伊加里宁，蓖麻植物和小檗碱在Er-Xian汤中的骨质细胞骨吸收中的效果和相互作用

抽象的

中药二仙汤(erxian decoction, EXD)对去卵巢骨质疏松大鼠的骨丢失有保护作用，其中淫羊藿苷(I)、仙茅苷(C)、小檗碱(B)对破骨细胞的骨吸收有抑制作用。在本论文中，我们研究了I、C、B及其组合对骨吸收活性的相互作用和影响体外来自大鼠骨髓细胞的破骨细胞。银行独立委员会协同减少骨吸收坑的形成,多核破骨细胞的数量和活动的tartrate-resistant酸性磷酸酶(陷阱)和显示敌对或添加剂影响组织蛋白酶K coculture活动系统的成骨细胞和骨髓细胞的存在,25-dihydroxyvitamin D_3.和地塞米松。ICB的组合还增强了对F-肌动蛋白环的形成的抑制作用，从巨噬细胞殖民地刺激因子（M-CSF）和NF的受体激活物诱导的骨髓细胞诱导的骨髓细胞骨架的细胞骨架结构。κB配体(RANKL)。此外，ICB可协同提高成骨细胞中骨保护素(OPG)和RANKL的蛋白表达比例，并干扰破骨细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路。这些结果清楚地表明，I、C、B及其组合在EXD中发挥相互强化的作用。然而，在切除卵巢的小鼠模型中，IBC并没有显示出强化的副作用，这与体和子宫重量的变化有关，证实了EXD的安全性。这些观测结果与本文公式的合理性是一致的。

1.介绍

中药（TCM）是多组分治疗剂的经验系统，可能会满足以综合方式治疗多种复杂疾病的要求，特别是慢性疾病和代谢综合征[1］．已经显示出在某些公式中的天然存在的草药和草药成分具有潜在的相互作用效应，包括相互增强，互助，相互抑制和相互拮抗作用。例如，当草药（或成分）组合的功效大于每个单独的草本植物或成分的综合反应时，发生协同相互作用[2，3.］．中医科学证据一般是通过严格的实验设计，已经通过寻找其生物学基础，活性物质的鉴定，其作用机制的研究为主来实现的。与此相反，研究在公式中的作用和活性成分的相互作用仍是稀缺的，从而阻碍了中医配方设计的合理性的理解。

绝经后骨质疏松症被认为与卵巢激素缺乏有关，是迄今为止年龄相关性骨质疏松最常见的原因[4];随着雌激素水平的降低，与骨形成、微结构恶化和骨量减少相关的骨分解会增加[4，5］．骨过度分解是由于破骨细胞数量增加和骨吸收能力增强所致[6］．破骨细胞是由造血前体分化而来的多核细胞(每个细胞3-10个细胞核)，参与骨重建。通过破骨细胞的骨吸收，破骨细胞在骨重建中发挥重要的生理作用，并在以破骨细胞过度活动为特征的骨质疏松症中发挥病理作用[6，7］．

在一些细胞因子的控制下形成和分化骨核素，例如巨噬细胞殖民地刺激因子（M-CSF），NF-受体活化剂κB配体(RANKL)和骨保护素(OPG) [7，8］．RANK1对其受体等级的结合导致TNF受体相关因子6（TRAF6）募集到等级的细胞质结构域。这然后激活TRAF6的下游目标，包括转录因子，例如核因子Kappa B（NF-κB)、活化蛋白-1 (AP-1)、活化T细胞核因子(NFAT)，以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，包括p38 MAP激酶、c-Jun n端激酶(JNK/SAPKs)、细胞外信号调节激酶(ERKs)和磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)/Akt [9- - - - - -12］．骨保护素(OPG)是RANKL的可溶性诱骗受体，负调控破骨细胞分化和骨吸收。成熟破骨细胞的形成也与分化标志物的表达有关，包括抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和组织蛋白酶k。这些分化相关信号通路的调节有可能被视为骨骼疾病的治疗策略[13］．

在过去的50年中，尔冼汤（EXD），中国传统药物配方，已被用于治疗骨质疏松症的，更年期综合症，和老化的疾病[14，15］．EXD主要成分为淫羊藿叶(阴阳火)、仙茅(仙茅)、知母(知母)、黄柏(黄柏)、巴戟天(巴戟天)、当归(当归)，主要活性成分为淫羊藿苷、莪术苷、倍叶皂苷、小檗碱、nystose、阿魏酸[16］．据中式中药，淫羊藿叶和Phellodendri Chinensis皮质是EXD的必要成分，似乎在更改绝经综合征和骨质疏松症的症状和症状中起重要作用。Curculiginis Rhizoma和Morindae Officinalis Radix有助于增强淫羊藿叶的疗效，Anemarrhenae Rhizoma有助于Phellodendri Chinensis Cortex发挥更大作用。Angelicae Sinensis Radix与上述五种药物合作，加强治疗效果并治疗随附的疾病或综合症[17］．我们测试的主要活性成分的作用对成骨细胞和破骨细胞，发现淫羊藿苷，知母皂甙BII，nystose，和阿魏酸可以增加成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶（ALP）活性，淫羊藿苷（I），仙茅苷（C），和黄连素（B）能够降低TRAP阳性多核破骨细胞和破骨细胞的TRAP活性的数目，通过对骨吸收的抑制作用证明[16］．

因此，在本研究中，我们首先证明了ICB联合用药对去卵巢骨质疏松小鼠的抗骨质疏松活性高于单个化合物，并进一步研究了I、C、B、并结合其对破骨细胞骨吸收的影响，评价两者之间的相互作用，从而了解其作用机制，并为中药的潜在应用提供方剂设计的合理性。

2。材料和方法

2．1.试剂

本研究中使用的试剂包括在内α-修改的最低必需培养基(α-MEM）和胎牛血清（FBS）（Gibco公司，美国）;1，25-二羟基维生素d_3.，地塞米松，胰蛋白酶，考马斯亮蓝G-250 (Sigma，美国);重组大鼠M-CSF(400-28)和RANKL (400-30) (Peprotech EC，美国);OPG (sc11383)， RANKL (sc9073)和β-actin (sc81178)抗体(Santa Cruz, USA);抗磷酸化akt(9275)，抗磷酸化erk(3371)，抗磷酸化jnk(9251)，抗磷酸化p38(9211)，抗磷酸化- i-κB (9245) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA);NucBuster蛋白提取试剂盒(Merck, Novagen，德国);组织蛋白酶K活性试剂盒(Biovision, USA);副玫瑰苯胺，Hoechst 33258和罗丹明共轭phalloidin (Sigma，美国)。二醇胺、酒石酸钾钠、4-硝基苯磷酸二钠、Triton X-100、4-硝基苯酚为国产AR级。

分别从淫羊藿叶、莪术根和黄柏中分离得到淫羊藿苷(I)、莪术皂苷(C)和小檗碱(B)，并通过波谱分析进行鉴定。质子核磁共振波谱数据(¹H NMR）和质谱（MS）与先前的研究是巧合。根据高效液相色谱（HPLC）分析，乙素素，姜黄素和小檗碱的纯度高达99％。

２.２.动物实验协议

七十3个月大的雌性ICR小鼠从SLACOM购买实验动物公司（上海，中国），并在开始实验前适应实验室条件下1周。食品和饮用水供应了自由．在实验期间每周称重小鼠。双侧卵巢切除术后12周建立了骨质疏松症模型。知道卵巢切除术诱导的骨质疏松模型与雌激素缺乏有关，使用邻胞嘧啶（雌激素物质）作为阳性药物。在70只雌性小鼠中，10只小鼠被假手动，并用去离子水处理作为对照组。剩余的60只小鼠是双侧卵巢切除的，并且同样随机分为6组，随着去离子水作为OVX模型对照，尼龙（1mg / kg）作为阳性对照，伊加霉素（40mg / kg）每日，Curculigoside每日（120 mg / kg），每日小檗碱（120 mg / kg），或icariin（40mg / kg），姜黄素（20mg / kg）和小檗碱（120 mg / kg）作为治疗组的组合，全部为12周。小鼠接受了从一天开始的治疗，在手术后，在尸检中确认卵巢切除术的成功通过未能检测卵巢组织并通过观察子宫角的标记萎缩。在治疗结束时，通过轨道窦法取出来自所有小鼠的血液样品，并离心以收集血清以测量生化参数。除去子宫并立即称重。

在分析前，将胫骨通过去除粘连软组织进行清洁，并在75%乙醇中保存一周。在距右胫骨近端骨骺3mm处用周围定量计算机断层扫描(p密度测定法(strategic XCT Research SA, Germany)。血清碱性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和血清肌酐(Cr)在自动分析仪(美国Ciba-Corning 550)上使用诊断试剂试剂盒测定。血清骨保护素(OPG)和脱氧吡啶啉交联(DPD)根据制造商说明使用Elisa试剂盒进行评估。本研究采用的实验方案经第二军医大学生物伦理委员会批准，实验程序严格按照国际通行的规则和规定进行。

２.３.破骨细胞的形成、分化和骨吸收的测定

2.3.1。用1,25-二羟基苯胺诱导的骨核苷酸诱导和地塞米松在骨髓细胞与成骨细胞共培养系统

根据文献，从新生大鼠颅骨成骨细胞中制备了原代成骨细胞[18］．破骨细胞的诱导培养如下。简单地，3日龄Wistar大鼠股骨脱臼，切除股骨末梢，用1ml注射器冲洗骨髓细胞。成骨细胞(1 × 10⁵/ ml）和骨髓细胞（1×10⁶/ ml）被加入了α- 含有10％FBS，1,25-二羟基苯胺D的常见培养基_3.（10nmol / L）和地塞米松（100nmol / L）在37°C的潮湿气氛中为5％CO₂．Prior to plating the cells, cover glasses (5 × 5 mm) or dental slices (40 μM厚)放入培养皿中。多核破骨细胞(MNCs)的形成通过TRAP染色和牙片上形成的吸收坑得到证实。将破骨细胞接种到培养板上α-mem媒介。通过含有1.0的新鲜培养基，将培养基替换。 μ中号淫羊藿苷，1.0 μM curculigoside, 1.0μM小檗碱，或其联合用药(含1.0μ中号淫羊藿苷，1.0 μm curculigoside，1.0 μM小檗碱）表示时间。将所有培养物在37°C中保持在37°C的5％CO的潮湿气氛中₂在。用破骨细胞检测破骨细胞的形成、TRAP和Cathepsin K活性以及骨吸收活性。

2.3.2。计数捕获阳性多核骨质骨骨骨钙

将初级成骨细胞和骨髓细胞置于含有盖玻片的96孔板上并培养α- 含有10％FBS，1,25-二羟基苯胺D的常见培养基_3.（10nm）和地塞米松（100nm），24小时。然后用或不含I，C，B和它们的组合处理细胞10天，并用捕集染色试剂盒染色捕获（NO.387A-1KT; Sigma-Aldrich）。用三个或更多个核的细胞计数在显微镜下的骨细胞样多核骨细胞。

2.3.3。陷阱活动的测定

主要成骨细胞和骨髓细胞α- 含有10％FBS，1,25-二羟基苯胺D的常见培养基_3.（10nm），将地塞米松（100nm）置于96孔培养皿中，培养6天，然后用或不含I，C，B和它们的组合处理48小时。陷阱确定如下：用PBS洗涤细胞两次，然后20 μ在细胞中加入0.1% Triton X-100在室温下诱导细胞裂解。15分钟后，100μL底物溶液(4-nitrophenylphosphate二钠0.4克和2.0克酒石酸钾溶解在去离子水的200毫升,pH值调整到3.5 1 mol / L盐酸)添加到细胞溶解细胞和孵化在37°C为30分钟,100年的反应是终止μ每孔加1mol /L NaOH，在405 nm处测定吸光度。同时计数TRAP阳性细胞，以纳米摩尔表达TRAP活性p-硝基酚每分钟每100个破骨细胞。

2.3.4。组织蛋白酶K活性测定

主要成骨细胞（2×10⁶）骨髓细胞（2×10⁷)α- 含有10％FBS，1,25-二羟基苯胺D的常见培养基_3.（10nm）和将地塞米松（100nm）置于24孔培养板中，培养7天，然后用或不含I，C，B，它们的组合处理48小时。通过离心收集细胞，在50中裂解 μL冷冻CK细胞裂解缓冲液，冰上孵育10 min，旋涡5 min。CK反应缓冲液(50μl）和10 mm CK衬底AC-LR-AFC（2 μL)加入样品，37℃孵育2 h。然后将样品转移到96孔板上;荧光强度在荧光计中测量，荧光计配有400 nm激励滤波器和505 nm发射滤波器。

2.3.5。骨吸收坑的测定

用灭菌的骨切片将主要骨细胞和骨髓细胞悬浮液接种到96孔培养板的孔中（40 μm厚，5毫米×5毫米）。24小时后的文化α- 含有10％FBS，1,25-二羟基苯胺D的常见培养基_3.(10 nM)和地塞米松(100 nM)，分别给予或不给予I、C、B及其联合处理12 d。用1mol /L nhh对牙片进行超声波处理₄去除附着细胞，用0.1%甲苯胺蓝溶液染色。显微镜下观察吸收坑;随机选取每个牙排20个视野，使用图像分析软件(德国Leica Q550IW)测量凹坑面积。计算20个随机视野的再吸收坑面积之和，即为每个牙排的再吸收坑面积。所测化合物对骨吸收的抑制作用以所测化合物处理后牙片的骨吸收坑面积/对照的骨吸收坑面积× 100%表示。

2.4。分析破骨细胞的细胞骨架

2.4.1。骨髓细胞M-CSF和RANKL诱导破骨细胞

5×10⁷骨髓细胞在含6孔板中培养α- 在5％CO的加湿气氛中补充有10％的FBS和5 ng / ml M-CSF₂为24小时。收集非贴壁细胞，培养于细胞内α-MEM培养基，含10%胎牛血清和50 ng/mL M-CSF，持续3天。孔底残留的细胞视为骨髓源性巨噬细胞，在细胞内培养α-MEM含10%胎牛血清，50 ng/mL M-CSF, 100 ng/mL RANKL。每3天更换新鲜培养基，6天后细胞分化为成熟破骨细胞。用破骨细胞观察肌动蛋白环的形成并分析其调控蛋白的表达。

2.4.2。用于形成肌动蛋白环的测定

骨细胞细胞（1×10⁶(M-CSF)和RANKL诱导后接种于10 × 10 mm玻璃盖上，分别加或不加I、C、B及其联合治疗4 h。然后用4%的新鲜多聚甲醛PBS固定破骨细胞15分钟，用PBS洗涤3次，然后用0.1% Triton X-100 PBS渗透10分钟。细胞内的f -肌动蛋白环用罗丹明偶联phalloidin标记。37℃，用5μ克/毫升的Hoechst 33258溶液，和之后在PBS中洗涤进一步，将细胞装在甘油。使用共聚焦激光扫描显微镜（Leica TCS-SP5，Germany）和滤光器和反射镜适当组合观察标本。

2．5．免疫印迹

从与如第描述从骨髓细胞的M-CSF和RANKL（诱导的新生大鼠cavarial成骨细胞或破骨细胞的细胞2.4.1)，分别给予或不给予I、C、B及其联合治疗24 h。细胞在含有20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100，蛋白酶和磷酸酶抑制剂的缓冲液中溶解。裂解液(30-40 mg)用10% SDS PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶阻断后，用抗成骨细胞opg和RANKL或抗磷酸化Akt、ERK、JNK、p38和Iκ对破骨细胞- b。将相同的膜剥离并进行检测，并用Gel Doc 2000荧光图像分析仪(Wealtec Dolphin-Doc, USA)检测化学发光信号。

2.6。统计分析

实验在五个复制样品重复3次。数据表示为平均值±标准差和单因素方差分析，其次是邓奈特t-test其用于统计分析（PASW 18.0软件; SPSS公司，Chicago，USA），和显着性水平设定为(*),（**），（***）。

为了确定化合物是否具有协同作用，我们使用了概率和检验(问测试） [19，20.］．使用的公式如下：．在这里,和表明化合物和复合是治疗组与对照组平均值相比的变化率。反应者的实际百分比是多少是预期的响应率。为单独使用化合物A和化合物B时的概率之和。是单独使用两种化合物时细胞对它们作出反应的概率。当<0.85，认为联合用药具有拮抗作用;当，合并被认为是协同的;当为0.85和1.15之间，该组合被认为是添加剂。

结果

3.1。ICB减少骨丢失去势大鼠骨质疏松

如表所示1在卵巢切除12周后，与假手术小鼠相比，胫骨总骨和骨小梁骨的骨矿物质含量(BMC)和骨密度(BMD)显著降低，但皮质骨没有变化。与OVX对照组相比，给予奈雌醇显著增加胫骨总骨和小梁骨BMC和BMD。I、C、B及其联合用药显著增加骨小梁的BMC、BMD和总BMD，但未改变胫骨的总BMC。它们结合的效果比单独的化合物更强。以上结果表明，I、C、B及其联合应用可改善骨小梁的BMC和BMD水平，减少卵巢切除术引起的骨丢失。

如图所示1，I，C，B及其组合的给药没有导致子宫重量的增加和抑制卵巢切除小鼠的体重增加，除了胰岛素抑制体重增加。血清脱氧吡啶啉碱交联与肌酐比率（DPD / Cr），捕集水平是骨吸收的生化标志物，ALP是骨形成的标志物。卵巢切除术诱导小鼠的高骨周转，这证明了血清DPD / Cr，陷阱和ALP水平的显着增加。Nylestriol降低了血清DPD / Cr，陷阱和ALP水平，并抑制OVX小鼠的高骨质周转。施用I，C，B和它们的组合降低了血清DPD / Cr和捕集水平，但血清ALP水平没有降低。OPG（骨蛋白酶）是由骨细胞产生的内源性蛋白质，其抑制破骨细胞形成和活化。卵巢切除术减少了血清OPG水平，相反，吲哚醇均增加血清OPG。I，C，B和它们的组合显着增加了卵巢切除小鼠的OPG水平。这些结果表明，通过抑制骨吸收，I，C，B和它们的组合增加了骨密度，并且它们的组合显示出比个体化合物更高的活性。因此，进一步研究了I，C和B的效果和相互作用，用于其作用和相互相互作用对破骨细胞骨吸收的作用。

３．２．ICB协同抑制破骨细胞的形成和分化

为了单独阐明I，C和B的效果或它们对破骨细胞形成的组合，将骨髓细胞与源自大鼠Calvaria存在的成骨细胞与10次出现共培养⁸m1,25 -二羟基维生素D_3.．在6天内，在共培养系统中在6天内形成许多陷阱阳性骨核糖体，响应于1α，25（哦）₂D_3.．如图所示2(一个)和2（b），I，C和B或其组合显着降低了捕获阳性多核细胞的数量。在单独使用I，C或B处理骨酸骨胶中，捕获阳性多核细胞的数量分别降至68.1％，70.7％和63.5％的对照。IB，IC，BC和IBC的组合分别降低了骨质体的数量分别为37.1％，53.0％，46.0％和21.4％的对照。根据问值，IC，BC和IB的组合施加添加剂抑制作用，并且ICB的组合对破骨细胞形成施加了一些协同抑制作用。

TRAP活性与破骨细胞骨吸收直接相关，如图所示2（c）在治疗48-H后，I，B，C及其组合显着抑制了捕集活性。在单独用I，B和C处理骨壳的处理中，陷阱活性分别降至89.4％，80.9％和90.4％的对照。IB，IC，BC和IBC的组合将陷阱活性降低至74.8％，77.6％，74.9％和60.2％的对照。根据问值时，IB和BC联合使用具有加性抑制作用;IC与ICB联合对破骨细胞TRAP活性具有协同抑制作用。

抑制成熟破骨细胞骨吸收的另一可能机制是，I、B、C及其联合作用可通过抑制组织蛋白酶K (CK)活性来降低骨基质降解[21.];因此，我们进一步利用合成底物Ac-LR-AFC和重组组织蛋白酶K进行无细胞酶分析，评估对破骨细胞组织蛋白酶K活性的影响。如图所示2（d）、I、B和C对破骨细胞CK活性的抑制分别为对照的86.4%、88.9%和86.6%。虽然I、C、B联合治疗较单个化合物具有更强的潜在抑制作用，但这些联合治疗对破骨细胞组织蛋白酶K活性的抑制作用是拮抗的或添加的，而不是协同的问价值。

3.3。ICB协同地禁止显示破骨细胞

牙片与破骨细胞共培养12天。未经处理的牙片表面非常均匀。成熟的破骨细胞侵蚀均匀的表面并形成吸收凹。甲苯胺蓝染色后，再吸收凹坑的蓝色易于识别。在实验条件下，与对照组相比，I、C、B及其联合治疗的牙片骨吸收坑数量和面积均有显著减少。在单一治疗组中，I、C或B单独降低了骨吸收坑面积，分别为对照组的65.2%、67.5%和62.4%。经I、C、B处理后，骨吸收坑面积分别为对照的33.9%、36.8%和39.4%。ICB联合治疗使骨吸收坑面积减少到对照组的12.8%(图)3（a）和3（b））.根据问值时，I、C、B联用对破骨细胞骨吸收有轻微的协同抑制作用。提示ICB联合用药可增强对破骨细胞骨吸收的抑制作用。

3.4。ICB协同地阻止RANKL诱导破骨细胞细胞骨架组织

通过将疏松骨硬脂骨骨表面与骨表面的附着引发骨脆性骨吸收。附着后，破骨细胞形式的特征肌动蛋白环，胞质结构是最佳骨质体骨吸收的必由性的必然性[22.］．为了确定ICB是否影响骨核糖体中的细胞骨骼组织，在M-CSF和RANKL的存在下在玻璃覆盖物中培养骨髓细胞，或者没有I，C，B和它们的组合。通过用罗丹明 - 缀合的小蛋白酶染色来可视化肌动蛋白环，以评估骨吸收早期阶段的活性。如图所示4，共聚焦激光扫描显微镜显示肌动蛋白环致密，并在其周边呈现一些假偶数。用I，C，B和它们的组合治疗骨壳导致假偶数消失;F-肌动蛋白环被破坏并松弛，在破骨细胞的细胞质区域中松散且薄。I，C和B的组合对F-肌动蛋白环的形成比单个化合物的形成更有效，表明I，C和B可以协同影响细胞骨骼组织，这是骨吸收所必需的骨核糖籽。

3.5。ICB提升OPG和RANKL表达的成骨细胞的比率

共培养系统中，成骨细胞通过响应维生素d表达RANKL破骨细胞支持祖细胞的分化_3.和地塞米松[23.］．因此，有必要确定这些抗促细胞源性化合物是否直接影响骨质糖醛前体细胞或间接靶向成骨细胞，从而调节OPG和RANKL的表达，这是骨壳分化和活性的关键因素。在用I，C，B和它们的组合治疗成骨细胞24小时时，OPG在成骨细胞中的相对蛋白表达增强至2.38-，2.42-，4.13-，3.29-，2.11-，1.18-和1.32-分别折叠;RankL的相对蛋白表达分别为1.09-1.06-14-，0.72-，0.53-，0.22-和0.39倍的对照。因此，蛋白表达水平的蛋白表达水平和RANK1的比率分别高达2.17-，2.29-，3.62-，4.56-，3.98-，5.37-，3.36倍的控制（图5）.这些结果表明，在共培养模型系统中，I、B、C及其组合均可调控成骨细胞OPG/RANKL系统，从而抑制破骨细胞分化。

3.6。ICB导致对Mapks途径的等级信令磷酸化降低

Rankl刺激将Akt，Erk，Jnk和P38的磷酸化增加，并在骨质体中产生，并激活NF-κ乙途径需要I-的磷酸化κB (24.］．因此，我们接下来确定是否I，C，B，以及它们的组合可能会影响涉及这些激酶信号通路。如图所示6，用I，C和B单独治疗骨酸骨，I的磷酸化κB和ERK均下调，其联合作用比单个化合物表现出更强的抑制作用。单独使用I和C上调了p38的磷酸化，而IB、BC和IBC联合使用显著降低了该激酶;B增加了Akt和JNK的磷酸化;B、I和C组合均可降低Akt和JNK的磷酸化水平。这些结果表明，ICB协同降低MAPK通路中RANKL信号的磷酸化，导致破骨细胞骨吸收的减少。综上所述，我们的研究结果表明EXD治疗骨质疏松的合理性。

4.讨论

在本研究中，我们发现，在去卵巢小鼠中，EXD活性成分淫羊藿苷(I)、小檗碱(B)、仙茅苷(C)联合使用，显著提高了骨密度和骨矿物质含量，调节了血清生化参数。在细胞水平上，IBC通过调节成骨细胞OPG/RANKL系统和破骨细胞MAPKs通路抑制破骨细胞的形成、分化和骨吸收。的评估问概率和试验的价值直接证明了I，B和C对骨细胞细胞的协同作用。这些结果清楚地表明，EXD施加相互加强的效果的组件。然而，IBC在卵巢切除鼠模型中没有表现出强烈的不利影响，如身体和子宫重量的变化所揭示的，与EXD的安全相一致。这些观察结果符合本研究中使用的公式的合理性，相互加固化合物，以及减少不良反应。

通过形成新的骨壳体和骨质体的骨再吸收活性来介导骨细胞骨骨吸收。成熟的破骨细胞的特征在于多核，捕获染色，组织蛋白蛋白k活性，肌动蛋白环结构，荷叶腺边框和吸收期间的酸性细胞状况[13］．如图所描绘的2，将骨壳细胞暴露于I，B，C和它们的组合显着降低了捕获阳性多核细胞的数量和捕集和组织蛋白酶K的活性，并诱导了肌动蛋白环的破坏，表明I，B，C和它们组合通过引发肌动蛋白环的直接破坏和通过抑制成骨细胞形成和成熟骨质体的存活来降低骨细胞的凹陷性活性。表现出卵巢切除疏松症大鼠中最强的治疗效果的icariin也被证明是靶向骨质体骨吸收中的EXD的主要成分[16];B和C增强了I对骨细胞形成，分化和骨吸收上的抑制作用，增强了I的效果。因此，EXD公式通过现代生化分析证明其理性。

NF-的受体激活剂κ成骨细胞合成的B配体(RANKL)和骨保护素(OPG)在破骨细胞的形成、分化和骨吸收活动中发挥重要作用[7］．RANKL通过NF-受体激活因子向破骨细胞祖细胞提供信号κB（等级）激活破骨细胞分化和功能。OPG阻止了Rankl和等级受体之间的相互作用。换句话说，OPG抑制了骨髓细胞发生，而RANKL支持骨髓内骨的骨吸收[25.］．因此，骨重塑可以通过OPG与RANKL的相对比值来评估。在本研究中，I、B、C及其组合显著增加了OPG与RANKL的相对比值，说明它们通过调节成骨细胞OPG和RANKL的表达来抑制骨吸收。

与RANKL相互作用的RANK信号诱导肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)的募集和激活，导致MAPK通路的激活，包括ERK、p38和JNK [9］．ERK通路参与了破骨细胞发生的负调控[6］．然而，p38和JNK通路已被证明在rankl诱导的破骨细胞分化中发挥关键作用[26.］．破骨细胞凋亡受多种信号分子控制，包括TRAF6、Src、PI3 K/Akt、ERK和NF-κB通路(27.］．我们的研究发现ERK、Akt、JNK、IκI给药后B略有下降，破骨细胞p38略有升高;单独给C或B后ERK磷酸化水平下调;ERK、Akt、p38、JNK和I-的磷酸化κ破骨细胞的B与C第一组合给药后显著下调或/和B.这些结果表明，I，C和B通过MAPK途径有不同的调制机制和它们的组合对这些信号蛋白的磷酸化更有效的抑制效果破骨细胞。

这是值得指出的是中国药用配方可能通过组合各种草药或它们的成分复杂的变化。有些人可能会加强或减少其影响，中度或消除其原有的毒副作用;某些可有利于在体内的原理元件到疾病部位的递送[28.］．在EXD中，淫羊藿叶与莪术具有相似的性质和作用，它们的组合可以相互增强作用。黄柏皮与淫羊藿叶、莪术有不同的药理作用，但可以帮助提高其疗效[17］．I、C、B分别为淫羊藿叶、莪术、黄柏的主要活性成分。这可能是本研究中一个有趣的发现，与单独I治疗相比，ICB治疗减少了破骨细胞骨吸收，而I联合C和/或B显著上调了OPG，下调了RANKL。ICB治疗24 h后，由于OPG上调，RANKL下调;在早期阶段，C和B对I操作的增强可能还涉及其他一些事件。有趣的是，在MAPKs通路中也观察到了同样的结果。P38、ERK、Akt、JNK和Iκ而I与C或/和B联合给药后，这些信号蛋白的磷酸化水平显著降低。这些结果表明，C和B可能在EXD中协助I调控这些关键通路。

广泛研究了伊加霉素，姜黄素和小檗碱的抗软骨疏松活性和机制。icariin通过诱导BMP-2，BMP-4和没有合成，增强了成骨细胞的分化和增殖，并促进了基质钙化，随后调节CBFα1 / RUNX2，OPG和RANKL基因表达和激活BMP信令[29.- - - - - -32.］．icariin还抑制了骨质骨质分化并降低了运动性和骨质体骨吸收[29.，33.］．icariin对骨改造的这些调节效果也与雌激素样活动有关[30.，31.］．Curculigoside对成骨细胞和破骨细胞有明确的影响，增强了血管内皮生长因子和骨形态学蛋白-2在骨细胞MC3T3中的表达，并防止了Calvaria成骨细胞中过氧化氢的功能障碍和氧化损伤[34.- - - - - -36.］．小檗碱抑制RANKL介导的破骨细胞形成和存活通过NF-的抑制κb和akt激活[37.］．在骨细胞细胞中，小檗碱通过P38 MAPK的激活增强了骨质膨胀蛋白和骨钙蛋白，包括骨桥蛋白和骨癌的表达[38.］．这些结果表明淫羊藿苷、仙茅苷和小檗碱通过多靶点和多途径调节骨代谢。此外，EXD还含有黄酮类、酚苷类、生物碱类、蒽醌类、有机酸类、多糖等多种活性成分。很可能活性成分在多个靶标上存在复杂的相互作用。因此，EXD对骨丢失的保护作用是以相似的方式实现的，多活性成分通过多靶点和多途径发挥作用;然而，这些需要更深入的研究。

总之，本研究阐明了伊加里宁，姜黄素和小檗碱之间的骨壳相互作用关系。这支持了在TCM公式中的理论，使用倍数或其成分可以提供相互加固和辅助，从而与个体成分相比增强治疗效果。

利益冲突

作者之间没有利益冲突。

作者的贡献

薛林和焦林对这项工作贡献相当。

承认

国家自然科学基金项目(no . 81173191);上海市科委项目(no . 12401900702)。关键词:岩石力学，数值模拟，数值模拟

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