1。介绍
中医(中医),实证的多元系统疗法,可能会遇到许多复杂疾病的治疗要求在一个集成的方式,尤其是慢性疾病和代谢综合症(
1 ]。天然草药和草药成分组织成一定的公式已被证明有潜在的交互作用,包括相互提高,相互帮助,相互约束,相互对立。例如,协同交互时的功效的药草组合(或原料)大于每个单独的草或成分的总结反应(
2 ,
3 ]。对中医的科学证据通常是通过严谨的实验设计,已由寻找它的生物学基础,确定活性物质,调查其作用的机制。相比之下,研究活性成分的作用和交互的公式仍然是稀缺的,因此阻碍了理解中医的配方设计的合理性。
绝经后骨质疏松症被认为是与卵巢激素缺乏症,是迄今为止最常见的老年性骨质疏松的原因(
4 ];和降低雌激素水平,增加骨分解相对于骨形成,microarchitectural恶化,骨量减少(
4 ,
5 ]。过度骨破裂是由破骨细胞数量的增加和增强骨吸收的能力
6 ]。破骨细胞是多核细胞(3 - 10每细胞细胞核)从造血前体细胞分化,参与骨重塑。通过监测骨吸收,破骨细胞在骨重塑至关重要的生理作用和在骨质疏松症的病理作用的特点是过度活动破骨细胞(
6 ,
7 ]。
破骨细胞形成和分化的控制下一些细胞因子,如巨噬细胞集落刺激因子(csf)、受体激活剂NF -
κ B配体(RANKL), osteoprotegerin(功能)
7 ,
8 ]。绑定的RANKL受体排名导致招聘TNF receptor-associated因子6 (TRAF6)的胞质域等级。这激活下游的目标TRAF6包括转录因子,如核转录因子(NF -κB
κ B),激活蛋白1 (AP-1)和核转录因子的激活T细胞(NFAT),以及增殖蛋白激酶(MAPKs)包括p38激酶地图,c-Jun n端激酶物/ SAPKs),细胞外signal-regulated激酶(erk)和phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3 K) / Akt (
9 - - - - - -
12 ]。Osteoprotegerin(功能),RANKL的可溶性诱饵受体,负调节破骨细胞分化和骨吸收。成熟破骨细胞的形成也与分化标记的表达有关,包括抗酒石酸酸性磷酸酶(陷阱)和组织蛋白酶k .这些differentiation-related的调制信号通路可能被视为治疗骨骼疾病的治疗策略(
13 ]。
在过去的50年里,Er-Xian汤(EXD),中国传统药物配方,已被用于治疗骨质疏松症的疾病,更年期综合症,疾病和衰老
14 ,
15 ]。EXD的组件是Epimedii叶(Yinyanghuo) Curculiginis根茎(Xianmao) Anemarrhenae根茎(Zhimu) Phellodendri对皮层(黄柏河),Morindae Officinalis基数(Bajitian)和Angelicae基数(Danggui)、淫羊藿、浓度与curculigoside, timosaponin BII, berberin, nystose,作为主要活性成分阿魏酸(
16 ]。根据中药淫羊藿叶和Phellodendri对皮层是必不可少的成分EXD,似乎扮演了一个重要的角色在改善更年期综合症的症状和体征和骨质疏松症。Curculiginis根茎和Morindae基数帮助加强疗效的淫羊藿叶,和Anemarrhenae根茎帮助Phellodendri对皮层发挥充分作用。Angelicae Sinensis基数与上述五药物配合加强治疗效果和治疗相应的疾病或综合征(
17 ]。我们测试了主要活性成分的影响成骨细胞和破骨细胞,淫羊藿,浓度,发现timosaponin BII, nystose,和阿魏酸能增加成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性,淫羊藿(我),浓度和curculigoside (C),和(B)小檗碱能减少陷阱积极多核破骨细胞和破骨细胞的TRAP-activity,正如他们对骨吸收抑制作用(
16 ]。
因此,在本研究中,我们首先证明了银行独立委员会的结合更有效antiosteoporotic活动比单个化合物对切除卵巢的骨质疏松性老鼠,而且,我们调查的抑制性影响我,C, B,他们结合的骨吸收octeoclast评价它们之间的相互作用,以获得他们的理解的作用机制,并提供一个洞察配方设计的合理性为潜在使用中医。
2。材料和方法
2.1。试剂
包括试剂用于这项研究
α 修改后的最低基本培养基(
α mem)和胎牛血清(的边后卫)(美国Gibco);1,25-dihydroxyvitamin D3 、地塞米松、胰蛋白酶和考马斯亮蓝g - 250(σ,美国);重组鼠- csf(400 - 28)和RANKL(400 - 30)(美国Peprotech EC);功能(sc11383), RANKL (sc9073)
β 肌动蛋白(sc81178)抗体(美国圣克鲁斯);anti-phospho-Akt (9275), anti-phospho-ERK (3371), anti-phospho-JNK (9251), anti-phospho-p38(9211),和anti-phospho-I -
κ B(9245)(细胞信号技术,贝弗利,MA);NucBuster蛋白分离设备(德国默克,Novagen);组织蛋白酶K活动工具包(美国Biovision);副品红,赫斯特33258年,rhodamine-conjugated phalloidin(σ,美国)。Diolamine、酒石酸钾钠、二钠4-nitrophenylphosphate,特里同x - 100, 4-nitrophenol国内AR级。
Icariin(我),curculigoside (C),和(B)小檗碱隔绝Epimedii叶,Curculiginis根茎,和Phellodendri对皮层,分别由光谱分析确定。质子核磁共振光谱的数据(1 H NMR)、质谱(MS)是巧合与先前的研究。淫羊藿,浓度的纯度curculigoside,根据99%小檗碱高效液相色谱法(HPLC)分析。
2.2。动物实验协议
七十年三月大的女性ICR小鼠从SLACOM购买实验动物公司(上海,中国)和适应于实验室条件实验开始前1周。食物和饮用水供应
随意 。老鼠体重每周在实验期间。骨质疏松性模型建立了双边卵巢切除术后12周。知道骨质疏松引起的卵巢切除术与雌激素缺乏,nylestriol(雌激素的物质)作为阳性药物。10 70年的雌性老鼠,老鼠sham-operated和治疗以去离子水为对照组。剩下的60切除卵巢的老鼠双边和同样随机分成6组,与胃内的政府的去离子水OVX模型控制,nylestriol每周(1毫克/公斤),积极控制,icariin(40毫克/公斤)日报》curculigoside每天(20毫克/公斤),小檗碱(120毫克/公斤)日报》或淫羊藿(40毫克/公斤)浓度的组合,curculigoside(20毫克/公斤),和小檗碱(120毫克/公斤)每日为治疗组,所有12周。老鼠从第一天开始接受治疗手术后卵巢切除术的成功也证实了验尸未能检测卵巢组织和观察子宫角显著萎缩。在治疗结束时,所有的老鼠都撤回的血样,轨道窦方法和离心收集血清生化参数的测量。子宫摘除并立即重。
胫骨被去除清洗附着软组织并存储在75%乙醇一周之前的分析。骨矿物质密度(BMD)及骨矿物质含量(BMC)测定在3毫米从右胫骨近端骺外围定量ct (
p QCT)微(Stratec XCT研究SA,德国)。血清碱性磷酸酶(ALP)、tartrate-resistant酸性磷酸酶(陷阱)和血清肌酐(Cr)是衡量一个自动分析仪(美国Ciba-Corning 550)使用诊断试剂盒测定。血清osteoprotegerin(功能)和deoxypyridinoline交叉连接(DPD)估计使用酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。本研究中使用的实验协议Bioethic委员会批准第二军医大学,和使用的程序都严格按照公认的国际规则和条例。
2.3。分析的形成、分化和破骨细胞的骨吸收
2.3.1。破骨细胞诱导,25-Dihydroxyvitamin < inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " 1 " > < mml: mrow > < mml: msub > < mml: mrow > < mml: mi > D < / mml: mi > < / mml: mrow > < mml: mrow > < mml: mn > 3 < / mml: mn > < / mml: mrow > < / mml: msub > < / mml: mrow > < / mml:数学> < / inline-formula >和地塞米松Coculture骨髓细胞与成骨细胞系统
主要从新生大鼠颅盖的成骨细胞成骨细胞的细胞准备根据文献[
18 ]。破骨细胞的诱导和文化如下。短暂,股骨脱节于Wistar鼠年龄在3天,和末端被移除,骨髓细胞使用1毫升注射器被刷新。主要的成骨细胞的细胞(1×105 /毫升)和骨髓细胞(1×106 /毫升)cocultured在
α mem培养基含有10%的边后卫,1 25-dihydroxyvitamin D3 (10 nmol / L)和地塞米松(100 nmol / L)在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2 。电镀前的细胞,眼镜(5×5毫米)或牙片(40
μ 米厚)放入培养皿中。的形成多核破骨细胞(跨国公司)经陷阱染色和吸收坑上形成牙片。监测细胞被播种到文化板块
α mem培养基。中取代了第二天用新鲜培养基含有1.0
μ 淫羊藿,浓度M 1.0
μ M curculigoside, 1.0
μ 小檗碱,或它们的组合(包括1.0
μ 淫羊藿,浓度M 1.0
μ 1.0 M curculigoside,
μ 小檗碱)表示时间。所有文化都维持在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2 在。破骨细胞是用来调查破骨细胞的形成,陷阱和组织蛋白酶K的活动,和骨吸收活动。
2.3.2。计数的TRAP-Positive多核破骨细胞
主要成骨细胞和骨髓细胞被放在96 -孔板包含封面眼镜和培养
α mem培养基含有10%的边后卫,1 25-dihydroxyvitamin D3 (10 nM)和地塞米松(100海里),24 h。细胞被处理或者没有我,C, B,他们结合了10天,彩色的陷阱陷阱(不染色工具包。387 a-1kt;Sigma-Aldrich)。与三个或更多核细胞是算作osteoclast-like多核破骨细胞在显微镜下。
2.3.3。分析陷阱活动
主要的成骨细胞和骨髓细胞
α mem培养基含有10%的边后卫,1 25-dihydroxyvitamin D3 (10 nM)和地塞米松(100海里)被放置在一个96 -菜文化,培养了6天,然后对有或没有我,C, B,他们结合48 h。陷阱决心如下:细胞与PBS洗两次,然后20
μ L 0.1% Triton x - 100添加到细胞诱导在室温下溶解。15分钟后,100年
μ L底物溶液(4-nitrophenylphosphate二钠0.4克和2.0克酒石酸钾溶解在去离子水的200毫升,pH值调整到3.5 1 mol / L盐酸)添加到细胞溶解细胞和孵化在37°C为30分钟,100年的反应是终止
μ L 1 mol / L每个,氢氧化钠和吸光度测量在405海里。同时,陷阱的阳性细胞数和活动表示为nanomoles陷阱
p 硝基酚每分钟每100人破骨细胞。
2.3.4。测定组织蛋白酶K的活动
主造骨细胞(2×106 )和骨髓细胞(2×107 )
α mem培养基含有10%的边后卫,1 25-dihydroxyvitamin D3 (10 nM)和地塞米松(100海里)被置于24-well文化板块,培养7天,然后对有或没有我,C, B,他们结合48 h。离心收集的细胞,细胞溶解在50
μ L冷冻CK细胞裂解缓冲,孵化冰上10分钟,然后涡5分钟。CK反应缓冲(50
μ L)和CK衬底Ac-LR-AFC 10毫米(2
μ L)被添加到样品和混合解决方案是在37°C的环境2 h。样品被转移到一个96孔板;发出荧光的强度测量荧光计配备了400 nm激发过滤器和一个505海里排放过滤器。
2.3.5。测定骨吸收
主要的成骨细胞和骨髓细胞悬液被播种到井96 -文化板块消毒骨片(40
μ 米厚,5毫米×5毫米)。后24 h文化
α mem培养基含有10%的边后卫,1 25-dihydroxyvitamin D3 (10 nM)和地塞米松(100海里),细胞治疗有或没有我,C, B, 12天的组合。牙片治疗1 mol / L NH超声波4 哦,去除附着细胞和0.1%甲苯胺蓝染色的解决方案。吸收坑在显微镜下观察;20视觉领域的每个牙片被随机选择测量坑面积与图像分析软件(德国徕卡Q550IW)。吸收之和坑面积20随机计算视觉领域吸收坑面积每个牙片。测试化合物的抑制作用在骨吸收的吸收坑面积表示为牙科切片处理测试化合物/吸收坑面积控制×100%。
2.4。分析破骨细胞的细胞骨架
2.4.1。破骨细胞诱导- csf和RANKL从骨髓细胞
5×107 骨髓细胞培养在6-well板包含
α mem补充10%的边后卫和5 ng / mL - csf在湿润的气氛中5%的有限公司2 为24小时。不依从细胞收集和培养
α mem培养基含有10%的边后卫和50 ng / mL - csf 3天。细胞保持井的底部被认为是骨骨髓来源的巨噬细胞和培养
α 包含10%的边后卫,mem 50 ng / mL - csf和100 ng / mL RANKL。培养基被替换为新的中等每3天,6天之后,细胞分化成成熟的破骨细胞。破骨细胞被用来研究肌动蛋白的形成环,分析调节蛋白的表达。
2.4.2。测定肌动蛋白形成的环
监测细胞(1×106 )诱导- csf和RANKL被播种到10×10毫米玻璃盖玻片和治疗有或没有我,C, B, 4 h和他们的组合。破骨细胞然后用新鲜4%多聚甲醛固定在PBS 15分钟,与PBS洗了三次,然后用0.1% permeabilized Triton x - 100在PBS 10分钟。f -肌动蛋白在细胞标记了rhodamine-conjugated phalloidin培植了30分钟的黑暗。细胞核染色在37°C与5 10分钟
μ g / mL赫斯特33258解决方案,在PBS进一步洗后,这些细胞被安装在甘油。标本观察使用共焦激光扫描显微镜(德国徕卡TCS-SP5)和适当的过滤器的组合和镜子。
2.5。免疫印迹
从新生大鼠细胞cavarial成骨细胞和破骨细胞诱导- csf和RANKL从骨髓细胞(如部分所述
2.4。1 )治疗有或没有我,C, B, 24小时的组合。细胞细胞溶解在缓冲区包含20 mM Tris-HCl, 150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%,蛋白酶和磷酸酶抑制剂。溶菌产物(30 - 40毫克)分离10% SDS PAGE和转移到聚乙二烯二氟化物膜。与5%的脱脂牛奶,阻塞后膜对anti-OPG和RANKL对成骨细胞或anti-phospho Akt,兵,物,p38和我
κ 对破骨细胞- b。相同的膜被剥夺和reprobed和化学发光信号检测凝胶医生2000发光图像分析仪(Wealtec Dolphin-Doc,美国)。
2.6。统计分析
实验重复三次5复制样品。数据表示为均值±标准差和单向方差分析,其次是Dunnett
t 以及用于统计分析(PASW 18.0软件;美国芝加哥SPSS Inc .),是水平的意义
P
<
0.05
(*),
P
<
0.01
(* *),
P
<
0.001
(* * *)。
来确定化合物协同行动,我们使用了概率和测试(
问 (测试)
19 ,
20. ]。使用的公式如下:
问
=
E
一个
+
B
/
(
E
一个
+
E
B
- - - - - -
E
一个
×
E
B
)
。在这里,
一个
和
B
表明化合物
一个
和复合
B
;
E
是变化的速度在治疗组与对照组的平均值。
E
一个
+
B
真实的反应比例和吗
(
E
一个
+
E
B
- - - - - -
E
一个
×
E
B
)
是预期的反应率。
(
E
一个
+
E
B
)
是概率的总和在化合物和复合B是单独使用。
(
E
一个
×
E
B
)
的概率是细胞应对这两个化合物单独使用时。当
问
< 0.85,结合被认为是敌对的;当
问
>
1.15
,被认为是协同组合;当
问
在0.85和1.15之间,结合被认为是添加剂。
3所示。结果
3.1。银行独立委员会在骨质疏松性小鼠切除卵巢的减少骨质流失
如表所示
1 卵巢切除术,12周后,胫骨骨矿物质含量(BMC)和骨密度(BMD)显著降低,骨小梁和虚假的老鼠相比,但在皮质骨并没有改变。管理nylestriol总量显著增加,胫骨骨小梁BMC和BMD与OVX控制。政府的我,C、B和骨小梁的显著增加BMC和BMD和总BMD,但没有改变总BMC胫骨。他们组合的影响比单个化合物更有效。这些结果表明,C, B,骨小梁的组合提高BMC和BMD,减少骨质疏松引起的卵巢切除术。
表1
影响的我,C, B,及其组合对骨矿物质含量(BMC)和骨密度(BMD) OVX小鼠(
n
=
10
)。
组
BMC(毫克/毫米)
弹道导弹防御(毫克/厘米3 )
总
小梁
皮质
总
小梁
皮质
虚假的控制
1.77±0.27
0.45±0.13
0.89
±
0.17
500±23
220±25
898年
±
19
OVX控制
1.56±0.13
0.33±
0.08
Δ
Δ
Δ
0
。
82年
±
0.13
426±
20.
Δ
Δ
Δ
114±
16
Δ
Δ
Δ
910年
±
19
Nylestriol
1.86±0.21 *
0.43±0.04 * *
0.78
±
0.14
508±29 * * *
205±20 * * *
9
1
6
±
28
OVX + I(40毫克/公斤)
1.67±0.09
0.40±0.08 * *
0.8
1
±
0.16
449±31 *
157±25 * *
906年
±
20.
OVX + C(20毫克/公斤)
1.62±0.07
0.37±0.09 *
0.7
9
±
0.12
466±34 * *
162±30 * *
885年
±
19
OVX + B(120毫克/公斤)
1.56±0.12
0.38±0.11 *
0
。
86年
±
0.15
437±45
149±27 * *
881年
±
26
OVX + I(40毫克/公斤)B + C(20毫克/公斤)+(120毫克/公斤)
1.52±0.20
0.42±0.05 * *
0.92
±
0.17
482±25 * *
195±22 * *
889年
±
19
所有的值表示为平均数±标准差,ΔΔΔ
P
<
0.001
与虚假的集团;*
P
<
0.05
,* *
P
<
0.01
,* * *
P
<
0.001
与OVX组。
如图
1 我管理C B及其组合没有引起子宫重量的增加,抑制切除卵巢的老鼠的体重增加,淫羊藿,抑制浓度除了身体重量增加。血清deoxypyridinoline肌酐比值(DPD / Cr)交叉连接,陷阱水平是骨吸收的生化标记,和高山是骨形成的一个标志。卵巢切除术诱导骨高营业额通过显著增加小鼠血清DPD / Cr,陷阱,和高山的水平。Nylestriol降低血清DPD / Cr、陷阱和高山水平和抑制骨高营业额OVX小鼠。管理我,C, B,和他们的结合降低血清DPD / Cr和陷阱的水平,但没有减少血清ALP水平。功能(osteoprotegerin)是一种内源性蛋白质产生的成骨细胞的细胞,抑制破骨细胞形成和活化。卵巢切除术功能降低血清水平,相比之下,nylestriol增加血清功能。我,C、B和组合功能显著增加水平切除卵巢的老鼠。这些结果表明,C, B,和他们的组合增加骨质密度通过抑制骨吸收,显示活动高于单个化合物及其组合。因此,影响和交互的我,C和B进一步追究他们的作用机理和相互交互监测骨吸收。
影响我,B, C,他们的组合对切除卵巢的骨质疏松性老鼠。切除卵巢的老鼠管理与我(40毫克/公斤),B(120毫克/公斤),C(20毫克/公斤),他们的组合(我40毫克/公斤20毫克/公斤+ B + C 120毫克/公斤)为12周。然后,子宫和体重重,血清生化参数分析。(一)子宫重量;(b)体重;(c)高山活动;功能(d)内容;(e)陷阱活动;(f) DPD /肌酸。数据提出了均值±标准差(
n
=
10
)。
P
*
<
0
。
05年
,
P
*
*
<
0
。
01
,
P
*
*
*
<
0
。
001年
相比之下,OVX控制。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
3.2。银行独立委员会协同抑制破骨细胞形成和分化
澄清我的效果,C和B单独或组合在破骨细胞形成、骨髓细胞与成骨细胞来源于cocultured老鼠头顶的108 米1,25-dihydroxyvitamin D3 。许多TRAP-positive破骨细胞形成coculture系统在6天内回应1
α 25 (OH)2 D3 。如数据所示
2(一个) 和
2 (b) ,TRAP-positive多核细胞的数量明显减少,C和B或它们的组合。在破骨细胞的治疗我,C,或B, TRAP-positive多核细胞的数量减少到68.1%,70.7%,和63.5%的控制,分别。IB的结合,IC,公元前,IBC破骨细胞的数量减少37.1%,53.0%,46.0%,和21.4%的控制,分别。根据
问 值,结合IC,公元前和IB施加添加剂抑制效应,银行独立委员会的结合发挥协同抑制破骨细胞形成的影响。
抑制性的影响我,B, C,对破骨细胞的结合。(一)破骨细胞的形态变化(×200)。破骨细胞的coculture系统主要成骨细胞和骨髓细胞培养24小时,然后处理或不我,B, C,和他们的组合了10天。(b)破骨细胞是治疗10天,然后染色陷阱,和那些拥有三个或更多核被算作osteoclast-like多核破骨细胞在显微镜下。(c) coculture系统中破骨细胞的主要成骨细胞和骨髓细胞培养6天,然后处理或没有我,B, c, 48小时和他们的组合。陷阱活动来衡量
p -nitrophenyl磷酸钠化验。(d)细胞被视为陷阱分析中描述,和组织蛋白酶K的活动是由一个荧光计测量配备了400 nm励磁过滤和505海里排放过滤器。数据平均值±标准偏差。实验重复三次5复制样品(
n
=
5
)
P
*
<
0
。
05年
,
P
*
*
<
0
。
01
,
P
*
*
*
<
0
。
001年
相比之下,控制。列的数量
问 值,指示我之间的交互,B和C。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
陷阱与监测骨吸收活动直接相关,如图
2 (c) 48小时后,治疗,陷阱活动明显被我镇压,B, C,以及他们的组合。破骨细胞的治疗我,B和C,陷阱的活动减少到89.4%,分别为80.9%和90.4%的控制。IB的结合,IC,公元前,IBC陷阱活动下降到74.8%,77.6%,74.9%,和60.2%的控制,分别。根据
问 价值,IB和BC对添加剂抑制效果;集成电路和银行独立委员会对协同抑制对陷阱破骨细胞活性的影响。
另一个可能的机制抑制成熟破骨细胞的骨吸收是影响我,B, C,和他们的组合可以减少骨基质降解通过抑制组织蛋白酶K (CK)活动(
21 ];因此,我们进一步评估对组织蛋白酶K的影响破骨细胞在胞外酶活性测定使用合成基质Ac-LR-AFC和重组组织蛋白酶K .如图
2 (d) ,我,B和C抑制监测CK活性为86.4%,88.9%,和86.6%的控制,分别。虽然我的治疗组合C和B执行比单个化合物潜在的抑制影响,这些组合产生对抗或添加剂,但不协同,抑制性影响组织蛋白酶K称破骨细胞的活性
问 价值。
3.3。银行独立委员会协同抑制监测骨吸收
牙片与破骨细胞cocultured 12天。未经处理的牙片拥有一个同质表面。成熟的破骨细胞侵蚀这种同质表面和形式吸收坑。与甲苯胺蓝染色后,吸收坑蓝色很容易被识别。在实验条件下,显著减少骨吸收的数量和面积坑观察治疗的牙片的我,C, B,而控制组合。mono-treatment组,我,C,或B单独减少骨吸收池的面积为65.2%,67.5%,和62.4%的控制。Bitreatment I C和B减少骨吸收池的面积33.9%,36.8%,和39.4%的控制。ICB联合治疗减少骨吸收池的面积控制(数字的12.8%
3(一个) 和
3 (b) )。根据
问 值,我的组合,C和B施加轻微协同抑制破骨细胞的骨吸收的影响。这些结果表明,银行独立委员会结合加剧监测骨吸收的抑制作用。
抑制性的影响我,B, C,结合监测骨吸收。主要成骨细胞和骨髓细胞cocultured消毒牙片
α mem培养基的1,25-dihydroxyvitamin D3 (10 nM)和地塞米松(100海里)和治疗有或没有我,B, C,和他们结合了12天。吸收坑在显微镜下观察,坑面积与图像分析软件量化。(一)骨吸收坑牙片(×100);(b)骨吸收坑面积的变化我的治疗,b, C,以及他们的组合。数据平均值±标准偏差。实验重复三次5复制样品(
n
=
5
)。
P
*
<
0.05
,
P
*
*
<
0.01
,
P
*
*
*
<
0.001
相比之下,控制。列的数量
问 值,指示我之间的交互,B和C。
(一)
![]()
(b)
![]()
3.4。银行独立委员会协同块RANKL-Induced破骨细胞细胞骨架组织
监测骨吸收是由破骨细胞在骨表面的附件。附件时,破骨细胞肌动蛋白环形式特点,细胞骨架结构必不可少的最佳监测骨吸收(
22 ]。确定ICB影响细胞骨架组织在破骨细胞,骨髓细胞培养在玻璃coverlips csf和RANKL有或没有我,C, B,他们的组合。肌动蛋白环被染色和可视化rhodamine-conjugated phalloidin评估骨吸收的早期阶段的活动。如图
4 ,共焦激光扫描显微镜显示,肌动蛋白环是密集的,有一些假足躺在他们的周围。破骨细胞的治疗我,C, B,及其组合导致虚足消失;f -肌动蛋白环中断,是宽松的薄在破骨细胞的胞质区。我的组合的影响,C, B和f -肌动蛋白的形成环比个人更有效的化合物,表明我,C和B可以表现为协同作用影响细胞骨架组织,这是由破骨细胞骨吸收所必需的。
图4
影响的我,B, C,及其对f -肌动蛋白的结合环。破骨细胞培养在玻璃盖玻片4 h没有(控制)或存在的我,B, C,以及他们的组合。细胞被固定和贴上rhodamine-conjugated phalloidin和赫斯特33258年和共焦激光扫描显微镜下观察到。
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3.5。银行独立委员会提升的比率在成骨细胞功能和RANKL表达
在coculture系统中,成骨细胞RANKL表达支持破骨细胞分化的祖细胞的反应维生素D3 和地塞米松
23 ]。因此,它是必要的,以确定是否这些antiosteoclastogenic化合物直接影响破骨细胞前体细胞或间接瞄准成骨细胞,从而调节功能和RANKL的表达,这对破骨细胞分化和活动是至关重要的因素。在成骨细胞的治疗我,C, B,和他们的组合24 h,在成骨细胞功能相关蛋白的表达增强,2.38,2.42,4.13,3.29,2.11,1.18,和1.32倍的控制,分别;相对蛋白质RANKL的表达分别为1.09,1.06,1.14,0.72,0.53,0.22,和0.39倍的控制。因此,功能的蛋白表达水平的比率和RANKL是2.17,2.29,3.62,4.56,3.98,5.37,和3.36倍的控制(图
5 )。这些结果表明,B, C,以及他们的组合可以在成骨细胞功能调节/ RANKL系统,导致破骨细胞分化的抑制coculture模型系统。
影响我,B, C,他们组合在成骨细胞的功能和RANKL的表达。主要从新生大鼠成骨细胞的细胞治疗头顶有或没有我,B, C,以及他们的组合24 h。(一)蛋白质功能的表达和RANKL的比率。(b)蛋白质功能和RANKL的表达是由西方墨点法。
β 肌动蛋白作为内部参考。数据平均值±标准偏差。实验重复三次5复制样品(
n
=
5
),
P
*
<
0
。
05年
,
P
*
*
<
0
。
01
,
P
*
*
*
<
0
。
001年
相比之下,控制。
(一)
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(b)
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3.6。银行独立委员会导致降低等级的磷酸化信号MAPKs通路
RANKL刺激增加一种蛋白激酶的磷酸化ERK,物和p38在破骨细胞,激活的NF -
κ 需要我的磷酸化- B途径
κ B (
24 ]。因此,我们下一个决定我是否,C, B,他们的组合可能会影响这些激酶信号通路有关。如图
6 的破骨细胞,治疗我,C和B,我的磷酸化
κ B和ERK表达下调,他们的组合显示更强的抑制效果比单个化合物。使用我和C单独调节p38的磷酸化,IB的结合,公元前,这个激酶和IBC显著下降;增加了一种蛋白激酶的磷酸化和物;所有与我和C B的结合减少了一种蛋白激酶的磷酸化和物。这些结果表明,银行独立委员会协同减少RANKL的磷酸化在MAPK信号通路,导致减少监测骨吸收。综上所述,我们的研究结果建议的合理性EXD在治疗骨质疏松症。
影响我,C, B, RANKL-induced信号通路及其组合。破骨细胞诱导的骨髓细胞- csf和RANKL治疗24 h和评估物的磷酸化ERK, p38 MAPK和Akt、我的退化
κ B
α 通过免疫印迹。
β 肌动蛋白作为内部参考。
(一)
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(b)
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4所示。讨论
在这项研究中,我们发现,在切除卵巢的老鼠,结合使用EXD的活性成分,即icariin(我),(B),小檗碱和curculigoside (C),显著增加骨密度和骨矿物质含量和监管血清生化参数。在细胞水平上,IBC抑制形成、分化,并通过调节破骨细胞的骨吸收功能/ RANKL系统在破骨细胞的成骨细胞和MAPKs通路。的评估
问 值的概率和测试直接证明了我的协同效应,对监测细胞B和C。这些结果清楚地表明,组件的相互强化的EXD施加影响。然而,IBC并不表现出了不利影响在切除卵巢的小鼠模型中,所显示的身体和子宫重量的变化,符合EXD的安全。这些观察结果与公式的合理性协议在这项研究中,相互强化的化合物,减少负面影响。
监测骨吸收是由形成新的破骨细胞和破骨细胞的微活动。成熟的破骨细胞的特点是multinuclearity,陷阱染色,组织蛋白酶K的活动,一个肌动蛋白环结构,折边边界,在吸收和酸性细胞条件(
13 ]。如图
2 ,暴露我的破骨细胞,B, C,以及他们的组合的数量显著降低TRAP-positive多核细胞和陷阱的活动和组织蛋白酶K和诱导肌动蛋白的破坏环,表明我,B, C,以及他们的组合降低了pit-forming破骨细胞的活性,通过触发肌动蛋白的直接破坏环和通过抑制破骨细胞形成和成熟破骨细胞的生存。Icariin,展品最强的疗效切除卵巢的骨质疏松性老鼠,也被证明是EXD在目标监测骨吸收的主要成分(
16 ];B和C提高我监测形成的抑制效应,分化,和骨吸收,增加的影响。因此,EXD公式证明了其理性的现代生化分析。
NF -受体活化剂
κ B配体(RANKL)和osteoprotegerin(功能)合成了成骨细胞监测的形成中扮演着重要的角色,分化和骨突起活动(
7 ]。RANKL提供了一个信号,破骨细胞祖细胞通过受体激活剂NF -
κ B(排名)激活破骨细胞分化和功能。功能块之间的交互RANKL和受体。换句话说,功能抑制osteoclastogenesis虽然RANKL支持破骨细胞的骨吸收
25 ]。因此,可以评估骨重塑RANKL功能的相对比例。在目前的研究中,我,B, C,以及他们的组合RANKL功能的相对比例显著增加,表明他们抑制骨吸收的调节成骨细胞的功能和RANKL的表达。
秩信号与RANKL诱发互动招聘和激活的肿瘤坏死因子receptor-associated因素(TRAFs),导致MAPK途径的激活,包括ERK p38和物
9 ]。ERK通路参与的负调控osteoclastogenesis [
6 ]。然而,p38和物通路已被证明RANKL-induced破骨细胞分化过程中发挥重要作用[
26 ]。破骨细胞凋亡是由一些信号分子,包括TRAF6, Src, PI3 K / Akt, ERK和NF -
κ B通路(
27 ]。这是在我们的研究中发现,ERK的phosporylation Akt,物,和我
κ B是略有下降,破骨细胞p38增加后管理;ERK的磷酸化表达下调后C和B单独管理;ERK的磷酸化,Akt, p38物,我-
κ B的破骨细胞显著下调后结合我和C或/和B。这些结果表明,C和B已经通过MAPK通路及其组合不同的调节机制有更强的抑制性影响破骨细胞的这些信号蛋白的磷酸化。
值得指出的是,中国药用配方可能复杂变化通过结合各种草药或他们的选民。有些人可能会增强或减少的影响,中度或消除原有有毒副作用;有些人可能促进交付原则元素的体内疾病的网站(
28 ]。EXD, Epimedii叶和Curculiginis根茎具有相似的性质和影响他们的组合可以加强彼此的行动。Phellodendri对皮层具有不同的药理作用从Epimedii叶和Curculiginis根茎但可以帮助提高他们的治疗效果
17 ]。我,C和B是主要有效成分Epimedii叶,Curculiginis根茎,分别和Phellodendri对皮层。它可能是一个有趣的观察在这个工作,银行独立委员会处理降低了监测骨吸收与我单独治疗相比,而我结合C和/或B功能显著上调,并会使RANKL。因为功能调节,RANKL表达下调后24 h银行独立委员会处理;其他一些事件也可能参与增强我的行动C和B在早期阶段。有趣的是,同样的结果也观察到在MAPKs通路。P38的phosporylation ERK Akt,物,和我
κ B是略有下降后政府,而这些信号蛋白的磷酸化是大幅下调后结合我和C或/和B。这些结果表明,C和B可能帮助我EXD公式来调节这些关键的途径。
淫羊藿,浓度的antiosteoporotic活动和机制curculigoside,小檗碱都已经被广泛地研究过了。Icariin提高成骨细胞的分化和增殖和促进矩阵通过诱导BMP-2钙化,BMP-4,随后,没有合成,调节Cbf
α 1 / Runx2、功能和RANKL基因表达和激活BMP信号(
29日 - - - - - -
32 ]。Icariin也抑制监测分化和减少了能动性和监测骨吸收
29日 ,
33 ]。这些监管,淫羊藿对浓度的影响骨重塑也与雌激素的活动(
30. ,
31日 ]。Curculigoside已经明确对成骨细胞和破骨细胞的影响,提高血管内皮生长因子的表达,在成骨细胞的骨形成protein-2 MC3T3,并防止氢peroxide-induced障碍和氧化损伤在头顶成骨细胞(
34 - - - - - -
36 ]。小檗碱抑制RANKL-mediated破骨细胞形成和通过抑制NF -生存
κ B和Akt激活(
37 ]。在成骨细胞的细胞,增强小檗碱成骨的标记基因的表达,包括骨桥蛋白和骨钙素通过激活Runx2 p38 MAPK [
38 ]。淫羊藿,浓度这些发现表明curculigoside,小檗碱调节骨代谢通过多目标和途径。此外,EXD含有各种活性成分,包括类黄酮、酚甙、生物碱类、蒽醌、有机酸、多糖。很可能是一个复杂的相互作用的活性成分存在于多个目标。因此,保护EXD对骨质疏松的影响以一种相似的方式实现,multiactive组件施加其影响通过多目标和途径;然而,这些需要更深入地调查。
总之,目前的研究澄清,淫羊藿,浓度之间的互动关系对破骨细胞curculigoside,小檗碱。这支持中医的理论公式,使用multiherbs或其成分可以提供相互强化和援助从而提高治疗效果相比,个人成分。