外用生育酚乳膏对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠皮肤创面愈合的评价

摘要

糖尿病是伤口愈合延迟的常见原因。该研究的目的是确定局部施用生育酚乳膏对糖尿病大鼠伤口愈合过程的影响。该研究使用18只雄性Sprague Dawley大鼠进行，分为三组：（i）接受控制霜的糖尿病大鼠， (II)糖尿病大鼠接受0.06%生育酚乳膏（III）糖尿病大鼠接受0.29％的生育酚霜．在大鼠背部区域造成四处皮肤创伤。伤口愈合是评估总蛋白质含量,伤口愈合率估计,在受伤后第十天组织学研究。生育酚处理可显著提高创面愈合速度和总蛋白含量，从而促进创面愈合与对照组相比。组织学观察还显示出在生育酚处理基团中更好的组织上皮和更多的胶原纤维。生育酚乳膏的应用增强了糖尿病病症的伤口愈合过程，该过程是造成伤口愈合延迟的影响。

1.介绍

创伤可以定义为一个结构的正常细胞、解剖和功能连续性的破坏。因此，伤口愈合是一个复杂的过程，其目的是恢复损伤组织的结构和功能完整性[1］．伤口愈合可分为三个阶段，炎症、增殖、重塑和成熟阶段，涉及各种细胞、细胞因子和生长因子的相互作用[2］．在一些病理性疾病中，如糖尿病、肾衰竭、营养不良，伤口愈合严重受损[3.］．在糖尿病患者中，糖尿病足溃疡的患病率为4-10％，脚溃骨的治疗昂贵且广泛[4］．先前的研究表明，自由基会抑制伤口愈合的过程[5］．因此，使用抗氧化剂可以加速伤口愈合过程。

最近，研究集中在使用天然抗氧化剂，如草药提取物和维生素对伤口愈合。维生素对创面愈合的有益作用主要是通过动物模型进行研究。只有维生素C被证明能加速人体的愈合[6］．口服和外用维生素A已被证明可以增强糖尿病、免疫抑制和恶性肿瘤动物模型的愈合[7- - - - - -10］．口服维生素E对伤口愈合的积极作用也已被充分证明。此前，我们报道了口服棕榈维生素E对衰老和糖尿病模型大鼠伤口愈合的益处[11，12］．腹腔注射的亲水性类维生素化合物Raxofelast在糖尿病大鼠的切口模型中显示出了良好的伤口愈合特性[13］．然而，考虑到糖尿病患者积液不良和微循环不足，外用维生素E可能比口服更能促进创面愈合。因此，在本研究中，我们旨在评估以乳膏形式外用生育酚对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠创面愈合的影响。

2.方法

2．1.动物

整个实验期间均使用马来西亚Kebangsaan大学实验动物资源单位饲养的健康雄性Sprague-Dawley大鼠(体重250-300 g)。它们被安置在控制的环境条件下，可以自由获得鼠丸和干净的水，并单独关在笼子里。之前获得了马来西亚Kebangsaan大学动物伦理委员会(UKMAEC)的伦理批准。

２.２.糖尿病感应

链脲佐菌素(STZ, Sigma，德国)溶于生理盐水中。随后，在轻度乙醚麻醉下，经尾侧静脉注射45 mg/kg剂量的STZ给过夜禁食的大鼠[2］．三天后，从这些大鼠的尾部抽取血液样本，使用血糖仪(Advantage, Germany)测定空腹血糖水平。将空腹血糖大于8 mmol/L的大鼠标记为糖尿病，纳入实验。

２.３.实验小组

将糖尿病大鼠随机分为3组，每组6只。I组为糖尿病对照组，给予vehicle cream。而II组和III组为糖尿病治疗组，分别用0.06%和0.29%的生育酚乳膏(Golden Hope Bioorganics, Malaysia)治疗。

２.４.大鼠切除创面模型及治疗

用电剃须刀刮除麻醉大鼠背部的毛，并用酒精棉签擦拭。用无菌6mm穿刺针(Stiefel, Ireland)在每只大鼠背部做4个全层切除创面[12］．切除的部分包括表皮、真皮和肉糜层。创面脱衣，按各组分别用0.1 g乳膏局部治疗，每日1次，持续10天。

2．5．伤口愈合速度的测定

第0天、第6天和第10天分别在伤口处拍摄厘米刻度的伤口。使用图像分析仪软件测量伤口面积[2］．创面愈合率，即创面从原创面愈合的百分比，计算公式如下[14]：

2.6。实验终止

每日外用乳膏治疗10天后(STZ治疗20天后)，麻醉下实施颈椎脱位安乐死。用同样大小的穿刺活检针切除一对伤口并储存在布拉德福德化验。另一对被切除，周围5毫米边缘的未受伤皮肤用10%福尔马林保存在光镜下。

2.7。布拉德福德化验

采用Bradford法测定创面总蛋白含量[15］．伤口组织以1:5 (wt/vol)的比例用1.15%的氯化钾均匀化。加入5 mL蛋白试剂(0.01%考马斯亮蓝G250, 4.7%乙醇，8.5%磷酸)，加入0.1 mL匀浆中。用0.1 mL生理盐水和5 mL蛋白试剂配制的空白蛋白试剂在595 nm处测定吸光度。用0、20、40、60、80、100制备标准曲线μ.g/mL的牛血清白蛋白，用生理盐水同样处理。

2.8。组织学观察

福尔马林固定组织按标准程序进行常规处理，并连续切片μ.用苏木精和曙红（H＆E）和Verhoeff's Van Gieson（VVG）染色。使用连接到光学显微镜（Leica，Germany）的数码相机（Pixelink，加拿大）获得幻灯片和显微照片。

2.9。统计分析

所有结果均以平均值±SEM表示。采用方差分析(ANOVA)，然后采用Scheffe检验对各组的均数进行比较。采用SPSS 11.5统计软件包进行数据分析。一个值<0.05认为有统计学意义。

3.结果

3．1.糖尿病感应

大鼠静脉注射STZ后，空腹血糖较注射前升高3-4倍(图)1，）.在整个实验期内，空腹血糖水平仍然升高。给予大鼠伤口的局部处理对空腹血糖水平没有任何影响（）.

３．２．伤口愈合率

数字2显示了实验大鼠不同时间创面的收缩率。伤口愈合率计算为伤口从原始伤口愈合的百分比(图)3.）.在接受治疗的两组糖尿病大鼠中，创面愈合率均显著增加(）.与0.06％生育酚霜相比，接受0.29％生育酚乳膏的糖尿病大鼠的处理较高的伤口闭合。

3.3。布拉德福德的测定

伤口总蛋白含量(图4使用Bradford的测定估计从第10天的实验大鼠收获的。用生育酚奶油处理显着增加伤口的总蛋白质含量（）.

3.4。组织学发现

对第10天收获的伤口进行H&E染色(图)5和6）.各组实验大鼠创面均出现完全上皮化。I组新形成的上皮层较薄，不全是四层结构。生育酚乳膏治疗组上皮形态良好。0.29%生育酚乳膏治疗后，上皮和真皮层之间的交错增加。VVG染色(图7)显示两组均有丰富的胶原纤维形成，而对照组纤维沉积较少。

4。讨论

在结构上类似的生育酚和Tocotrienol是维生素E的亚家族[12］．α.-Tocophherol被称为人类中维生素E中最丰富和活性的形式[16，17］．先前的研究已经证明，口服维生素E在伤口愈合过程中的有益作用[11，12］．本研究表明，生育酚霜的局部应用还增强了糖尿病大鼠的伤口愈合。

本实验采用STZ静脉诱导大鼠糖尿病。注射STZ后3天，所有大鼠空腹血糖升高，体重下降，多渴多尿。在整个实验期间，空腹血糖持续升高。这些迹象和症状在之前的研究中也有显示[18］．II族和III族生育酚乳膏的局部应用对空腹血糖没有影响。

创面愈合率是评估创面愈合进展的一个有效指标。研究表明，与正常大鼠相比，糖尿病大鼠的伤口收缩率降低[2］．在本研究中，0.06%和0.29%的生育酚乳膏均能增加创面收缩率。这与之前的一项研究一致，该研究表明口服补充生育酚后伤口收缩率增加[12］．

总蛋白质含量是蛋白质水平和伤口组织细胞增殖的指示剂[2］．在本研究中，生育酚霜能够增加糖尿病大鼠的总蛋白质含量，这是根据先前的研究[12］．这可能表明生育酚促进蛋白质合成、细胞增殖和伤口组织中的迁移。有趣的是，之前的一项研究表明，在生理上相关的浓度α.-生育酚抑制血管平滑肌细胞增殖，而成纤维细胞增殖未受抑制[19］．

组织学观察揭示了所有糖尿病大鼠的完全上皮化，在伤害10天后，在10天后，没有生育酚霜处理。然而，未处理的糖尿病大鼠显示出未成熟和薄的上皮层。生育酚治疗组表明，新成型的上皮含有地层胚胎，锭型，颗粒体和角质盐。在第三组中，上皮细胞和真皮之间存在间隔。这些间断很重要，因为它为由于撕裂而提供表皮层的分离的抵抗力。还表明，随着生育酚处理，瘢痕组织中的胶原纤维在瘢痕组织中越多，也反映在总蛋白质含量中。

糖尿病，一种常见的内分泌疾病，是愈合受损的主要原因之一。糖尿病患者延迟伤口愈合是包括高血糖，感染，抑制免疫，局部缺血和氧化应激的多因素[20.］．在糖尿病病症中，高血糖可降低细胞增殖和胶原沉积。在伤口部位发生的慢性炎症导致局部缺血，反应性氧物质（ROS）的产生，微循环中的血管淤滞，减少趋化性和吞噬作用，减少生长因子水平，抑制成纤维细胞增殖，并降低细胞外基质分子的沉积减少然后将其导致糖尿病患者的伤口愈合延迟[20.，21］．先前的研究表明，生育酚刺激环磷酸腺苷(cAMP)的产生，cAMP通常通过调节多种免疫细胞类型(包括巨噬细胞)的炎症反应而与免疫调节作用相关[22］．生育酚也被证明具有消炎作用，因为它能抑制促炎细胞因子和趋化因子的产生[22］．因此，应用生育酚有助于糖尿病大鼠创面愈合，这可能是由于其抗氧化和抗炎特性。

综上所述，外用生育酚乳膏对糖尿病动物模型创面愈合过程具有积极作用。在本研究中，0.29%的生育酚乳膏比0.06%的生育酚乳膏的伤口愈合更好。

资金

这项研究是由森达比研究基金资助的。jj - 001 - 2008。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

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