表儿茶素治疗肠道炎症的实验模型分析

摘要

背景．本研究探讨(-)-表儿茶素(EC)在防治急、慢性大鼠肠道炎症中的作用途径。方法．用TNBS诱导大鼠肠道炎症。检测结肠标本的形态学、炎症、免疫组化和免疫印迹特征。在一个急性模型中，以5、10、25和50 mg/kg的剂量灌胃5天来评估EC的影响。慢性结肠炎模型制作第1天，治疗21天。对于结肠炎复发模型，14日重复诱导。结果．从宏观上评估，EC10和EC50有效地减小了病变的大小;并经显微镜证实为EC10。EC10组谷胱甘肽水平升高，COX-2表达降低，细胞增殖(PC)增加，具有抗炎和促增殖作用。在慢性结肠炎模型中，EC10表现为肉眼和显微镜下病变评分较低，谷胱甘肽水平升高。在急性模型中，COX-2表达减少，EC10中PC增加，慢性模型中这种增加可能是通过EGF表达途径。结论．这些结果证实了EC作为一种抗氧化剂的活性，可以减少损伤，并有可能刺激组织愈合，表明对预防和治疗肠道炎症有用。

1.介绍

结肠炎症可以由各种疾病和感染引起。炎症性肠病(IBD)是结肠和小肠的一组炎症条件，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。IBD的病因仍不清楚。它被认为与血液供应不足、自身免疫反应和易受感染有关。溃疡性结肠炎，与我们的实验模型最相似的疾病，在一些研究中表明是由黏膜免疫系统失调和基因易感个体的病理性T细胞反应引起的[1把它归类为一种自身免疫性疾病另一种假说认为溃疡性结肠炎开始时是粘膜屏障的一种障碍，而这种障碍可能是使结肠共生菌随后的攻击导致粘膜炎症的初始因素[2］．

目前可获得的溃疡性结肠炎的疗法包括糖皮质激素，磺基碱，5-氨基水杨酸，免疫抑制剂和抗TNF-α单克隆抗体;在某些情况下，结肠造口手术是唯一的选择[3.］．这些治疗并不是没有副作用，由于需要慢性治疗，副作用可能变得很严重，而慢性治疗是很常见的。因此，寻找替代疗法是至关重要的，为炎症区域提供有效的细胞保护的能力尤其重要。因此，我们测定了表儿茶素，这是一种在许多富含类黄酮的植物中发现的物质，例如Mouriri天Gardn。(Melastomataceae)，曾在本实验室进行研究[4，5］．在该植物提取物中发现的物质中，表儿茶素被选为本研究的对象，因为表儿茶素具有较强的抗氧化活性，通过干扰caspase信号链抑制细胞凋亡，被认为是一种重要的细胞保护剂[6］．Galvez及其合作者[7]发现表儿茶素能有效地抑制酶促和非酶促结肠炎中脂质过氧化作用在体外；这种抑制作用与它对谷胱甘肽酶系统的影响无关。因此，表儿茶素可能在清除结肠黏膜炎症中的自由基，从而帮助恢复过程中发挥重要作用。此外，表儿茶素可能通过影响脂加氧酶和环加氧酶的活性，抑制花生四烯酸介导的过氧化反应，表明其可能是IBD中的抗炎剂。

表儿茶素在预防癌症方面的作用也有报道;表儿茶素促进上皮细胞间缝隙连接的维持[8，有助于防止胃肠道病变发展为恶性病变。

我们的目标是通过对药用植物的研究确定药理活性物质，为胃肠道疾病提供新的治疗选择，从而促进巴西圣保罗州塞拉多植物区系的可持续发展。本研究的目的是通过对急、慢性结肠炎模型肠道病变的宏观、微观和生化分析，评估(-)表儿茶素在防治大鼠肠道炎症中的作用。(-)表儿茶素的抗炎和愈合作用将被评估。

2.材料和方法

2．1．动物

使用UNICAMP中心动物屋的雄性Wistar大鼠(200-250 g)。老鼠被喂食经认证的食物，可以免费饮用自来水，并被置于标准光照(12小时暗- 12小时亮)、湿度(12小时暗- 12小时亮)和湿度(12小时暗- 12小时亮)条件下。%)，温度(°C）条件。所有实验协议遵循议定书第02/04号议定书，所有实验协议遵循佛索···巴西（Botucatu）的Bioscience Institute of Sao-Botucatu，圣保罗州，巴西。

2．2.肠炎的诱导模型及治疗

选择的肠道炎症模型包括大鼠结肠内给药三硝基苯磺酸(TNBS)溶于0.25 ml 50%乙醇/水[9］．表儿茶素的剂量(5 - 50 mg/kg)是根据其他酚类化合物的剂量选择的，如其他黄酮类化合物和巴甲素，这些化合物在本实验模型中已显示出抗炎活性[10.，11.］．

在每个实验中包括TNB对照组（具有结肠炎症，但没有药理治疗的诱导）和无抗体对照组（不诱导炎症），以及阳性治疗组动物服用柳氮磺胺吡啶(100 mg/kg)。所有药物均溶于10%的酒精生理盐水中。实验的一般方案包括急性和慢性复发两种治疗方法，如下所述。

2.2.1。急性结肠炎

四组动物接受不同剂量(5、10、25和50 mg/kg)(-)表儿茶素口服，连续两天，在诱导结肠炎前以及诱导结肠炎前2小时和诱导结肠炎后24小时。表儿茶素溶解在10%的酒精生理盐水溶液中，灌胃给药。TNBS对照组和非结肠组的动物只接受了载体(10 ml/kg)。阳性对照组给予磺胺磺胺吡啶(100 mg/kg)。各组每日监测体重及腹泻发生情况。

2.2.2。结肠炎复发

在这个为期三周的实验方案中，如前所述，首先用10mg TNBS在50%乙醇中诱导结肠炎，然后在14天后再给动物注射10mg TNBS [12.］．将动物分成5组：两组分别接受每日10 mg / kg（EC10）或50mg / kg EPICATECHIN（EC50）的每次剂量;根据急性结肠炎实验的功效选择这些剂量。其他群体如下：无光泽（没有诱导结肠炎，也不会复发;动物接受10ml / kg载体），诱导TNBS对照（结肠炎和复发;动物接受10ml / kg载体），苏苯甲苯胺（结肠炎和复发）;动物接受100mg / kg磺基碱），并且TNBS控制无复发（结肠炎，但不复发;动物接受10ml / kg载体）。每组中的三分之一的动物在诱导结肠炎与TNBS诱导结肠炎后，在两周后处死三分之一，并在三周后处死剩余的三分之一（提交复发的那些）。三周后，没有复发组的TNBS控制完全牺牲了。

2．3.评估肠道炎症过程

在实验过程中，使用整体健康的各种标志物评估动物，例如食物消费，体重和腹泻的外观。在每种处理结束时，处死动物，除去其结肠，并使用宏观，生物化学，微观，免疫组化和免疫印迹方法评估其损伤。

2．4．宏观评估

根据Bell及其同事的描述，评估结肠的重量、肠道与邻近器官的粘附性以及肠道损伤的严重程度[13.］．

2．5．生化评估

从结肠组织样本中检测总谷胱甘肽[14.，髓过氧化物酶(MPO)活性[12.，碱性磷酸酶[15.]，总蛋白质含量采用双氰菊酸(BCA)法测定[16.］．

2.6。微观评估

在对结肠组织进行宏观评估后，立即取病灶灶附近0.5 mm组织标本进行组织学分析;6μ取M片，苏木精、伊红染色。显微镜检查的评分范围从0(无病变)到27,Stucchi和他的同事描述了[17.并由Camuesco及其同事进行了修改[18.］．

2.7。免疫组织化学

根据先前测量的参数，观察到影响最大的样本进行组织学评估。为准备组织进行组织学评估，将样品去脂、再水合，并在微波炉中使用0.1 M柠檬酸缓冲液在高温下进行抗原恢复10分钟。抗原恢复后，将玻片置于封闭液中30分钟。将玻片置于PBS稀释的一抗中。使用的主要抗体要么是COX-2 (Santa Cruz)，以评估炎症水平[19.- - - - - -21，或PCNA (proliferation Cell Nuclear Antigen，增殖细胞核抗原)(Santa Cruz)，一种细胞分裂标志物，用来评估组织再生水平。然后在PBS中洗涤，生物素化二抗孵育，再次洗涤，然后用vecastain与ABC试剂(亲和素-生物素过氧化物酶复合物)孵育，再与DAB(二氨基联苯胺)孵育。使用徕卡显微镜分析得到的载玻片;0.32毫米²田野是用徕卡Q-Win软件捕捉的。使用AVSoft BioView 4软件进行定量。

2.8。电泳和免疫印迹分析

从肠道中提取的蛋白质样本用布拉德福德法进行了定量[22]和大约50个μ采用7.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对每lane蛋白进行拆分。迁移后的蛋白进行免疫印迹。对于急性结肠炎模型的样本，抗hsp -70(热休克蛋白70)一抗[23，24使用了)。对于慢性结肠炎复发模型的样本，表皮生长因子[25]和诱导型一氧化氮合酶iNOS [26，27使用抗体。

2.9。统计分析

结果以均数±均数标准误差表示。先用方差分析(ANOVA)检验均数之间的差异，然后再进行显著性检验。非参数数据(分数)以中位数和四分位范围表示，并由Mann-Whitney分析U测试。频率数据由χ²测试。的值被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.急性结肠炎的诱导与治疗

诱发急性结肠炎后，根据病变的宏观分析给每个样本打分。这些评分显示了10 mg/kg (EC10)和50 mg/kg (EC50)剂量表儿茶素降低病变严重程度的有效性1)与非结肠炎组比较。这些结果通过对EC10剂量组的病变进行显微镜分析得到了证实(见表)1)．


	Non-colitic	TNBS控制	EC 5	EC 10	EC 25	EC 50	磺胺类。

宏观的分数	0 *	9 (1.25)	8 (1)	7 (1) *	7.5 (1)	7 (0.5) *	8 (1.5)
微观的分数	0 *	19日(1.5)	18 (1.0)	15 (1.5) *	18 (3.5)	16 (2.0)	16 (1.0)

结果以中位数表示(四分位数范围)。Kruskal-Wallis-Mann-Whitney, *P< 0.05相对于检查。n= 5 - 8。EC 5 - 50:表儿茶素，剂量5 - 50 mg/kg;磺胺类。:柳氮磺胺吡啶。

结肠炎的诱导导致体重增加减少，结肠重量增加，结肠长度减少。这些变化在所有结肠炎的组中是相似的，不管治疗(数据未显示)。

TNBS对照组的组织学分析显示粘膜溃疡和紊乱，固有层和粘膜下层的水肿增加(图)1)．与TNBS对照组相比，EC10和EC50处理组的组织形态组织更接近非结肠组，表现出更少的溃疡和组织紊乱。用EC5和EC25治疗组出现溃疡，固有层和粘膜下层水肿增加。

３．２．急性结肠炎模型的生化分析

生化分析提供了EC在用EC10处理的大鼠结肠组织中的可能作用机制的信息(EC10降低了宏观和显微镜下的评分)。这一组的谷胱甘肽水平明显高于TNBS对照组(见表)2)．结肠炎治疗组与TNBS对照组在其他分析参数(MPO、碱性磷酸酶和总蛋白)方面没有发现差异(表)2)．


	谷胱甘肽(nmol / g)	MPO (U / g)	碱性磷酸酶(mU/mg蛋白质)

Non-colitic	1555±107.83 *	16.98±4.63 *	8.43±0.79 *
TNBS控制	954.73±69.74	1780 .19±263.77	17.21±1.16
EC 5	1035±72.95	1975 .90±294.86	20.78±1.98
EC 10	1176 .55±46.34 *	1876 .74±243.27	17.83±1.30
EC 25	1130 .95±42.46	1,973.38±178.27	20.04±2.71.
EC 50	1127±35.36	1806点±219.35	20.47±2.02
柳氮磺胺吡啶	1104 .60±22.33	1814 .55±214.46	20.49±2.01

与TNBS对照组比较，结果为平均值±E.P.M.方差分析dunnet， *P< 0.05。n= 5 - 8。EC 5 - 50:表儿茶素，剂量5 - 50毫克/公斤。

3．3．急性结肠炎模型的免疫标记分析

免疫组化对抗COX-2(图2)显示，与TNBS对照组相比，EC10(评估的唯一剂量，因为它提供了最大的效果)导致COX-2表达显著下降(表3.)．PCNA抗体标记(图3.)显示，与TNBS对照组相比，EC10组中该肽的表达增加(表1)3.)．


	cox - 2 (米²/毫米²）	PCNA(细胞/毫米²）	hsp - 70(俄文)

Non-colitic	4058 .65点±3356.31 *	249.21±18.49 *	4.61
TNBS控制	24207 .99±2614.22	399.34±19.43	335.70
EC 10	9257 .06点±3110.30 *	572.83±15.69 *	456.28
柳氮磺胺吡啶	14635 .04点±2039.01 *	372.52±24.85	541.07

结果为均值±E.P.M.方差分析- dunnet。＊P与TNBS对照组相比< 0.05。n= 5 - 8。EC 10:表儿茶素，剂量10mg /kg。俄罗斯:随机单位。

（一种）

（b）

(c)

(d)

（一种）

（b）

(c)

(d)

免疫印迹法(immunoblotting)观察到，来自EC10和TNBS对照组的样品中HSP-70的表达没有差异(图)4)．

3.4。复发性慢性结肠炎的诱导和治疗

我们使用两个治疗组评估慢性结肠炎，基于观察10和50 mg/kg剂量EC在急性试验中有最佳的治疗效果。在三周实验的每一周结束时，记录病变的肉眼评分。在急性试验中，使用EC10治疗组的评分明显低于TNBS对照组(见表)4)，包括复发后发生的。在第三周(复发后)，EC10治疗组与TNBS对照组评分无复发相比，其他结肠组评分无显著差异。


	1星期得分		第二周得分		第三周得分
	宏	微	宏	微	宏	微

Non-colitic	0 *	0 *	0 *	0 *	0^{* #}	0^{* #}
TNBS控制	6 (1.5)	18 (2)	6 (1.5)	19日(2.5)	5.5 (1.75)^＃	18.5 (1)^＃
EC 10	4 (1) *	14 (1.5) *	2 (1) *	13（2）*	3 (1) *	15 (2) *
EC 50	4 (2.5)	16 (2.5)	3 (1)	15（1.5）	4 (1.5)^＃	16 (1.5)
柳氮磺胺吡啶	3.5 (2.5)	15.5 (2.5)	4 (1.5)	16 (1.5)	5 (2)^＃	17（2）^＃
不复发TNBS	- - - - - -	- - - - - -	- - - - - -	- - - - - -	2 (1) *	12 (1) *

结果以中位数表示(四分位数范围)。Kruskal-Wallis-Mann-Whitney, *P< 0.05与TNBS组比较，^＃P与没有复发的TNBS对照组相比< 0.05。n= 4 - 7。EC 10和50:表儿茶素，剂量10和50 mg/kg。

表儿茶素治疗组和非肠炎组之间的平均体重没有显著差异(数据未显示)。关于慢性试验中结肠的重量和长度，非结肠组的结肠较长，与急性试验中一样，但仅在第二和第三周之后。EC组与TNBS对照组在任何时间点上均无差异。

对EC10组组织的组织学分析显示，与非结肠组一样，EC10组黏膜完整，黏膜及粘膜下层水肿少。TNBS对照组的分析显示溃疡区域和广泛的水肿(图5)．

3．5.慢性结肠炎复发试验模型的生化分析

在急性试验中，生化定量显示，在第1周和第3周，与TNBS对照组相比，EC10处理组的谷胱甘肽水平显著增加。这证实了EC通过维持组织中的谷胱甘肽水平发挥抗氧化剂的作用(见表)5)．在第二周，没有检测到增加，因为从诱导(两周)经过的时间比第一个(一周)或第三个(复发后一周)周更长。EC组和TNBS对照组间髓过氧化物酶和碱性磷酸酶活性无显著差异。


	谷胱甘肽(GSH) (nmol / g)
	谷胱甘肽1星期	谷胱甘肽2星期	谷胱甘肽3周

Non-colitic	1727 .88点±95.34 *	1134 .20±79.27	1726 .73点±34.92^{* #}
TNBS控制	1323±43.15	1353 .74±77.53	1374点±77.55^＃
EC 10	1662 .56点±99.92 *	1236 .37点±45.62	1,673.06±82.37^{* #}
EC 50	1529 .50±87.26	1150 .68点±52.38	1658 .92±110.49
柳氮磺胺吡啶	1555点±141.52	1269 .79±57.53	1562 .79±110.64^＃
不复发TNBS	- - - - - -	- - - - - -	1914 .64点±63.62 *

	髓过氧化酶(MPO) (U / g)
	MPO 1星期	MPO 2星期	MPO第三周

Non-colitic	64.56±19.05 *	101.65±6.63 *	71.69±5.64^{* #}
TNBS控制	377.52±85.14	219.49±25.09	634.42±149.44^＃
EC 10	386.31±76.80	247.64±34.71	401.91±70.28
EC 50	463.36±98.97	211.67±51.93	504.98±144.73
柳氮磺胺吡啶	383.79±81.39	179.12±26.34	450.46±73.96^＃
不复发TNBS	- - - - - -	- - - - - -	225.23±46.09 *

	碱性磷酸酶(ALP) (mU/mg蛋白质)
	高山1星期	高山2星期	高山三星期

Non-colitic	20.93±2.21 *	28.18±1.56 *	17.56±1.39 *
TNBS控制	46.94±2.62	40.02±3.63	27.39±3.76
EC 10	54.04±6.67	34.96±1.56	27.23±2.10
EC 50	49.89±7.95	48.16±9.97	30.31±1.20
柳氮磺胺吡啶	55.92±7.85	39.40±5.07	38.38±4.96^＃
不复发TNBS	- - - - - -	- - - - - -	24.25±2.71

结果以均数±E.P.M. ANOVA-Dunnet表示，与各组比较。＊P< 0.05与TNBS对照组相比，^＃P与没有复发的TNBS对照组相比< 0.05。n= 4 - 7。EC 10和50:表儿茶素，剂量10和50 mg/kg。

3.6。慢性模型的免疫标记分析

在急性实验中，COX-2的表达降低(图)6)，通过免疫组化评估(表6)．在所有三周的分析中，COX-2在EC10组的表达明显低于TNBS对照组，证实了急性试验中观察到的抗炎活性。PCNA阳性细胞水平显著升高(图7在第1周和第3周，EC10组比TNBS对照组有显著性差异(表2)6)．


	cox - 2 (米²/毫米²）	PCNA(细胞/毫米²）	EGF(俄文)	伊诺(俄文)

1日星期
Non-colitic	13151 .38点±7642 .79 *	277.94±21.54 *	73.50.	62.68
TNBS控制	42,561.22±7,504.32	452.82±74.51	156.94	199.82
EC 10	8,515.84±7,309.41 *	568.37±20.43 *	298.14 *	166.03
柳氮磺胺吡啶	16594 .99±6111 .12点*	387.24±23.76	139.87	132.46
第二周
Non-colitic	5899 .88点±6947 .30 *	274.82±28.95 *	66.47	53.30
TNBS控制	52,894.12±10,978.02	371.63±25.49	98.12	258.84
EC 10	8599 .16±7965 *	306.04±19.91	225.38 *	195.38
柳氮磺胺吡啶	29,415.99±11,128.13	396.61±22.43	82.07	271.02
第三周,复发
Non-colitic	6618 .02点±7509 .17 *	237.34±30.82 *	105.70	92.57
TNBS控制	46529±11713 .00	359.13±16.83	131.66	180.48
EC 10	8139 .53点±8095 .28点*	484.05±21.86^{* #}	201.54 *	198.47
柳氮磺胺吡啶	±16125 .29 10938 .09点	412.22±28.92^＃	94.62	147.59
不复发TNBS	16,986.12±8,481.50.	306.04±23.26	- - - - - -	- - - - - -

结果以均数±E.P.M. ANOVA-Dunnet， *表示P< 0.05与TNBS组比较，^＃P与没有复发的TNBS对照组相比< 0.05。n= 4 - 7。EC 10:表儿茶素，剂量10mg /kg。俄罗斯:随机单位。

为了研究细胞增殖增加的机制，我们用免疫印迹法检测了结肠黏膜中EGF的存在．我们发现，与TNBS对照组相比，EC10组的结肠中EGF水平更高(图)8)．这种EGF水平的差异可以解释EC治疗引起的细胞增殖增加。免疫印迹法检测iNOS的表达;本研究中使用的所有处理均未降低iNOS的表达(图)9)．

4.讨论

TNBS诱导肠道炎症提供了一种有效的结肠炎动物模型。TNBS诱发的结肠炎动物出现腹泻、体重下降(特殊TNBS对照组)、结肠黏膜及黏膜下层组织紊乱;这些参数测量的变化与Luchini和合作者获得的相似[28他检测了香豆素和4-羟基香豆素。

这项研究最有趣的发现之一是谷胱甘肽(GSH)。谷胱甘肽是一种由粘膜细胞产生的三肽，在氧化代谢过程中起抗氧化剂的作用;它的作用包括去除氢过氧化物和维持蛋白质巯基的生理状态[29，30.］．由于EC10导致急性和慢性复发模型中谷胱甘肽水平升高，因此可以推断表儿茶素刺激组织中谷胱甘肽的表达，从而起到抗氧化剂的作用。表儿茶素也有可能具有直接的抗氧化作用，防止谷胱甘肽在炎症过程中耗尽。在ec处理组中，上皮结构的保存证实了这一观察结果。

尽管能够减少中性粒细胞（如显微镜观察）的渗透，但与TNBS对照相比，EpicaTechin不能降低结肠组织中的MPO水平。这种无法能力可能与使用结肠炎的诱导的性质有关，这导致MPO高水平强烈持续的这种广泛的损害，因此对于表现出这种药理学活性的任何治疗是罕见的[31］．在用表儿茶素治疗的动物的结肠中发现了较高水平的谷胱甘肽，这与表儿茶素抑制脂质过氧化的能力相结合在体外,独立于其对谷胱甘肽活性的干扰[7，支持表儿茶素通过抗氧化机制使氧化应激正常化的假设。这种对肠道炎症的有益活动经常在使用富含多酚化合物的植物提取物(如Turnera ulmifolia［32)，因为它们具有抗氧化活性。在一般炎症性疾病组织损伤的发病机制和持久性中，氧反应物种和抗氧化微量营养素的形成之间的不平衡是重要的[33］．因此，使用抗氧化方法的治疗可能在治疗和预防溃疡性结肠炎方面有前景。

抗炎活性对IBD的治疗也很重要。黄酮类化合物是公认的抗炎化合物，其保护粘膜的治疗作用是通过抑制二十烷类化合物的合成和/或清除自由基和抗氧化活性等复杂机制发挥的[34］．几项研究表明，黄酮类化合物Mouriri天导致胃粘膜中COX-2的表达降低[5，34］．在本研究中观察到类似的作用，突出了EC的一个可能的作用机制。

通过PCNA和EGF定量评估病变愈合情况。PCNA阳性细胞处于细胞周期的S期，因此该抗原可作为细胞增殖的标记物[35］．在结肠中，严格调节隐窝细胞的数量，需要细胞增殖和细胞死亡之间的平衡来维持稳态[36］．在PCNA免疫标签测定中，我们观察到急性实验模型中EC组中PCNA标记的增加。在慢性模型中，虽然在治疗的第一个和第三周的EC10组中PCNA水平增加，但在第二周，没有显着的改变，最有可能因为病变显着愈合。这种细胞增殖对肠粘膜的再生非常有益，因为新细胞替代受损的上皮细胞。

在我们的工作中观察到的EGF表达的增加可能解释了观察到的细胞增殖的增加，可能是EC10抗结肠炎的作用机制之一。已知EGF可在多种系统中刺激上皮细胞增殖[37];事实上，许多生长因子调节细胞增殖、细胞分化、血管生成、炎症和胃肠道防御机制。肠道创伤修复就是一个很好的例子在体外和体内［38］．与美沙拉嗪治疗和安慰剂灌肠相比，EGF灌肠联合口服美沙拉嗪治疗显著减少结肠炎症[39］．上皮的溃疡诱导胃肠道干细胞株的分化，该株作为溃疡附近的局部小管生长，产生和分泌EGF [40］．在这种情况下，EGF刺激细胞增殖和肠黏膜上皮的再生[25］．

慢性结肠炎模型为表儿茶素的治疗效果提供了重要的证据，因为EC10组复发病变的发展是低效的，说明表儿茶素有可能防止有害刺激的复发导致结肠炎病变的恶化。与这一假设一致，病变的显微镜分析显示，在评估的三周内，EC10组的评分明显低于TNBS对照组，与TNBS对照组无复发无显著差异。

在本研究中，表儿茶素10 mg/kg剂量对肠道病变的有益作用随着剂量的增加而消失，这一现象在之前使用的其他酚类物质在相同的疾病模型中已经证实。这表明，在较高的剂量下，这些物质的促氧化作用超过了它们对肠道炎症的有益作用[41］．

为了阐明其他机制，我们也对急性模型中的蛋白如HSP-70和慢性模型中的iNOS进行了量化。HSP-70(热休克蛋白70)是在结肠炎中维持肠道内环境稳定的必要蛋白质[42］．这种蛋白质在细胞中更丰富、更保守，并且在应对各种形式的压力时持续产生[43]，如热、毒剂、感染和增殖[44］．此外，有证据表明，HSP-70在保护结肠黏膜免受结肠炎诱导应激方面发挥着关键作用[45］．数字2表明该蛋白既不随EC10作用机制而增加，也不随细胞对胁迫敏感性的降低而减少;这在槲皮素等其他类黄酮中也能观察到[46］．

由于诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)是一种在溃疡性结肠炎发病机制中起重要作用的酶，因此也通过免疫印迹法检测其表达[27]，其在结肠内表达增多[47］．槲皮素对溃疡性结肠炎的抗炎作用可能与其抑制iNOS表达的能力有关。然而，尽管TNBS对照组与非结肠组相比iNOS表达增加[18.，但均未降低iNOS的表达。

5.结论

这些结果提供了证据，10mg /kg表儿茶素可以有效地降低急性和慢性结肠炎模型的病变严重程度。虽然表儿茶素没有减少粘膜中性粒细胞的浸润，表现为MPO酶的浓度没有变化，但表儿茶素通过维持谷胱甘肽水平，降低氧化应激，保护粘膜免受炎症浸润的损害。表儿茶素的抗炎作用也可以通过降低组织中COX-2的水平来观察。表儿茶素通过刺激表皮生长因子(EGF)的表达，促进上皮细胞增殖和修复。EGF等生长因子越来越多地用于治疗肠道炎症性疾病，为新药开发提供了潜在靶点。

致谢

这项工作得到了FundaçãodeAmparoa Pesquisa Do Estado deSãoPaulo02 / 05503-6,06 / 53201-2,09-52237-9和10 / 08536-9。作者希望感谢Souza，V.M.，Fontana，F. J.和Sarzi，以及M. R. R.用于技术支持（Laboratóriodoomoologia做Freaveameo deClínicaMédicaFMB）。

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循证补充和替代医学

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