文摘
的功效Ferulsinaic酸(FA)调节抗氧化酶,减少氧化应激induced-diabetic肾病(DN)进行了研究。老鼠的饮食富含蔗糖(50%,wt / wt),猪油(30%,wt / wt)、胆固醇(2.5%,wt / wt) 8周诱导胰岛素抵抗。后一个DN模式是由链脲霉素诱导;5、50和500毫克/公斤的足总被口服胃内的管理插管为12周。葡萄糖在FA-treated糖尿病大鼠,肾/体重比,肌酐,包子,albuminurea,肌酐清除率显著下降而非治疗糖尿病大鼠。糖尿病大鼠SOD显示减少活动,谷胱甘肽;丙二醛和血清中il - 6的浓度增加,肾脏,并增加水平的8-hydroxy-2′脱氧鸟苷在尿和肾皮质。FA-treatment恢复以剂量依赖性的方式改变参数。超形态学异常在糖尿病大鼠的肾脏被足总治疗明显改善。此外,足总酸被发现减弱慢性炎症引起的卡拉胶和右旋糖酐老鼠。 We conclude that FA confers protection against injuries in the kidneys of diabetic rats by increasing activities of antioxidant enzymes and inhibiting accumulation of oxidized DNA in the kidney, suggesting a potential drug for the prevention and therapy of DN.
1。介绍
糖尿病(DM)是一种危及生命的代谢紊乱和疾病正在成为一个严重的社会问题。高血糖是糖尿病并发症的主要原因,如视网膜病变、肾病、神经病变(1,2]。
糖尿病肾病(DN)的特点是结构异常包括两个肾小球肥大和管式元素,在肾小球基底膜的厚度增加,逐步积累的细胞外基质成分3]。它也导致功能改变,包括早期肾小球滤过率增加intraglomerular高血压,随后的蛋白尿,系统性高血压,最终失去肾功能(3]。不可逆转的肾功能变化在糖尿病的发展阻力指标纤维化最终结果也许可以如肾小球硬化症和结束阶段肾脏疾病(1]。虽然适当的控制血糖水平可能防止并发症的发展,很难实现严格的血糖控制,导致每年的增加糖尿病患者的数量(4]。
虽然DN的机制尚未阐明,因为糖尿病的病理生理学的复杂性,许多因素参与已报告,包括激活肾素-血管紧张素系统(5),激活蛋白激酶Cβ(6),激活kaba核因子B (NF -κB) (7),增强形成先进的糖化终端产品(年龄)8,加速氧化应激(9]。许多实验证据表明,自由基参与糖尿病的发病机制10)在糖尿病并发症的发展,更重要的是(11]。自由基能够破坏细胞分子,DNA、蛋白质和脂质导致细胞功能改变。许多最近的研究表明,抗氧化剂能够中和自由基是有效预防实验诱导糖尿病动物模型(12,13)以及减少糖尿病并发症的严重程度(11]。阿魏酸,植物细胞壁的一种抗氧化剂,据报道,防止功能和病理异常在糖尿病大鼠的肾脏减少氧化应激和炎症(14,15]。
许多植物的化合物合成一个数组没有参与他们的主要代谢。这些“次生化合物”,而不是多种生态服务功能,最终提高植物的生存压力。此外,这些化合物可能负责的有利影响水果、蔬菜和许多植物在数组与健康有关的措施。传统的草药已经雇佣了数千年,大大促进了预防和治疗各种疾病,包括糖尿病。他们仍然有价值的对人类健康和获得关注的潜在来源的新治疗药物由于其多种多样的生物活性、低毒性(16]。竹板sinaica L。(伞形科)有130种分布在整个地中海地区和中亚。这些植物在埃及用作香料和局部药物的制备。据树脂用于胃疾病如解热药和驱风剂剂和治疗皮肤感染和歇斯底里17]。以前的工作表明,该属的主要成分是倍半萜烯和倍半萜烯香豆素类(18]。Ferulsinaic酸(FA)是第一个成员,一个新的重新安排的倍半萜烯类香豆素类属教鞭。它是独立于f . sinaica L。FA的分子式是C24H30.O5。FA的结构建立在先前的研究小组(我们的工作19)如下显示方案1。
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提取的f . sinaica发现抑制兔空肠的自发运动和豚鼠回肠和乙酰胆碱引起的收缩。提取也抑制了兔气管平滑肌的收缩引起乙酰胆碱刺激和组胺引起的豚鼠气管平滑肌的收缩刺激。此外,提取抑制去甲肾上腺素刺激引起的兔主动脉的收缩20.]。此外,提取f . sinaica抑制的自发运动大鼠和豚鼠子宫平滑肌的收缩引起催产素刺激和有一些antioxytocic潜力(21]。
足总被发现野生型的延长寿命秀丽隐杆线虫(秀丽隐杆线虫)在标准条件下。此外,热应力和诱导阻力的化学应力秀丽隐杆线虫被改善。此外,足总被发现减弱形成活性氧(ROS)和先进的糖化终端产品(年龄)秀丽隐杆线虫(22]。
在目前的研究中,抗氧化能力以及抗炎效果的检查来评估其疗效减弱活性氧生产、炎症、调节糖尿病肾脏抗氧化酶的老鼠。
2。材料和方法
2.1。动物
成年男性白化大鼠体重180 - 200克是本研究中使用。动物被关在笼子里或收到正常的鼠粮和自来水随意在一个持久不变的环境里(室温°C,湿度)12 h光和12 h暗周期。动物们一直在观察一个星期前开始实验。
2.2。隔离和FA的净化
风干的根源F。sinaica收集从北西奈半岛,埃尔阿里什埃及。15公斤的F。sinaica地面和提取了CH2Cl2在室温下。提取集中获得1100 g的残渣。残留的分馏是硅胶CC(6·120厘米)筛选了己烷,其次是与hexane-CH梯度洗脱2Cl2CH高达100%2Cl2最后与CH2Cl2甲醇(85:15)。的hexane-CH2Cl2提取(1:140 g)是由高效液相色谱纯化(MeOH-H2啊,73:27)负担FA(100毫克)19]。
2.3。感应的DN模型和研究设计
七十只老鼠被用于实验。老鼠的饮食富含蔗糖(50%,wt / wt),猪油(30%,wt / wt)、胆固醇(2.5%,wt / wt) 8周诱导胰岛素抵抗。十大鼠作为对照组(组1,),它接收一个尾静脉注射柠檬酸0.1 mol / L的缓冲。一群60大鼠静脉注射注射STZ(65毫克/公斤体重),在0.1 mol / L刚做好的柠檬酸缓冲(pH值4.5),在禁食12小时。只有大鼠血糖高于200 mg / dL 5天后将被认为是糖尿病的空腹状态下,通过使用一个联系选择分析仪(英国生活扫描,Inc .)。老鼠的血糖低于200 mg / dL被排除在研究之外。所有的研究进行了一个星期后注射STZ。五十糖尿病大鼠随机分为5组:DN,糖尿病和盐酸二甲双胍治疗(MF)(125毫克公斤−1d−1;DN + MF) (23)、糖尿病和ng接受低剂量(5公斤−1d−1)的FA (DN + FA1),糖尿病与中等剂量和治疗ng(50公斤−1d−1)的FA (DN + FA2)和糖尿病治疗高剂量(500 ng公斤−1d−1)的FA (DN + FA3)。LD的50足总被发现2μ克/公斤。MF和FA管理与蒸馏水通过胃内的插管。继续治疗12周。定期测量体重和血糖水平。在实验的最后,用乙醚麻醉动物被牺牲了。肾脏解剖和冲洗冷PBS然后重。肾脏肥大指数估计通过比较左肾的湿重的体重。
2.4。肾脏匀浆制备
每个肾脏组织切成小块,洗了磷酸盐。此外,它磨在同质化缓冲{0.05 Tris-HCl pH值7.9,25%的甘油,0.1毫米EDTA,和0.32米(NH4)2所以4}含有蛋白酶抑制剂的平板电脑(罗氏公司、德国)。溶菌产物是使用Polytron均质机均质在冰上。解决方案一直在用冰浴,防止过热15秒之后,在12000转离心,4°C 5分钟。浮在表面的整除,储存在−80°C和化验蛋白质浓度用BCA试剂盒(美国罗克福德皮尔斯)使用白蛋白稀释溶解缓冲区作为标准。匀浆是用于测定谷胱甘肽(GSH)降低,脂质过氧化水平(MDA)的浓度Nε羧甲基赖氨酸(CML)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性,和il - 6水平。每组的其他肾脏用于组织病理学检查,测定年龄,水平和孤立肾的DNA。
2.5。血液采样和分析
老鼠的血液样本在2000 g离心10分钟在4°C,和整除各自分析决定。等离子体的诊断工具决定的葡萄糖水平,肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)测定,钠,钾从生物系统购买(西班牙巴塞罗那)。所有分析按照制造商提供的说明书。
2.6。尿液分析参数
将收集的尿液样本个体代谢的笼子里的老鼠24小时前糖尿病被诱导和治疗结束前的那一天。尿液白蛋白浓度测定的酶联免疫试剂盒(Exocell Nephrat II,费城,宾夕法尼亚州,美国)和集中尿液样本中铬的浓度是由商业分析工具。所有分析按照制造商提供的说明书。24小时尿白蛋白排泄率(阿联酋)被计算为阿联酋(μg 24小时−1)=尿白蛋白(μ克毫升−1)24小时尿量(mL)。Cr间隙(Ccr)计算使用以下方程:Ccr (mL分钟−1公斤−1)=(尿铬(mg dL−1)尿量(mL) /血清铬(毫克dL−1))(1000 /体重(g))(1/1440(分钟))(24]。
2.7。确定酶的活动
的活动总SOD (EC: 1.15.1.1)以及MDA的含量、谷胱甘肽在肾脏匀浆测定使用商用工具从BioVision研究产品(琳达Vista大道,美国)根据Nishikimi描述的方法等,和赛义德25,26];Ohkawa等人,Mekheimer et al。27,28),和白痴et al。29日),分别。
2.8。测定il - 6
血清中il - 6浓度和肾脏匀浆是由一个酶联免疫试剂盒。执行的ELISA测定il - 6从研发使用商用工具(德国曼海姆)根据制造商的指示。
2.9。测量尿和肾8-Hydroxy-2′脱氧鸟苷
尿8-hydroxy-2′脱氧鸟苷(8-OHdG)水平测定使用的酶联免疫吸附试验装备Genox公司(美国马里兰州巴尔的摩。)根据Matsubasa等的方法。30.通过使用个人尿肌酐浓度)和纠正。肾DNA的提取进行了使用DNA提取工具(Promega、德国)后,制造商的协议。肾组织基因组DNA样本也用于8-OHdG使用竞争性酶联免疫试剂盒的决心。
2.10。肾的年龄层次
肾年龄水平决定根据前一个方法用细微的修改31日,32]。切碎的肾脏组织delipidated氯仿和甲醇(2:1,v / v)。洗后,组织均质在0.1 n氢氧化钠,紧随其后的是离心的8000克15分钟在4°C。碱溶样品的数量的年龄是决定通过测量荧光的发射波长440 nm和激发波长370 nm)使用荧光分光光度计(日立、日本)。一个本地牛血清白蛋白(BSA)制备(1毫克毫升−10.1 n氢氧化钠)是作为一个标准。样品测定的荧光值1毫克的蛋白质浓度毫升−1并表示在非盟与本地BSA准备。
2.11。评估肾CML
肾脏匀浆上清液的检测使用anti-CML CML鼠自体抗体酶联免疫试剂盒采用半定量的酶免疫测定技术。由此产生的黄色产品的吸光度测量在450纳米33]。
2.12。组织病理学检查
肾组织收集动物祭祀后,10%福尔马林固定,常规处理,嵌入石蜡。5 -μ米厚的部分准备和沾过碘酸希夫(PAS)。肾小球和系膜病变组织病理学改变是在任期的肾小球系膜扩张(系膜基质增加)34]。
为了评估FA在急性炎症的抗炎活性,carrageenan-induced老鼠爪子水肿和dextran-induced鼠爪子水肿被杂志估计所述et al。35)与轻微的修改。
2.13。Carrageenan-Induced老鼠爪子水肿
三十老鼠被分成5组,每6老鼠。足总在5、50和500 ng /公斤,消炎痛10毫克/公斤体重在橄榄油口头给老鼠注射角叉菜胶前30分钟。同样体积的车辆给对照组。的左后方足底地区老鼠注射0.1毫升的卡拉胶在盐水(1%)。决心通过测量产生的水肿爪子直径的差异使用一个模拟的pakimeter(游标)之前,卡拉胶注入和(0)3和5 h后注射角叉菜胶。
2.14。Dextran-Induced老鼠爪子水肿
爪子水肿是诱导在正确的后爪subplantar注入0.1毫升的刚做好的1%右旋糖酐的解决方案。爪厚度测量(0、45和葡聚糖注射后90分钟。上面的老鼠被视为。抑制的百分比计算。
2.15。统计分析
所有组值表示为均值±SD。σ数据评估使用Stat(版本13.0)统计分析程序(通过使用SPSS 11.09对windows)。执行一个方差分析测试最初来测试不同的治疗。方差分析后,图基事后测试进行检查是否有任何不同治疗组间的显著差异,是水平的意义。
3所示。结果
3.1。FA治疗对血糖的影响和肾/体重比
数据表1表明,注射STZ增加了近5倍的白化大鼠空腹血糖水平。为期12周的时期,年底的最后肾/体重比值明显高于未经治疗的糖尿病动物的控制动物()。FA-treated糖尿病动物显示肾/体重比显著减少,而走到曼氏金融集团的水平与糖尿病动物()。此外,还有一个显著相关(剂量组之间)。
3.2。足总治疗对肾脏功能的影响
表1表明,面包,肌酐,24小时Upro,钠,钾,Ccr DN组水平明显高于正常对照组()。FA的低剂量明显减少Upro,钾,Ccr DN组,但没有减少血清包和可控硅。FA的中、高剂量明显减少了所有先前上市的DN大鼠肾脏功能参数()。
3.3。FA治疗对活动的影响抗氧化酶和氧化应激的标记
SOD的活性和谷胱甘肽的浓度降低,而MDA浓度是肾脏匀浆的DN组高于对照组(),这表明这些老鼠遭受氧化应激(表2)。治疗中、高剂量的FA显著降低MDA的含量,显著增加SOD活性、谷胱甘肽浓度()。这些结果表明,FA改善在DN大鼠氧化应激。盐酸二甲双胍显著增加抗氧化酶的活动()。
3.4。足总治疗对血清和肾il - 6的影响
糖尿病显著增加炎症的程度和释放il - 6在DN组与正常对照组相比()。对待动物与FA和二甲双胍明显减毒炎症和il - 6生产所有治疗组的血压与DN组(),表1和2。
3.5。足总对肾的影响年龄和CML
结果糖尿病肾功能水平的年龄和CML STZ-diabetic老鼠明显升高。这些高浓度被足总有效降低剂量依赖性的方式治疗12周(表2)。
3.6。FA治疗尿和肾8-OHdG的影响
尿8-OHdG排泄的总数量明显大于STZ-induced比控制大鼠糖尿病大鼠糖尿病的发病后12周()。管理FA抑制尿排泄的增加糖尿病老鼠的8-OHdG MF(一样的程度)。与尿的结果,DNA 8-OHdG的水平在糖尿病大鼠的肾脏明显增加,而增加被足总逆转治疗()。此外,这些增加的大小降低了FA治疗剂量依赖性的方式(;数据1(一)和1 (b))。
(一)
(b)
3.7。组织病理学研究
肾小球的显著扩大,荚膜基底膜增厚(cbm),肾小球基底膜(本研究)和肾小管基底膜(掘进机),增加了大量的系膜基质,管状扩张是糖尿病治疗的大鼠(图中观察到2 (b))。在未经治疗的糖尿病大鼠肾脏组织学显示加速系膜扩张,增厚的煤层气,本研究,隧道掘进机,以增加PAS-positive面积与对照组相比(数字2(一个)和2 (b))。治疗大鼠FA和MF减少肾小球大小,煤层气的增厚,本研究,隧道掘进机,增加了大量的系膜基质,管状扩张与对照组相比,糖尿病大鼠(数字2 (c)- - - - - -2 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.8。足总在急性炎症的影响
在carrageenan-induced炎症大鼠模型中,足总浓度5、50和500 ng /公斤抑制水肿形成第三小时38% (),42%和57% ()以剂量依赖的方式,分别。这些影响也扩展,大大增加了第五个小时()。此外,在dextran-induced炎症模型中,足协在45分钟抑制爪子水肿42%,49%,57% ()的抑制浓度的5,50和500 ng /公斤,分别。在90分钟,有一个百分比的增加抑制了47%,53%和62%,分别如表所示3(一)和3(b)
4所示。讨论
DN是一种重要的糖尿病微血管并发症。高血糖可以导致增加活性氧(ROS)生产和自由基清除化合物的衰减36]。在目前的研究中,证实了DN的发展重要的海拔肾/体重比,可控硅,钠,钾,和面包以及Upro糖尿病老鼠,早些时候报道的其他团体(14,15,23,28,37]。氧化应激也会影响核酸DNA碱基导致修改。8-Hydroxy-2′脱氧鸟苷是一种DNA损伤的主要产品,并测量其血清或尿水平提供信息在DNA水平上不同程度的氧化应激(38]。尿8-OHdG排泄明显增加糖尿病的发病后12周。此外,肾皮质显示明显高表达8-OHdG DNA。此外,我们第一次发现这种氧化损伤足总治疗剂量依赖性的方式。此外,根据获得的数据,尿和肾8-OHdG DN组显著高于对照组,这表明观察到肾损伤归因于高8-OHdG水平在糖尿病肾脏。然而,FA政府阻止上述所有功能和形态学变化和保持他们接近正常。获得的数据表明FA施加对糖尿病大鼠的肾损伤的保护作用通过抑制肾脏氧化DNA的积累。
氧化应激影响DN的发病机制,不仅通过活性氧的生产过剩,也通过抗氧化酶活动的减少,脂质过氧化物的形成,和非酶的蛋白质糖基化。抗氧化剂酶是诱导防止细胞和组织损伤。ROS的产生和抗氧化剂之间的不平衡被认为是参与diabetes-induced肾功能衰竭(38]。诱导糖尿病的研究引起了相当高度的MDA和SOD活性和降低肾脏,中谷胱甘肽浓度与对照组相比。FA为期12周治疗逆转这些氧化剂/抗氧化参数。氧化损伤的逆转由于FA显示为抗氧化酶和表明它可能的抗氧化性能,起着至关重要的作用在对抗氧自由基。获得的数据与以前的工作(14,15,39]。
高血糖条件导致不可逆转的组织损伤的蛋白糖化反应,导致糖基化的蛋白质的形成和年龄(40]。年龄积累肾脏一直被视为一个索引进行性肾损害的DN。CML金属催化氧化过程中多不饱和脂肪酸形成的蛋白质(41]。因此,CML可以作为一般生物碳水化合物和脂质氧化造成的氧化应激反应。年龄有能力激活NF -κB信号通路的调节等许多炎症基因的表达il - 6 (8,42]。为了验证这个假设,我们测量年龄,CML, il - 6在不同的组。实际上,不仅年龄的过度,但也更高水平的il - 6在糖尿病治疗大鼠肾脏被12周的FA治疗缓解。似乎FA不仅AGE-RAGE信号,而且影响NF -κB-IL-6-dependent通路在某种程度上,从而导致减弱引起的肾损害蛋白糖化反应。
为了测试FA的直接抗炎作用,我们测量的影响大鼠角叉菜胶引起的急性炎症和右旋糖酐。足总被发现产生抗炎效应获得支持数据在糖尿病大鼠il - 6的测量。
控制高血糖的糖尿病患者胰岛素或其它血糖过低的代理和减少氧化应激,ROS生产和炎症导致糖尿病并发症尤其是DN的衰减。所有这些结果支持我们的假设,足总对氧化损伤肾保护作用,这可能是由于其抗氧化/抗炎的潜力。因此,我们接受了我们的假设。此外,二甲双胍被选为一个积极的控制在目前的研究因其著名的低血糖症的效果。表1显示所有剂量的FA的降糖效果仍低于药物MF的积极。然而,高剂量的FA逆转所有的肾损伤,炎症和氧化/抗氧化状态几乎曼氏金融集团的水平。因此,我们的结果可能进一步了解糖尿病肾病的治疗策略。
确认
本文是由院长以来科研(域),阿卜杜拉国王大学,吉达,在批准号(34 - 130 d1432)。因此,作者感谢并承认安全域的技术和财政支持。作者希望迈克尔Morcos博士承认,内科我(内分泌、代谢和临床化学)医学院,Luprecht-Karls大学、德国海德堡提供的ELISA试剂盒和一些精细化学品的盛情和连续的建议。深要感谢Wafaee戈马博士,病理部门,医学院,阿卜杜拉国王大学KSA谁做组织病理学检查。