夜之间孵化与多克隆抗体MMP-2, TIMP-2,半胱天冬酶3、8、9三个MAPKs (ERK 1/2,物1/2,p38),一种蛋白激酶,或与特定的抗体FAK磷酸化或相应的ERK的磷酸化形式1/2,物1/2,p38, Akt, FAK。屁股被孵化与辣根过氧化物酶山羊anti-rabbit或anti-mouse免疫球蛋白1 h。之后,发现信号通过使用增强化学发光(ECL)商业工具(Amersham生物科学)和相对底片黑度量化了凝胶上的照相底片扫描文档和分析系统(2000年AlphaImagerαInnotech公司,圣莱安德罗,CA,美国)。
2.9。统计分析
统计学意义的差异在这计算是通过学生的学习以及(Sigma-Stat 2.0, Jandel科学、圣拉斐尔,CA,美国)。一个区别被认为是具有统计学意义,实验重复三次。
3所示。结果
3.1。CAPE SCC-9细胞生存能力的影响
图1(一)显示不同浓度的细胞毒性效应的角(0μM-40μ米)SCC-9细胞24小时和48小时。MTT试验的结果表明,所有的浓度,包括最高测试角浓度(40μ米),无意义的影响SCC-9细胞生存能力与控制()。此外,角也没有改变正常牙龈成纤维细胞的细胞生存能力在不同浓度(0-40μ米)24 h(图1 (b))。因此,所有后续实验,因此,使用这个海角浓度范围。
(一)
(b)
我们进一步研究了角的影响膜联蛋白V翻转和半胱天冬酶乳沟。我们的研究结果显示,治疗与角(0-40 SCC-9细胞μM) 24小时没有增加细胞凋亡的发生率可以没有显著变化的膜联蛋白V / PI双染色(图2(一个))和半胱天冬酶3 8和9的表达水平(图2 (b))之间的控制和CAPE-treated SCC-9细胞()。
(一)
(b)
3.2。抑制SCC-9细胞活性、迁移和入侵
愈合试验,显著降低角SCC-9细胞的细胞活性剂量和时间依赖性()(数据3(一个)和3 (b))。40岁μ米,角迁移的细胞数量降低了38%,56%,和82%在24 h, 48 h,分别和72 h。使用细胞迁移和入侵检测Boyden室,我们表明,角减少SCC-9细胞迁移和入侵显著和浓度的方式()(数据4(一)和4 (b))。在入侵检测中,抑制百分比(图16 - 64%4 (b)孵化后的细胞与不同浓度(0-40μ米)24小时的斗篷。我们的研究结果表明增加抑制细胞迁移的斗篷浓度增加。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.3。角对MMP-2和TIMP-2蛋白质表达的影响和MMP-2酶活性
确认MMP-2抑制细胞迁移中起着至关重要的作用,我们比较MMP-2 CAPE-treated和控制SCC-9细胞蛋白表达。如数据所示5(一)和5(b),治疗SCC-9细胞与角表达下调MMP-2酶活性浓度的方式()。40岁μ米,角减少MMP-2酶活性57%在24小时。角也显著降低MMP-2蛋白质表达和增加TIMP-2表达蛋白免疫印迹(数字5(c)和5(d))。角(40μ米)增加TIMP-2表达式1.58折叠在24小时。
3.4。角对粘着斑激酶(FAK)激活
我们的调查的分子调控细胞迁移表示FAK在角活动的参与。有显示,抑制角SCC-9细胞迁移和入侵,我们进一步旨在评估任何更改在FAK激活这些细胞Tyr397使用FAK磷酸化抗体针对网站。如图6在SCC-9细胞,角降低FAK磷酸化。抑制百分比(图20 - 42%6 (b)孵化后的细胞与不同浓度的角24 h。这些结果表明,抑制角SCC-9细胞迁移,至少在某种程度上,通过调节FAK磷酸化。
(一)
(b)
3.5。角对MAPK和PI3K / Akt通路的影响
我们研究了角的影响MAPK和PI3K / Akt通路使用免疫印迹分析。结果显示本构的磷酸化(图7(一))和pAKT(图7 (d)在未经处理的SCC-9 p38(图的差别,对这些基因的细胞7 (b))和pJNK(图7 (c))磷酸化CAPE-treated细胞剂量依赖性的方式()。40岁μ米,角p38和物磷酸化水平降低51%和40%,分别。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
恶性肿瘤患者的管理大大改善了过去几十年。OSCC患者现在有了一个总体5年生存率约25% (24]。然而,晚期疾病患者经常经历癌症扩散到地方和遥远的网站,控制不佳的手术。我们的研究结果表明,角可能有潜在的口腔癌症转移作为抑制剂,可能,因此,促进有效的抗癌疗法的发展。我们发现,(1)抑制角SCC-9口腔癌细胞的迁移和入侵noncytotoxic浓度,(2)会使MMP-2蛋白表达及其酶活性抑制,(3)增加TIMP-2表达式,(4)抑制FAK磷酸化,(5)和抑制p38 MAPK和物激活。
入侵和移民被认为是恶性肿瘤的最重要的特征。固体肿瘤转移是人类癌症患者死亡的主要原因,涉及多个复杂的过程。ECM的降解被认为是肿瘤恶化的关键(25]。在各种蛋白酶,这导致ECM降解,矩阵metalloproteinase-2是最重要在口腔癌26]。先前的研究调查了不同种族的临床意义的MMP-2口腔癌。免疫组织化学结果表明,MMP-2恶性肿瘤组织中的表达显著升高与相邻正常组织。MMP-2超表达与淋巴结转移呈正相关(27,28]。MMP-2的激活率是高的恶性组织患者淋巴结转移与那些没有淋巴结转移(29日]。OSCC入侵和转移是治疗的主要障碍。因此,抑制转移OSCC的斗篷可以提供重要的预防和治疗benefitsagainst口腔癌。
这项研究的结果表明,显著抑制角SCC-9癌细胞的迁移/入侵能力,表达下调MMP-2蛋白表达,并抑制MMP-2酶活性。然而,我们的数据也表明,从SCC-9 MMP-9细胞的分泌浓度非常低(数据未显示)。MMP体内的功能依赖于当地的平衡他们和他们的天然抑制剂(30.]。TIMPs是生理抑制剂结合的MMP 1: 1化学计量学。几项研究已经表明,测量蛋白酶/蛋白酶抑制剂比在某些肿瘤可以提供一个精确的反映了ECM重塑(31日]。然而,转移之间的关系和TIMP-2仍然是有争议的。在以前的研究中,TIMP-2过度保护癌细胞凋亡和减少细胞入侵在不同肿瘤细胞系(32,33]。在其他临床分析,TIMP-2表达与肿瘤复发呈正相关34]。我们的数据表明角色TIMP-2预防肿瘤细胞入侵,因为它的表达式是调节在CAPE-treated SCC-9细胞。
以前的研究有良好增殖蛋白激酶(MAPK)的作用通路调节MMP的表达和转移的肿瘤细胞(35- - - - - -37]。抑制SB203580 p38的几个癌细胞的迁移率显著减少(38]。在这项研究中,黄et al .,物的显性负突变抑制人类角膜上皮细胞的迁移(39]。在其他的研究中,p38和物调制MMP-2生产癌细胞(40- - - - - -42]。我们的数据表明,角治疗抑制p38和物磷酸化表达下调MMP-2表达式,表示一个可能的机制抑制MMP-2合成的角。phosphoinositide-3激酶(PI3K / Akt信号转导途径参与MMP的生产和细胞增殖,生存,和迁移43];然而,我们的研究结果表明,角不重要的对PI3K / AKT信号通路的影响。
总之,我们的研究结果表明,角部分施加其antimetastatic影响口腔癌症细胞通过调节MMP-2表达式通过抑制FAK和MAPK激活。总体而言,这些数据表明,角有潜力作为chemoagent预防口腔癌细胞转移。
确认
本研究由国家科学委员会研究资助,台湾(没有。nsc100 - 2632 b - 040 - 001 - my3)和从涌山医科大学(没有研究资助。G101N0001),台湾。