文摘

本研究调查了神经活动的红参提取物(RGE,人参c . a . Meyer)对海人酸(KA)诱导会引起在体外和在活的有机体内。在海马细胞,RGE抑制KA-induced会引起剂量依赖性的方式以MTT测定。研究对KA-induced RGE-mediated神经保护作用的可能机制细胞毒性,我们对细胞内活性氧的水平(ROS)和(Ca^{2 +}]_我在培养的海马神经元和发现RGE治疗剂量依赖性抑制细胞内ROS和Ca^{2 +}]_我海拔高度。口服RGE(30和200毫克/公斤)的小鼠减少丙二醛(MDA)水平引起注射KA(30毫克/公斤,i.p)。此外,类似的结果在与激进的食腐动物Trolox和预处理后N,N′-dimethylthiourea (DMTU)。确认后最后,RGE的保护作用海马脑源性嗜神经因子(BDNF)蛋白水平,我们发现RGE活性化合物的混合物在KA-induced海马mossy-fiber功能改进。此外,RGE消除1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl自由基(DPPH)和IC₅₀大约是10毫克/毫升。RGE的还原活性,以与氢氧自由基反应(^•哦),类似于trolox。RGE的二阶速率常数^•哦是3.5 -米⁻¹ 年代⁻¹。因此,这些结果表明,RGE具有激进活动减少和减轻KA-induced淬火ROS会引起的海马神经元。

1。介绍

人参c·a·迈耶(五茄科)是使用最广泛的药用植物之一,尤其是在传统中药,治疗各种疾病。它有一个广泛的药理和生理行为(1,2]。红参提取物(RGE)来自一个人参植物培养4 - 6年以上,经过广泛的清洗、蒸、干燥过程(3]。热处理的人参98 - 100°C 2 - 3 h增加生产非极性或高压下lesspolar Rg等皂甙₃,Rg₅,Rg₆,猕₂、RK₁。这些改进的生物活性人参产品结果从化学成分的变化,发生在热气腾腾的治疗(4]。此外,麦芽酚的含量(3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone)增加了热量人参的处理。酚类化合物的抗氧化活性与化学结构。一些酚类化合物的结构活性关系(例如,类黄酮、酚酸和单宁)曾研究[5- - - - - -7]。在一般情况下,自由基清除和抗氧化活性酚醛树脂(如黄酮和酚酸的含量)主要取决于数量和位置hydrogen-donating芳环上的羟基酚分子和影响因素如苷配基的糖基化和其他H-donating团体(nh, sh)。有很多报告抗氧化成分,通常专注于酚酸(5,8,9]。RGE既有刺激抑制影响中枢神经系统(CNS)和可能调节神经传递(10]。一些研究报道,RGE氧化剂,记忆力增强,抗高血压,反应力的影响(11,12]。红参吸烟者免受氧化损伤和减少癌症风险与吸烟有关13]。RGE已经报告给清除羟基自由基(^•哦),DPPH,和超氧化物自由基14]。

兴奋性氨基酸(eea)如谷氨酸是众所周知的主要神经递质调节突触激发在脊椎动物中枢神经系统15]。谷氨酸对中枢神经系统神经元双重行为,作为一种兴奋性的神经递质在生理和神经毒性物质浓度超过当礼物。谷氨酸也被牵连到神经细胞死亡的起始条件下中风、癫痫、中枢神经系统和其他形式的侮辱。谷氨酸杀死神经细胞通过受体介导途径或抑制半胱氨酸吸收和氧化途径16]。卡是谷氨酸模拟excitotoxic属性(17,18]。众所周知,KA诱发细胞内钙的高度^{2 +}并通过coactivation细胞外谷氨酸水平的n -甲基- d(门冬氨酸)受体。Glutamate-evoked Na⁺涌入也被提议为急性神经毒性的形式(19,20.]。海马苔藓纤维(MF)癫痫(发芽是一个潜在的治疗目标21,22]。BDNF蛋白的诱导是曼氏金融途径最为明显(21]。

活性氧(ROS)是细胞氧化代谢所产生的副产品。氧化应激是一种因果关系,或者至少一个辅助因子在几个成人神经退行性疾病的神经病理学23]。众所周知,ROS KA-induced神经元损伤中发挥作用。越来越多的证据表明,海马氧化侮辱可能参与KA-induced神经毒性在活的有机体内(24,25),在体外。自由基生成的直接证据在KA培养视网膜神经元的刺激所提供的电子自旋共振(ESR)谱26,27]。ESR是一个复杂的光谱技术检测自由基或无机配合物在化学和生物系统28]。spin-trapped自由基的ESR谱已成为首选的方法形成自由基的检测和识别在生物系统29日,30.]。spin-trapping技术利用硝酸试剂应用于自由基的检测已经超过三十年。Nitrone旋转陷阱ESR研究中使用,因为他们特别激进与自由基反应形成加合物与更长的寿命比最初的自由基。生物应用,nitrone旋转陷阱等5 5-dimethyl-l-pyrroline-N氧化物(DMPO)已经使用最频繁29日]。

尽管RGE的广泛使用,它的知识对glutamate-mediated毒性的作用机制或保护作用是有限的。在这项研究中,为了说明这些问题,我们研究了在kainate-induced RGE的保护作用及可能机制会引起海马神经元。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

RGE是请提供的韩国人参合作(韩国大田市)。RGE收益率为4.37%皂苷:Rb人参皂苷的主要组件₁(12.6%)、Rb₂(6.2%)、Rc (6.9%)、Rd(3.4%)、再保险(6.4%)、射频(2.1%)、Rg₁(15.8%)和Rg₃(1 4%)。这些成分是由韩国人参标准化和合格的合作。KA ((2 s, 3 s, 4 s) -carboxy-4 - (1-methylethenyl) 3-pyrrolidineacetic酸)是购自Tocris (Ellisville,密苏里州,美国)。BDNF是购自Abcam Inc .(美国Cambridge, MA)。的OXYTEK硫代巴比土酸反应物质(TBARS)试验设备购买的亚历克西斯(美国纽约Farmindale)。6-Carboxy-2′, 7′二乙酸-dichlorofluorescin (DCFH-DA)和fura-4 /我从分子探针Inc .)购买(尤金,或者美国)。DMPO购买从恩佐(美国普利茅斯会议上,PA)。硫酸亚铁(铁₂所以₄ 7小时₂O)、过氧化氢(H₂O₂30%),diethylenetriamene pentaacetate(二乙三胺五醋酸),DPPH, 6-hydroxy-2, 5, 7, 7-tetramethyl-chromane-2-carboxylic酸(Trolox) DMTU, 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT),和其他化学物质都是高质量的,并从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。动物

雄性ICR小鼠(Samtako、乌山、韩国)重- g用于在活的有机体内实验()。动物被安置在丙烯酸笼子(45厘米×60厘米×25厘米)与水和食物随意下一个人工12 h光/暗周期(光在7:00)和恒定的温度(°C)。老鼠被安置在部门间1星期前测试,以确保适应新环境。所有涉及实验动物进行按照美国国立卫生研究院的指导的实验室动物保健和使用(NIH没有出版。85 - 23,1985年修订)。制度来自韩国忠北国立大学动物保健和使用委员会批准了这项协议。

2.3。主要海马神经元细胞培养和KA曝光

大鼠海马神经元的主要文化准备的海马E18-19 Sprague-Dawley (SD)鼠胚胎和培养根据先前所描述的方法31日]。海马解剖和孵化0.25%木瓜蛋白酶在Ca^{2 +}和毫克^{2 +}无汉克的平衡盐溶液在37°C为20分钟。细胞被磨碎然后用fire-polished巴斯德吸量管机械分离和镀poly-L-lysine涂盖玻片在35毫米文化菜肴。细胞被维护在Neurobasal / B27中含有0.5毫米谷酰胺,25岁μM谷氨酸,25μM 2-mercaptoethanol、青霉素100单位/毫升和100μg / mL链霉素在湿润的气氛中95%的空气和5%的公司₂在37°C,一半的媒介改变了每2天。海马神经元培养KA(100前12 - 14天μ米)。RGE(0.01 - -1.0毫克/毫升)增加了0.5 - 1 h KA治疗前。

2.4。细胞生存能力分析

细胞生存能力分析进行描述(32]。表示时报曝光后,神经元被化验可行性使用MTT(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),这是添加在最后5毫克/毫升的浓度为4 h。MTT摘除,神经元细胞溶解于200年μL(二甲亚砜(DMSO)。吸光度测量在570 nm SpectraMax M2多模标(CA桑尼维尔,美国)。数据表示为未曝光的神经元的比例仍在KA的存在。

2.5。细胞内ROS测量

生产活性氧在神经元的决心使用DCFH-DA(分子探针,尤金,或者美国)如前所述[33]。文化与10孵化μ在37°C M DCFH-DA 30分钟。DCFH-DA移除后,这些细胞被记录下来。DCFH-DA-loaded细胞被置于SpectraMax M2多井荧光标仪(美国桑尼维尔CA)激发在515 nm和排放552海里。由布拉德福德测定蛋白质浓度。

2.6。细胞内钙的测定

fura-4 acetoxymethyl酯形式(分子探针,尤金,或者美国)被用作荧光Ca^{2 +}指标。在室温下海马细胞孵化60分钟与5μ普朗尼克f - 127 M fura-4 / AM和0.001%在HEPES-buffered溶液组成(150毫米)氯化钠,氯化钾,1 MgCl₂2 CaCl₂,10个玫瑰,10葡萄糖。与氢氧化钠pH值调整到7.4。细胞被洗HEPES-buffered解决方案和放在SpectraMax M2多井荧光标(CA桑尼维尔,美国)。发出荧光计算使用荧光分析仪和转化为细胞内自由钙^{2 +}浓度(Ca^{2 +}]_我。

2.7。脂质过氧化作用分析

脂质过氧化物的形成进行了分析通过测量TBARS匀浆,所描述的Suematsu et al。34]。的OXYTEK TBARS分析工具是用于这些测量。脂质过氧化是决定使用自己的协议通过测量吸光度在532 nm,表示为nmol丙二醛(MDA) /毫克的蛋白质。海马的蛋白质浓度测定使用布拉德福德化验。

2.8。免疫印迹分析

与冰冷的PBS细胞收获,洗两次,和细胞溶解在冰上裂解缓冲了30分钟,与涡流每5分钟。溶菌产物随后在14000转离心5分钟去除不溶性材料。蛋白质浓度测定的布拉德福德(Bio-Rad)用BSA作为标准方法。脑源性神经营养因子、蛋白质在16% sds - page凝胶分离。凝胶随后被转移到PVDF膜(Amersham Hybond TM-P,通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)为2 h electroblotting 60 - 75 V。膜被封锁在Tris-NaCl缓冲5%脱脂牛奶的解决方案(TNT)含0.5% Tween-20和孵化主要抗体表示。单克隆驴anti-rabbit免疫球蛋白辣根peroxidase-conjugated二级抗体被用于1:3000。蛋白质是由增强化学发光检测使用商业套装(Amersham)。

2.9。1,1-Dipheny-2-picrylhydrazyl (DPPH)测定

稳定自由基的清除DPPH RGE是化验spectrophotometrically [35]。乙醇(0.1毫米)的DPPH(控制)是用不同浓度的彻底混合RGE(清廉毫克/毫升),在517 nm和吸光度是阅读。RGE的DPPH自由基清除活性度的百分比计算抑制抑制(%)

2.10。^•用ESR哦清除活动

^•哦,是由芬顿反应生成系统,并生成的^•哦迅速反应与nitrone旋转陷阱DMPO [29日]。合成DMPO /^•哦,加合物检测ESR谱仪。RGE(0.2毫升)在不同浓度混合了DMPO(0.2米,0.2毫升),铁₂所以₄(2.0毫米、0.2毫升)和H₂O₂(2.0毫米,0.2毫升)在磷酸盐缓冲溶液(100 mM, pH值7.2),和混合物被转移到一个石英ESR测量扁平细胞。混合物在室温下进行的ESR腔(24 - 25°C)。反应后,ESR谱被记录在室温下使用ESR (JEOL杰斯特- 300)光谱仪(JEOL, Inc .,东京,日本)配备了TE_102年腔。实验条件如下:磁场,太;权力,2.2兆瓦;调制频率,9.44 GHz;振幅,;扫描时间,0.5分钟。结果表明,产生抑制或减少50%所需要的时间信号峰高(IH₅₀用ESR)。

2.11。统计分析

数据意味着±SEM。结果进行统计比较,分析了使用单向方差分析(方差分析)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。在重大变化的情况下,个人价值观与Holm-Sidak测试。

3所示。结果

3.1。RGE保护Kainate毒性

评估对KA-induced RGE细胞毒性的保护作用,我们研究了细胞死亡主要MTT测定海马神经元。神经元受到KA在浓度为0,30、50、70和100μM 48 h(图1(一))。图2表明,细胞死亡是快速、生长抑制%的控制水平后48 h (KA曝光。当细胞暴露在100年μ米卡,细胞死亡是重要的48 h后(图1)。海马神经元的接触到100μM的KA 48 h引起细胞存活率明显下降,而KA-induced神经元损失被抑制%,%通过增加0.01和1.0毫克/毫升RGE的分别(图1)。此外,%,100年%抑制细胞死亡了μM trolox DMTU分别。当我们探索的角色non-N-methyl-D-aspartate(门冬氨酸)受体,会引起KA-induced细胞死亡被20μM 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2 3-dione (CNQX) non-NMDA受体拮抗剂。这些结果表明,RGE可以保护神经元免受KA-induced细胞毒性。

3.2。RGE对氧化应激的影响

因为KA引发氧化损伤在培养小鼠神经元,我们检查了RGE是否影响100人μM KA-induced ROS水平主要由DCFH-DA测定海马神经元细胞。低水平的ROS在控制(被发现荧光强度),这些值被认为是生理上的。相比之下,ROS浓度被显著增加,强度值治疗后,100年μM KA 48 h。如图2,ROS水平显示的强度值和在剂量的0.1和1.0毫克/毫升RGE的分别。Trolox和DMTU也表现出了抑制活性氧产量在100 KA最高剂量μM(图2)。总的来说,这些结果表明,100年μM KA治疗提升ROS生产和预处理,0.1至1.0毫克/毫升的RGE显著降低ROS生产(图2)。这些结果表明,RGE可以保护神经元免受KA-induced会通过其抗氧化作用。

3.3。抑制钙^{2 +}涌入

在氧化谷氨酸毒性、细胞内ROS增加100倍导致胞质Ca的高程^{2 +}先于细胞死亡。调查RGE的保护机制与KA-induced神经毒性,我们检查了RGE能否抑制KA-induced细胞内(Ca^{2 +}]_我在培养的海马神经元。我们测量(Ca^{2 +}]_我水平使用Ca^{2 +}指标,fura-4。如图3,100年μM KA治疗导致的重要高程(Ca^{2 +}]_我(数据没有显示)。% (Ca的抑制^{2 +}]_我海拔RGE在海马神经元%,%,%,在剂量的0.01,0.1,和1.0毫克/毫升,分别在Ca^{2 +}]_我在正常控制被认为是100%(图的水平3)。RGE在治疗剂量的0.01、0.1和1.0毫克/毫升抑制KA-induced (Ca^{2 +}]_我海拔剂量依赖性的方式。相比之下,治疗trolox、DMTU或CNQX轻微的影响。这些结果表明,100年μ米卡处理培养的海马神经元的提升(Ca^{2 +}]_我这种效应是减毒的治疗RGE在浓度为0.01,0.1和1.0毫克/毫升。

3.4。RGE抑制MDA水平

自由基可能会引起病变的主要原因之一。因此,我们预计使用TBARS测定自由基生成。TBARS水平,脂质过氧化作用的指标,显著增加小鼠的海马中对待KA存在剂量依赖的相关性相比对照组(车辆)没有收到压力源代理。然而,与30和200毫克/公斤剂量的预处理RGE 10天显著预防KA-induced TBARS浓度的增加。完全抑制脂质过氧化反应是观察到200毫克/毫升的RGE(图4)。动物只有RGE在治疗剂量没有提出变更TBARS水平(数据没有显示)。

3.5。RGE的DPPH自由基减少活动

人参的活动通常被解释为它的抗氧化功效。识别RGE的氧化还原电位,分析了DPPH自由基的减少(RGE + DPPH)混合解决方案。图5表明,RGE回收DPPH自由基存在剂量依赖的相关性,以及集成电路₅₀RGE是大约10毫克/毫升(图5)。Trolox用作积极控制回收100%的DPPH自由基在0.25毫克/毫升。

3.6。^•哦,RGE减少活动

^•哦芬顿反应生成的系统被DMPO困,可检测到一个ESR谱仪。典型的1:2:2:1 DMPO / ESR信号^•哦,加合物(G)是观察如图6(一)。每个光谱得到芬顿反应开始后15分钟。RGE抑制了芬顿反应的反应^•哦。此外,如图6 (b)的信号DMPO /^•哦,加合物随时间逐渐下降。衰变率显示大约一个符合一级动力学测量(10分钟),在此期间的半衰期DMPO /^•哦信号估计为8.15分钟。减少活动的顺序芬顿反应系统DMTU > RGE > trolox。是类似于trolox RGE减少活动。DMTU的活动,RGE trolox分别为5.76,7.5和8.17分钟,分别。估计二阶速率常数米⁻¹ 年代⁻¹trolox和米⁻¹ 年代⁻¹DMTU。从这些结果,可以估计RGE的明显的二阶速率常数^•哦。因此,我们表明,RGE反应^•哦,活动减少,RGE的二阶速率常数^•哦,大约是3.5 -米⁻¹ 年代⁻¹。

3.7。KA受伤后BDNF蛋白水平的变化

寻找内源性物质对EAA保护行动,我们研究了海马脑源性神经营养因子表达的变化引起的KA(图7)。BDNF蛋白KA后减少曝光。Downregulation KA诱导的海马BDNF蛋白高于控制水平增加了RGE治疗。减少脑源性神经营养因子的表达,以应对KA被CNQX得罪了。此外,轻微的脑源性神经营养因子表达的变化被发现在trolox和DMTU治疗。总的来说,这些数据表明,RGE是一个活跃的化合物在KA-induced海马mossy-fiber功能改进。

4所示。讨论

我们的研究结果清楚地表明,RGE,使用最广泛的药用植物之一,具有显著的抗氧化/神经保护效应对海人酸(KA)诱导会引起在体外和体内。我们发现,RGE减少在体外毒性引起的KA,一个强有力的神经毒素。KA抑制细胞死亡和Ca的一代^{2 +}]_我ROS在海马神经元和在海马组织中MDA和BDNF水平增加。此外,RGE拥有^•哦,减少活动芬顿反应系统使用ESR谱仪测量。

卡是一个特定的KA受体激动剂和选择性ionotropic谷氨酸受体激动剂。谷氨酸毒性病理细胞死亡的主要因素是在神经系统和似乎是由活性氧(36]。氧化谷氨酸毒性也被牵连到神经细胞死亡的起始条件下中风、癫痫、中枢神经系统和其他形式的侮辱。^•哦,是一种强氧化剂。ESR是首选的工具检测和识别自由基和广泛应用。ESR spin-trapping技术是唯一可行的光谱检测技术^•哦,在生理状态下(29日,30.,37]。为^•哦,信号检测,我们使用了芬顿反应系统,如图6。RGE抑制了芬顿反应的反应^•哦,因为它快速的初始速度和高二级速率常数。DPPH和ESR spin-trapping数据是很好的证据表明RGE的激进活动减少(数字5和6)[38,39]。此外,我们估计RGE的二阶速率常数/^•3.5 -哦米⁻¹ 年代⁻¹。

哺乳动物海马扮演关键的角色不同的认知功能,包括记忆。在氧化应激Glutamatergic海马的信号变化。培养的大鼠海马神经元谷氨酸是一个有用的模型,研究系统。如图的毒性实验1,RGE发挥神经保护效应对glutamate-induced神经毒性。这些影响可以解释为氧化还原抗氧化系统,虽然我们不能排除其他的参与机制。抗氧化剂在食品和药用植物(或草药)近年来吸引了兴趣。的主要药物活性成分人参皂苷含量,由四根与亲水疏水环人工催结构糖。免费的,单体的、二聚的或三聚物的糖注定羟基(^•哦)carbon-3、6和-20的皂苷含量。他们也存在立体异构体。这差向异构化作用的选择性攻击发生^•哦,消除后的残糖基在C-20蒸的过程。此外,人参皂苷less-polar如RGE已知很容易消除产生的H₂O在RG C-20物种在高压力和温度条件下高压灭菌法。酚类化合物普遍存在于植物和已报告有多种生物效应,包括抗氧化活性(8,40,41]。酚类化合物和麦芽酚有很强的自由基清除活性42,43]。此外,hydroxypyrone螯合活性的结构,就像其他铁螯合剂等desferrioxamine(柴油),是非常重要的。基于这些原因,可能的活性酚提取RGE是由于其hydrogen-donating能力或螯合能力。

细胞内钙含量通常很低(~ 10⁻⁷米)。过度积累细胞内钙是关键过程导致神经元死亡或受伤。门冬氨酸受体激活通道,使大量细胞外钙和钠(44]。这种类型的谷氨酸受体的过度刺激导致神经细胞钙超载。AMPA和KA受体与Na⁺透水通道。去极化的主要发起是AMPA受体的激活,随后压敏电阻器钠离子通道的激活。这导致钠进入和进一步的去极化。Na⁺流入可以参与有毒过程造成渗透压力(20.开压控钙通道),通过去极化。此外,钙^{2 +}涌入会损害神经元通过激活多种酶。如果细胞成为长期去极化的,NMDA受体将放弃其镁块,成为供突触谷氨酸激活。它的激活是一个钙离子进入细胞的主要来源。细胞内钙的持续增加^{2 +}浓度(Ca^{2 +}]_我发起excitotoxic过程最终延迟神经元死亡。

主要在海马KA是有毒的,高亲和性KA结合位点。寻找内源性物质有针对EAA的保护作用,我们研究了海马脑源性神经营养因子表达的变化。神经营养因子的蛋白质家族组成的神经生长因子(神经生长因子),BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6, NT-7调节周围神经系统的生存和分化(pn)和中枢神经系统神经元(45]。近年来,证据积累,BDNF扮演一个额外的海马突触可塑性的重要作用促进发射器从突触前释放终端或增强突触后NMDA受体的功能。因此,它是可能的,门冬氨酸神经毒性的衰减是由扩散因素引起纹状体分泌的细胞,如神经营养因子与脑源性神经营养因子。活性氧引起的物质保护神经元免受压力等^•哦,可能有一种角色可以促进海马mossy-fiber在中枢神经系统的功能。

5。结论

RGE保护海马神经元毒性由于KA-induced增加(Ca^{2 +}]_我、ROS、MDA水平。RGE反应和DPPH^•哦,具有激进活动减少,二阶速率常数^•哦是3.5 -米⁻¹ 年代⁻¹。RGE减轻KA-induced淬火ROS会引起的海马神经元。

确认

这项工作是支持的优先研究中心项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科技部(2011 - 0031403),由医学研究中心项目(2010 - 0029480)和区域核心研究项目(来自韩国忠北位研究型大学联盟)通过韩国国家研究基金会和2011年授予韩国社会的人参韩国人参公司资助的。