文摘

糖尿病的特征是促炎的状态,和一些炎症过程相关的1型和2型糖尿病和由此产生的并发症。高葡萄糖水平诱导促炎细胞因子的释放。非瑟酮、类黄酮膳食成分中发现烟树(Cotinus coggygria),也广泛分布在水果和蔬菜。非瑟酮是通过抑制NF -发挥抗炎作用B信号通路。在这项研究中,我们分析了影响非瑟酮的促炎细胞因子的分泌和表观遗传调节,在人类单核细胞在高血糖的条件下培养。控制人类单核细胞的(THP-1)细胞培养(14.5 L更易与甘露醇),normoglycemic (5.5 NG,更易与L葡萄糖),或高血糖的(HG, 20更易/ L的葡萄糖)条件下,在没有或非瑟酮的存在。非瑟酮添加(3 - 10米)48 h。而HG条件显著诱导组蛋白乙酰化作用,NF -B激活,促炎细胞因子(il - 6和TNF -)从THP-1细胞释放,非瑟酮抑制NF -B活性和细胞因子释放。非瑟酮治疗基因表达也显著降低CBP / p300,以及乙酰化水平和帽子活动CBP / p300的蛋白质,这是一个已知的NF -共激活剂。这些结果表明,非瑟酮能抑制细胞因子HG-induced生产在单核细胞,通过表观遗传变化涉及NF -我们因此建议非瑟酮补充被认为是预防糖尿病。

1。介绍

糖尿病及其并发症的慢性炎性属性。炎症是宿主的防御反应组织针对不同的侮辱。尽管通常有益的过程,当它发生在长时间,可以有害的炎症细胞(1]。高血糖已经涉及diabetes-induced炎性疾病和糖尿病引起的并发症(2,3]。据报道诱导氧化应激(4,5]。此外,高水平的葡萄糖能激活促炎转录因子核κB (NF -κB),导致增加炎症趋化因子和细胞因子释放6,7]。

我们和其他研究人员最近发现,糖尿病条件激活炎症基因表达和单核细胞活化诱导表观遗传变异和染色质重塑8,9]。然而,高血糖引起的确切分子机制还没有完全解决。

NF -κB需要许多炎症基因的表达。这些基因中有几位与炎症相关疾病,包括动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、代谢综合征和糖尿病及其并发症(10]。

在哺乳动物中,NF -κB家族包含5个成员:RelA / p65 RelB: NF -κB1 / p50和NF -κB2 / p52。经典的NF -κ转录因子是一个p50-RelA / p65异质二聚体(11),调节基因转录的炎症。NF -κB活动是由RelA / p65乙酰化和脱乙酰作用,这是由组蛋白乙酰转移酶(帽子)和组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac),分别为(12,13]。除了调节NF -κB活动,帽子和hdac调节炎症过程组蛋白的乙酰化/脱乙酰作用[14,15]。

“后生”一词用于描述遗传表型和基因表达的变化引起的机制,不涉及DNA序列的调制16]。最近,表观遗传修饰也一直在与疾病有关的基因表达的变化(17]。

最好的理解类型的表观遗传调控DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰。组蛋白可以接受许多不同的转译后的修改,其中乙酰化和脱乙酰作用已被广泛研究。一般来说,组蛋白的乙酰基的帽子的结果在一个“开放”染色质构象,促进基因表达,允许访问DNA的转录因子。相比之下,去除乙酰基的hdac结果在“封闭”染色质环境中,具有压制性影响转录(18]。因此,很明显,一个受到严格监管的平衡这两个敌对的酶的活动需要适当的基因表达,而这种平衡的破坏会导致病理条件(19]。

改变帽子和HDAC活动会导致一些疾病,包括癌症,糖尿病,心脏肥大,和哮喘(14,15,20.,21]。最近,在活的有机体内组蛋白乙酰化的相关性在糖尿病和炎症是支持的一项研究表明组蛋白赖氨酸乙酰化水平的提高,在单核细胞炎症基因启动子孤立的1型和2型糖尿病患者中,相对于健康志愿者(控制9]。其他研究解决目标的表观遗传机制作为一个公认的治疗方法治疗糖尿病,主要集中在小分子HDAC调节器的使用自然起源的6,7,20.- - - - - -22]。然而,这种分子的作用机制在很大程度上仍未知。

黄酮类化合物是天然的分子研究公认的抗炎剂。他们是低分子量多酚类化合物中发现的大量种子,柑橘类水果,红酒,茶,和橄榄油。黄酮类化合物有不同的生物属性:除了他们的抗炎功能,描述了他们发挥抗氧化、抗血小板、抗血栓形成的,cytoprotective,抗过敏药,抗病毒和抗癌的效果23- - - - - -26]。由于其丰富的饮食产品及其潜在的有益的药理和营养作用,类黄酮的药物均有相当大的兴趣以及健康食品补充剂。非瑟酮(3、7、3′,4′-tetrahydroxyflavone)是类黄酮膳食成分中发现烟树(Cotinus coggygria),也广泛分布在水果和蔬菜,如草莓、苹果、柿子、葡萄、洋葱和黄瓜。它展示各种活动,包括神经营养,抗氧化,抗炎,抗血管新生的影响23,27- - - - - -29日]。非瑟酮也被报告给下调肝糖分解,糖质新生,糖化血红蛋白的形成在体外(30.,31日]。然而,到目前为止,非瑟酮作用的分子机制仍然不明。

在目前的研究中,我们试图解决非瑟酮作为抗炎剂的使用,分析糖尿病条件下其分子作用机制。我们假设通过NF -非瑟酮抑制促炎细胞因子的分泌κB信号通路,通过改变组蛋白乙酰化和脱乙酰作用之间的平衡。为了测试我们的假设,我们使用人类单核细胞培养high-glucose条件下,分析了非瑟酮对帽子和HDAC活性的影响,NF -κB乙酰化作用,炎症基因的表达。

2。材料和方法

2.1。试剂

非瑟酮购买从西格玛奥德里奇(美国圣路易斯MI)。非瑟酮一直作为一个股票的解决方案在二甲基亚砜(DMSO)和与培养基稀释。我们使用0.1% (v / v) DMSO作为车辆控制实验。实时PCR引物是从Bioneer购买(大田、韩国)。抗体NF -κBp65,磷酸化NF -κBp65,乙酰化p65、p300和乙酰化CBP / p300从细胞信号技术购买(美国贝弗利,MA)。抗体HDAC-1、HDAC-2 HDAC-3买来Abcam(美国Cambridge, MA)。肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)和il - 6 ELISA分析工具也从Abcam购买(美国Cambridge, MA)。帽子和HDAC测定包被从Biovision购买(CA)山景城。从皮尔斯BCA蛋白质化验设备购买。Novex预制Tris-Glycine凝胶得到从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。所有其他的化学物质,除非另有说明,得到从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。细胞培养

人类单核细胞的THP-1细胞系得到从美式文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。THP-1在RPMI培养基培养细胞含10%胎牛血清和抗生素在37°C 1% 5%的股份有限公司₂的气氛。非瑟酮溶解在DMSO溶液用于治疗的细胞。最后使用的DMSO浓度为0.1% (v / v)为每个治疗。THP-1细胞(1×10⁵细胞/毫升)培养的渗透的控制(14.5 L更易与甘露醇),在正常血糖(5.5 NG,更易与L葡萄糖),或高血糖的(HG, 20更易/ L的葡萄糖)条件下,在没有或存在非瑟酮(0、3、6、10μ米)48 h。这段时间后,测量细胞因子释放的介质收集;细胞用磷酸盐(PBS)洗净,然后收获。

2.3。细胞生存能力分析

非瑟酮的毒性作用培养THP-1细胞通过细胞计数测量Kit-8 (Dojindo分子技术、ML、美国),根据制造商的协议。THP-1细胞被播种在4×10³细胞/在96孔板,随后用非瑟酮治疗48 h。吸光度测量使用Wallac设想标(PerkinElmer、芬兰)。非瑟酮的抑制效应对经济增长评估作为细胞生长的百分比减少vehicle-treated细胞相比,被定义为100%可行。

2.4。细胞因子释放测量

细胞因子水平用ELISA测定包(Abcam、剑桥、马、美国)根据制造商的指示。值计算基于一个标准曲线构造分析。

2.5。信使rna水平的评价

引物设计使用在线程序。总RNA分离使用试剂盒试剂(生活技术,医学博士),根据制造商的协议。浓度和纯度的总RNA进行评估通过测量吸光度在260和280海里。合成第一链cDNA从2μ使用1 g的总RNA,μ米的oligo-dT₁₈底漆和Omniscript逆转录酶(试剂盒,CA)。SYBR green-based定量PCR进行与Stratagene Mx3000P实时PCR系统和才华横溢的SYBR绿色主混合(Stratagene, CA),使用3μ50 L的第一链cDNA稀释1:作为一个模板,和10 pmoles引物,根据制造商的协议。PCR反应包括三个部分:第一部分(10分钟95°C)聚合酶活性;第二部分包括35周期,每个组成的40多岁的变性在94°C,紧随其后的是40年代的退火60°C,和扩展在72°C的1分钟;第三段是执行生成温度分离曲线的产品,通过孵化95°C 1分钟,其次是孵化30年代在55°C和30年代在95°C。所有反应都是一式三份,和数据分析的方法(32]。GAPDH是用作规范化控制基因。意义的决心与GAPDH-normalized相比值。

2.6。测量HDAC使用ELISA和帽子的活动

与不同浓度的非瑟酮治疗后48 h,细胞收获和核溶解产物被准备。帽子和HDAC活性测定,核溶解产物含有50μg蛋白质从每组。执行的实验是根据制造商的指示。吸光度测量在405 nm和440 nm。

2.7。制备的核和细胞质溶解产物

与非瑟酮治疗后,媒介是吸气,细胞被洗两次PBS(10毫米,pH值7.4)。核溶解产物是准备使用NE-PER核和胞质提取试剂(美国皮尔斯,IL)。溶菌产物收集并通过离心分离,上层的整除,储存在−80°C。蛋白质溶解产物的浓度是衡量BCA蛋白质化验(美国IL皮尔斯),按照制造商的协议。

2.8。免疫印迹分析

免疫印迹分析,细胞在缓冲区组成的均质10毫米Tris-HCl (pH值7.5),150毫米氯化钠,0.05% (v / v)渐变20日1毫米PMSF和一个蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(罗氏公司、德国)在4°C,然后离心10000 g×15分钟。上层清液作为细胞质蛋白质分数,和核蛋白质提取使用NucBuster蛋白质提取从颗粒工具包(Novagen,德国)。蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质分析工具包(皮尔斯,IL)。样品(20μ克总蛋白)与样品混合缓冲(100毫米Tris-HCl, 2%十二烷基硫酸钠,2-mercaptoethanol 1%, 2%的甘油,和0.01%溴酚蓝(pH值7.6),15分钟在95°C的环境,和加载10%聚丙烯酰胺凝胶。电泳进行使用迷你千变万化3细胞系统(Bio-Rad, CA)。硝化纤维膜上的蛋白质被解决(Scheicher &施耐尔生物科学,德国)。视觉评估数量的蛋白质加载和转移的效率,膜与朱红色年代彩色染色方案。免疫印迹、膜清洗和孵化在阻断缓冲区(10毫米Tris-HCl pH值7.5,150毫米氯化钠,渐变20日0.1%和3%脱脂奶粉),然后用稀释孵化主要抗体(1:1000)在室温下2 h。孵化与主抗体后,膜与阻断缓冲区洗3次,然后探讨了二次稀释抗体(1:2000)1 h。膜是洗3次(每15分钟)和发展与西方SuperSignal毫微微最大灵敏度衬底(美国IL皮尔斯),使用一个拉斯维加斯- 3000发光图像分析仪(富士胶片影像有限公司、日本)。

2.9。免疫沉淀反应化验

免疫沉淀反应,我们孤立的细胞的核分数,根据制造商的协议。样本(300μ总蛋白质)是事先批准的g / g +琼脂糖(Santacruz生物技术有限公司,美国)1 h在4°C。1小时后,每个样本的上层的分数被转移到新管和相应的抗体(2孵化μg / mL)一夜之间在4°C。孵化后的抗体,样本和40μ蛋白质的L / G +琼脂糖在4°C 2 h。样本主题与PBS microcentrifugation然后洗3次。清洗步骤后,样本混合15μL 2 x SDS样品缓冲,然后进行免疫印迹分析。

2.10。染色质免疫沉淀反应化验

芯片进行了化验使用放大芯片根据制造商的指示。与非瑟酮治疗后的细胞,这些细胞被离心机,媒介是吸气。细胞被洗两次PBS(10毫米,pH值7.4)和固定用新鲜固定解决方案(37%甲醛)在室温下10分钟,其次是甘氨酸stop-fix解决方案。细胞被洗两次冷PBS, PBS和丢弃的细胞被刮倒,颗粒状的离心10分钟7000转4°C。细胞被resuspended在100年μL的冰冷的裂解缓冲5分钟孵化冰上紧随其后。球旋转下来10分钟在5000 rpm。染色质是我们优化剪切使用大功率声波降解法使用条件(16个周期;30脉冲30年代每30年代在冰之间的脉冲)DNA平均大小为500 bp和溶菌产物在13000年通过离心10分钟在4°C。对于每一个芯片,用染色质总量(100年的十分之一μ使用L)。免疫沉淀反应进行一夜之间在4°C 5μg p300的抗体。磁珠(20 Chromatin-antibody复合物被抓获μL),染色质是筛选了如制造商的指示所述。交叉连接,被逆转,DNA纯化蛋白酶k DNA多聚酶链反应(PCR)检测结果进行了分析。

2.11。聚合酶链反应

DNA浓度测量spectrophotometrically 260海里。DNA进行PCR。p300抗体是购自圣克鲁斯生物技术。引物序列的扩增肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α):转发:5′-CCTCCCAGTTCTAGTTCTATC-3′和反向:5′-GGGGAAAGAATCATTCAACCAG-3′。5分钟后PCR进行变性在94°C,和重复周期94°C, 55°C为每个30年代和72°C 45 s;35周期的特定的引物组。PCR产品含有溴化乙锭1.5%琼脂糖凝胶电泳。

2.12。统计分析

每个实验进行了至少3次。结果表示为均值±标准差(SD)。使用学生的统计分析以及,被设定为统计意义对一些分析和为他人。他们分别表示数据。

3所示。结果

3.1。有毒的非瑟酮对单核细胞在高血糖的影响

非瑟酮的化学结构如图1(一)。我们调查的细胞毒性效应非瑟酮高glucose-induced THP-1细胞,使用CCK-8试验(图1 (b))。没有观察到毒性浓度的非瑟酮3至10μ米,48 h的治疗。我们所有的实验进行了后者,无毒非瑟酮的浓度范围(图1 (b))。

3.2。非瑟酮对促炎细胞因子分泌的影响在单核细胞在高血糖的情况下

我们检查是否非瑟酮可以抑制促炎细胞因子的基因,如肿瘤坏死因子-α和il - 6, high-glucose-treated THP-1细胞。在高血糖的情况下,炎性细胞因子释放显著增加而在正常血糖状况。甘露醇作为hyperosmolar控制和不影响细胞因子的释放。如图2(一个),治疗非瑟酮显著抑制TNF - glucose-induced mRNA表达水平高α和il - 6。确认非瑟酮对促炎细胞因子的表达的影响,文化传媒是TNF -化验水平ELISA、核溶解产物受到免疫印迹分析。如数据所示2 (b)和2 (c),非瑟酮显著降低细胞因子的分泌,TNF -α高血糖的条件下,在人类单核细胞。

3.3。非瑟酮的调节效应在帽子和高血糖的条件下HDAC单核细胞的活动

我们接下来的机制解决非瑟酮抑制单核细胞的细胞因子基因表达。获得的差别进一步洞察fisetin-induced机制对这些炎性细胞因子,我们首先检查是否非瑟酮治疗调节帽子和HDAC活性,用ELISA。如图3,在高血糖的条件下,显著增加帽子活动相比,HDAC活性,降低正常葡萄糖条件()。有趣的是,非瑟酮治疗结果的差别明显对这些帽子和upregulation HDAC活性()。高葡萄糖水平激活转录因子,如NF -κB,招聘的转录共激活剂分子CBP / p300,具有内在的帽子的活动。结果增加组蛋白乙酰化和DNA解除允许访问DNA, RNA聚合酶导致炎性基因表达。如图3 (c)高血糖的条件下,THP-1细胞培养显示标记upregulation p300及其乙酰化水平,与细胞培养在正常血糖状况。D甘露醇对p300没有影响。如图3 (c)p300激活被废除,非瑟酮(10μ米)治疗。非瑟酮也减少了乙酰化的水平CBP / p300 high-glucose条件、水平正常葡萄糖条件下所观察到的类似。没有观察到的效果和DMSO(0.1%)车辆控制治疗。

3.4。非瑟酮对NF -κ高血糖的条件下B p65激活单核细胞

组蛋白乙酰化与NF -增加有关κB激活导致增加乙酰化RelA / p65 NF -亚基κB (3]。因此,我们研究p65的非瑟酮对乙酰化作用的影响和随后的NF -κB激活,high-glucose条件下。我们观察到非瑟酮导致显著降低乙酰化和磷酸化的NF -κBp65核派系(图4)。

3.5。非瑟酮对p300与炎症反应之间的相互作用的基因

进一步了解fisetin-mediated抑制炎症的机制,我们研究了影响p300和NF -之间的互动κ如图5,非瑟酮减少p300的交互与NF -乙酰化的形式κB和TNF -α。这是与降低TNF -α在单核细胞基因转录HG条件。

3.6。非瑟酮对染色质事件的影响在炎症基因的启动子

确认非瑟酮的表观遗传调控炎症,我们下一个使用芯片分析进一步研究是否可以绑定到p300的倡导者NF -κHG条件下B-related炎性细胞因子基因。芯片化验表明,HG增加了招聘的p300 TNF -α启动子。如图6,非瑟酮减少p300的绑定TNF -启动子区域α。这是与降低TNF在HG条件下单核细胞转录。

4所示。讨论

糖尿病是一种炎性疾病和慢性炎症在糖尿病并发症的发展中起着重要的作用。高血糖已经与几位糖尿病并发症的主要因素2,3]。

THP-1单核细胞或人类外周血单核细胞培养high-glucose条件下是一个有关细胞培养模型研究高血糖。高葡萄糖水平是已知的炎症细胞因子的诱导表达TNF -α、趋化因子、单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1),在这些细胞的氧化应激,NF -κB -, AP-1转录因子依赖的方式(6,7]。我们最近发现,高血糖诱导释放促炎细胞因子(il - 1、il - 6和TNF -α在单核细胞通过一个NF -κB-dependent通路(6- - - - - -8,33,34]。系统性的促炎细胞因子水平,包括TNF -α,il - 1βil - 6,升高1型和2型糖尿病患者(9,34,35]。近年来,一些临床和动物研究表明,炎性细胞因子发挥重要作用在糖尿病并发症的发展和进展36]。

NF -κB细胞因子的表达起着至关重要的作用,包括TNF -α和il - 6 (9,35- - - - - -39]。施密德等人报道,NF -κB中扮演着一个关键的角色在糖尿病并发症调节转录的基因参与炎症反应(40]。组蛋白乙酰化作用的NF -κB目标基因通常是增加转录因子对其响应的绑定元素和活跃转录(14]。帽子和hdac发挥重要作用在调节炎性反应。

膳食多酚的抗氧化和/或抗炎作用已被证明在控制NF -扮演一个角色κB激活或染色质重塑通过调制HDAC和帽子的活动,因此影响炎症基因表达(8,18,41- - - - - -43]。

非瑟酮是一个主要的类黄酮具有广泛的药理作用,如抑制血管生成,以及抗癌、antiallergenic和抗甲腺的活动(44- - - - - -47]。非瑟酮已报告下调肝糖分解和糖质新生在体外(30.]。此外,最近的研究显示降糖活性的非瑟酮在体外实验糖尿病大鼠(48,49]。然而,它的具体监管机制在染色质水平在糖尿病条件下不知道。

本研究的目的是确定非瑟酮可以用作治疗剂用于治疗炎症,导致糖尿病引起的并发症。我们研究了非瑟酮的作用在调节高glucose-mediated促炎细胞因子(il - 6和TNF -α释放),帽子和HDAC调制,转录因子NF -转译后的修改κB在high-glucose-treated THP-1细胞。

生产活性氧被牵连是高血糖的损伤的诱发因素(50- - - - - -52]。活性氧改变核组蛋白乙酰化和脱乙酰作用平衡,从而增加了NF -κB-dependent基因表达的促炎介质(51- - - - - -53]。NF -κB中扮演一个重要的角色在促炎与几个相关基因的调控炎症疾病,包括动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、代谢综合征和糖尿病及其并发症(9]。p65蛋白NF -是一个关键组成部分κB激活和其transactivation潜力增强几个辅活化因子,包括CREB-binding蛋白质/ p300、p / CAF和SRC1拥有帽子活动(54- - - - - -57]。此外,乙酰化作用的p300 Lys1499帽子已被证实能提高其活动和影响各种各样的信号事件(58]。海关与边境保护局/ p300-mediated hyperacetylation RelA NF -是至关重要的κB激活。五个主要p65乙酰化网站已确定。乙酰化作用在p65 Lys221提高DNA结合并抑制其与我互动κBα,而乙酰化作用的Lys316 p65(需要完整的转录活动57]。因此,p65衰减的乙酰化是一个潜在的预防慢性炎症的分子目标9]。

我们发现,非瑟酮治疗抑制NF -的表达κ目标基因,包括il - 6和TNF -α在high-glucose-treated THP-1细胞。我们也显示新的数据支持fisetin-mediated抑制高血糖诱导p65乙酰化作用,从而抑制NF -κB转录活动。我们还观察到非瑟酮可以抑制炎症通过upregulation HDAC活性HG-treated THP-1细胞。

相比之下,非瑟酮抑制帽子活动,防止NF -κB-mediated染色质乙酰化作用和随后的细胞因子的转录高血糖的条件。非瑟酮也减少了p300表达以及它与NF -交互κb .因此,非瑟酮似乎抑制炎性细胞因子通过至少部分NF -κ通过诱导B信号通路HDAC活性和抑制帽子HG条件下活动。

总之,高葡萄糖水平激活帽子(p300)和减少HDAC活性,导致增加p65的乙酰化作用。p65乙酰化作用,反过来,诱发NF -κil - 6和TNF - B和转录激活α在单核细胞。非瑟酮治疗细胞毒性在30岁μ米在单核细胞高血糖(数据没有显示)。我们观察到,3 - 10μM是无毒的,我们使用非常有效浓度(0、3、6、10μ米)。管理非瑟酮对细胞培养在高血糖的条件下可以激活hdac抑制帽子,尤其是p300,导致脱乙酰作用p65亚基的NF -κb .因此,非瑟酮政府抑制促炎细胞因子释放。它可能因此被视为用于糖尿病的预防措施。未来的研究需要揭示特定的染色质事件和非瑟酮引起的分子机制在高血糖的条件。

5。结论

在最近的研究中,我们假设通过NF -非瑟酮抑制促炎细胞因子的分泌κB信号通路,通过改变组蛋白乙酰化和脱乙酰作用之间的平衡。管理非瑟酮对细胞培养在高血糖的条件下可以激活hdac抑制帽子,尤其是p300,导致脱乙酰作用p65亚基的NF -κb .因此,非瑟酮政府抑制促炎细胞因子释放。据我们所知,这是第一个报告分析糖尿病条件下其分子作用机制。理解这些机制在建立非瑟酮作为至关重要的自然治疗剂治疗慢性炎症与糖尿病及其并发症有关。

确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科学和技术(没有。2011 - 0014061)。