文摘

这项研究的目的是调查的放松的活动机制ent-15年α-acetoxykaur-16-en-19-oic酸(KA-acetoxy)。在大鼠肠系膜动脉环,KA-acetoxy诱导浓度放松与去甲肾上腺素血管订婚。在缺乏内皮细胞,血管舒张明显向右平移不减少最大的效果。Endothelium-dependent松弛显著减毒通过与L-NAME预处理,NO-synthase的抑制剂(NOS),吲哚美辛,环氧酶的抑制剂,L-NAME +吲哚美辛,阿托品,非选择性拮抗剂的毒蕈碱的受体,ODQ, guanylyl酸环化酶酶的选择性抑制剂,或羟钴胺素、一氧化氮清道夫。放松完全逆转的L-NAME + 1毫米精氨酸和精氨酸,一个没有前兆。Diterpene-induced放松并不影响茶,K +通道的非选择性抑制剂。引起的KA-acetoxy CaCl₂全身收缩浓度的方式,也抑制了一个80毫米KCl-induced收缩。KA-acetoxy没有干扰^{2 +}从细胞内释放商店。诱导的vasorelaxant KA-acetoxy似乎涉及到Ca的抑制^{2 +}涌入,至少部分由内皮细胞毒蕈碱的受体激活,没有和PGI₂释放。

1。介绍

使用替代疗法、草药和补品发生在一个非常高的速度在心血管疾病包括高血压患者(1]。高血压病是影响10亿人的一个主要公共卫生问题,和大约每年710万人死亡可能归因于高血压(2]。治疗这种疾病与植物衍生品是发表在文献[3]。

几种药用植物研究很大程度上是和他们的治疗潜力已经证明了动物,旨在为治疗的应用提供科学依据。在这种背景下,我们突出的影响和重要性药用植物含有抗高血压二萜及其行动。例如,巴豆zambesicus用于在非洲传统药物治疗高血压。从提取的植物二萜孤立诱导血管放松和抗高血压效应(4,5]。的Marrubium vulgare是一种植物作为抗高血压药。原油提取降低收缩压在自发性高血压大鼠(6]。

Guatteria juruensis一昼夜的(番荔枝科)是一个大型的灌木或小树产于中美洲和南美洲。各种属的物种Guatteria一直作为药物治疗淋病、肾脏结石,和糙皮病,以及利尿剂(7]。KA-acetoxy (ent-15年-acetoxykaur-16-en-19-oic酸)是一种kaurane-type二萜,孤立的从这种植物的叶子。

萜类化合物是天然产物(最大的家庭8,9)和分类的同源系列5号碳异戊二烯单位的结构:半松油精C5(1异戊二烯单位)、单萜C10(2)异戊二烯单位,倍半萜烯C15(3)异戊二烯单位,二萜甜(4)异戊二烯单位,和三萜C30(6异戊二烯单位)(10]。

生物化验表明,二萜对低血压患者和降压作用。kaurenoic酸放松隔离大鼠主动脉阻断细胞外钙^{2 +}封锁,涌入NO-cGMP通路的激活,K的开放⁺渠道(11,12]。甜菊苷、二萜糖苷生产vasorelaxant和低血压的效果在老鼠13,14]。的ent-pimara-8 (14), 15-dien-19-oic酸通过抑制细胞外钙降低血管阻力^{2 +}流入和释放endothelium-derived放松因素(15]。的二萜ent-8 (14), 15-pimaradien-3ol也诱导血管松弛(16]。其他三个ent-kaurane衍生物隔绝Oyedaea verbesinoides(菊科)诱导放松在主动脉环17]。

基于这个前提,很明显,研究特征的重要性的心血管活动kaurane-type二萜,因为这些化合物可以是一个有前途的来源众多生物活性分子的发现和开发新型降压药3]。

在广泛的药理筛选表现在我们的实验室中,我们观察到在孤立的肠系膜上的老鼠KA-acetoxy产生平滑肌松弛剂作用。本研究旨在阐明机制KA-acetoxy vasorelaxant效应诱导的大鼠分离肠系膜戒指。

2。方法

2.1。植物材料

的叶子Guatteria juruensis一昼夜的收集(番荔枝科)2001年8月Mocambo储备,贝伦市附近,巴西的帕拉州确定的番荔枝科专家豪尔赫·奥利维拉博士从位于Paraense埃米利奥Goldi (MPEG)。凭证标本(没有。148.677)上MPEG的植物标本,贝伦,对位,巴西。

2.2。KA-Acetoxy程序隔离

干和粉叶(5.230 g)在索氏提取器。第一次使用的溶剂正己烷、氯仿,最后EtOH。己烷提取冷却后产生白色沉淀。这个沉淀,过滤和洗涤后热己烷,产生KA-acetoxy (5.38 g)。KA-acetoxy被确定通过光谱方法,主要是1 d和2 d核磁共振ent-15年-acetoxykaur-16-en-19-oic酸(18)(图1)。实际上只是用热己烷,KA-acetoxy获得作为一个纯化合物,根据与熔点(mp = 178 - 180°C)与文献相比,通过光谱方法。的隔离KA-acetoxy以前所描述的(19),其结构已阐明基于红外光谱、1 h - NMR和13 c 1 d和2 d-spectroscopic技术包括部门、HETCOR, HMBC, NOESY。

2.3。药物

使用以下药物:硫酸阿托品,乙酰胆碱盐酸盐(ACh),吲哚美辛,氯化硝基精氨酸甲酯(L-NAME) L-phenylephrine(检)、精氨酸、乙二醇国际清算银行(- - - - - -aminoethylether) - N, N, N′, N′-tetraacetic酸(EGTA),咖啡因,hydroxycobalamin (HDX),四乙铵(茶),和1H- - - - - - (]oxadiazolo [4 3 -]quinoxalin-1-one (ODQ)从σ(所有)。KA-acetoxy是可溶性的混合物蒸馏水cremophor 10毫米的浓度与蒸馏水稀释至所需浓度之前使用。吲哚美辛w / v小苏打溶解在0.5%。ODQ准备为原液二甲亚砜(DMSO)。在Ca EGTA添加^{2 +}无Tyrode的解决方案。自由另一化合物溶解在蒸馏水。最后cremophor和DMSO浓度在浴缸里从未超过0.01%时不影响测试控制制剂(数据未显示)。

2.4。动物

雄性Wistar鼠g(200 - 300)被用于实验。实验协议和程序批准Laboratorio de Tecnologia Farmaceutica动物保健和使用委员会。动物被安置的条件下控制温度(°C)和照明(光6:00-18:00 h)和能获得食物和自来水随意。

2.5。组织准备

老鼠被惊人而放血。肠系膜上动脉被移除,清洗从结缔组织和脂肪和分组环(1 - 2毫米),暂停的棉线在器官浴Tyrode包含10毫升的解决方案(作文mm:氯化钠:158.3:氯化钾:4.0;CaCl₂:2.0;MgCl₂:1.05;不₂阿宝₄:0.42;NaHCO₃:10.0;和葡萄糖:5.6),毒气毒死carbogenic混合物(95%啊₂和5%的公司₂在37°C),并保持等距紧张的录音。下1 h的稳定时间是0.75 g的静息张力。在这段时间里,解决方案是改变每15分钟以防止代谢物的积累。等长张力是由一个测力传感器记录(美国模型GM2 Gould)耦合到一个放大器记录器(古尔德,美国)。内皮是被轻轻地擦拭血管的内膜的表面。内皮功能的存在是由乙酰胆碱的能力评估(ACh) (10μ米)诱导80%以上的婚约血管放松板式换热器(10μ米)。没有放松的ACh被作为证据,该船段内皮功能剥蚀。

2.6。KA-Acetoxy对肠系膜上戒指订婚与板式换热器或K⁺去极化的解决方案(80毫米氯化钾)

在第一组实验中,KA-acetoxy导致血管放松的能力是评价endothelium-intact和endothelium-denuded肠系膜动脉环以前萎缩了板式换热器(10μ米)。根据板式换热器持续收缩引起血管暴露在浓度累积KA-acetoxy (10⁻⁶1毫米)。

在第二组实验中,稳定时间后,戒指没有内皮预约与氯化钾80毫米在主音阶段和不同浓度的KA-acetoxy (10⁻⁶1毫米)添加累计器官浴。放松的程度被表示为去甲肾上腺素的比例——或者KCl-induced收缩。

2.7。验证Endothelium-Derived产品和毒蕈碱的受体参与KA-Acetoxy的放松的效果

探讨可能的机制(s)负责KA-acetoxy诱导放松,准备与内皮预约了板式换热器为早期孵化后30分钟以下抑制剂之一:阿托品(1μ米),非选择性毒蕈碱的受体的拮抗剂,L-NAME (100μ米),一种抑制剂NO-synthase (NOS), L-NAME +精氨酸(1毫米),号基质,精氨酸,消炎痛(10μ米),环氧合酶(COX)的抑制剂,L-NAME +吲哚美辛,ODQ (10μ米),guanylyl酸环化酶酶选择性抑制剂,hydroxocobalamine (30μ米)、一氧化氮scaveng分开。

2.8。调查的角色K⁺渠道在KA-Acetoxy-Induced Vasorelaxant响应

Phe-induced持续收缩得到endothelium-intact和endothelium-denuded肠系膜动脉环与四乙铵孵化,K的非选择性抑制剂⁺通道(茶,5毫米),然后量效曲线KA-acetoxy获得。添加茶是前30分钟收缩与板式换热器。

2.9。KA-Acetoxy对CaCl引起的收缩的影响₂

为了访问KA-acetoxy对电压门控钙的影响^{2 +}渠道,肠系膜上动脉环沐浴在Ca 15分钟^{2 +}无Tyrode的解决方案,由只CaCl省略₂然后为额外的暴露15分钟高K⁺(60毫米)^{2 +}无解决方案。这个新的实验条件下,累积浓度CaCl响应曲线₂(从1μ米到10毫米)。KA-acetoxy (3、30、100、300μ米,或1毫米)添加到准备30分钟,然后一个新的CaCl累积量效曲线₂是确定。获得的最大收缩CaCl控制量效曲线₂为100%,计算所有值的百分比最大响应。每一个被暴露在只有一个diterpene-concentration做准备。所有的实验都使用endothelium-denuded肠系膜上动脉环。

2.10。KA-Acetoxy对去甲肾上腺素的影响——在Ca和Caffeine-Induced收缩^{2 +}无解决方案

KA-acetoxy对去甲肾上腺素的影响——或咖啡因敏感细胞内钙商店是评估通过一个协议所描述的坂田、卡拉奇(20.]。瞬态在内皮收缩了剥蚀环10μM法或20毫米咖啡因在Ca^{2 +}无解决方案孵化与KA-acetoxy前后(100μ米、300μM为20分钟或1毫米)。响应的结果表示为百分数法或咖啡因引起的孤独。

2.11。统计

为了研究KA-acetoxy的影响诱导放松,两个药理参数进行分析:(最大效应产生的受体激动剂)和帕金森病₂()。结果表示为意味着±标准平均误差(SEM)。学生的以及和单向方差分析(方差分析)使用Bonferroni期末测验是用来分析数据,结果被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。KA-Acetoxy对肠系膜上戒指订婚与板式换热器的影响——或者K⁺去极化的解决方案(80毫米氯化钾)

表1浓度的方式表明,KA-acetoxy完全和放松的去甲肾上腺素诱导动脉收缩段完整的内皮。在endothelium-denuded船只,有一个量效曲线显著右转KA-acetoxy没有变化而控制。在环内皮预约与K⁺去极化的解决方案(氯化钾80毫米),KA-acetoxy明显的量效曲线向右移没有变化而phenylephrine-contracted endothelium-denuded船只(pD₂=和=%)。

针对板式换热器在戒指的大小收缩引起的,没有内皮功能是0.42和0.44 g,分别。同样,收缩氯化钾诱导的戒指的大小没有内皮是0.40克。震级之间没有明显差异。

3.2。验证Endothelium-Derived产品和毒蕈碱的受体参与KA-Acetoxy的放松的效果

与L-NAME孵化(100μ米)、吲哚美辛(10μ或L-NAME(100米)μ+吲哚美辛(10米)μ米)明显的量效曲线向右平移KA-acetoxy。以同样的方式,在可溶性guanylyl酸环化酶抑制(ODQ 10μHDX(30米)μ米),一氧化氮scaveng或毒蕈碱的封锁(阿托品1μ米)减少KA-acetoxy-induced放松和产生一个向右位移量效曲线的化合物。然而,精氨酸(1毫米)或精氨酸+ L-NAME (100μ米)KA-acetoxy-induced放松(表上没有显著的影响1)。的大小收缩引起的板式换热器g孵化后的抑制剂或拮抗剂。相比没有显著差异的大小收缩引起的板式换热器在缺乏抑制剂或拮抗剂。

3.3。调查的角色K⁺渠道在KA-Acetoxy-Induced Vasorelaxant响应

在endothelium-intact和剥蚀戒指订婚板式换热器(10μ米)、茶叶(5毫米),K的非选择性抑制剂⁺渠道,无法改变KA-acetoxy(表松口2)。

3.4。KA-Acetoxy对CaCl引起的收缩的影响₂

在此实验条件下,KA-acetoxy不平行,产生浓度CaCl右转₂量效曲线明显减少最大响应如图2。

3.5。KA-Acetoxy对去甲肾上腺素的影响——在Ca和Caffeine-Induced收缩^{2 +}无解决方案

肠系膜下环Ca^{2 +}无解决方案,KA-acetoxy不抑制瞬态收缩引起的10μM苯肾上腺素或咖啡因(图20毫米3)。

4所示。讨论

目前的工作是为了调查可能的血管舒张作用的KA-acetoxy隔离大鼠肠系膜上动脉。是观察到的二萜诱导浓度在孤立的大鼠肠系膜上动脉血管舒张。结果还表明,血管扩张性效果的有两个组件:一个内皮依赖性和其他内皮独立。

血管内皮中扮演一个重要的角色在体内平衡调节血管平滑肌语气和作为主要目标站点高血压和动脉粥样硬化。调节血管舒张的内皮是由三个主要组件;不,环前列腺素和内皮衍生超极化因子(EDHF)。这些endothelium-derived放松因素扩散到相邻的平滑肌细胞和使他们放松21,22]。是否常认为效果可能涉及的释放或PGI₂,我们用L-NAME执行实验,没有合酶的抑制剂,消炎痛,一个强有力的非选择性COX抑制剂,另行规定。在L-NAME或消炎痛,KA-acetoxy明显的量效曲线向右平移与减少,这表明没有和环氧酶通路参与KA-acetoxy vasorelaxant效应。

精氨酸,一种没有前兆,肯定得罪了L-NAME的效果,但是当单独添加它并不影响KA-acetoxy引起的风头。这个没有合酶底物的能力增加引起的松弛KA-acetoxy可能解释的有足够的大量的精氨酸血管内皮。的的精氨酸酶值是1.5到2.3μ米(23]。此外,羟钴胺素、一氧化氮scaveng [24),引起了重大的二萜的量效曲线向右移endothelium-intact戒指,再次表明,KA-acetoxy部分的作用与代没有血管内皮。

在大多数血管床,毒蕈碱的受体(M的刺激₃亚型)产生强烈的扩张,尽管缺乏血管胆碱能神经支配(25]。负责放松的毒蕈碱的受体位于内皮细胞和他们的刺激会导致释放EDRFs,主要不,扩散到相邻的平滑肌细胞和使他们放松21]。确定KA-acetoxy-induced没有释放可能继发的刺激内皮M₃受体(26),我们进行实验完整肠系膜上动脉早期孵化与阿托品的准备工作。在这些准备工作,vasorelaxant KA-acetoxy效果减弱;换句话说,KA-acetoxy明显的量效曲线向右平移与减少。这些结果表明,双萜部分可以通过内皮细胞毒蕈碱的作用受体激活和顺向cGMP的参与途径。

众所周知,没有引起血管平滑肌放松通过guanylyl酸环化酶的激活,导致环磷鸟苷的积累。松弛血管平滑肌的NO-cGMP信号包括一系列的步骤。没有释放激活可溶性guanylyl环化酶。这种酶催化GPT, cGMP的转换。cGMP-activaed蛋白激酶G抑制Ca^{2 +}流入,增加Ca^{2 +}封存,并减少收缩元素Ca的敏感性^{2 +}(27]。因此,为了验证NO-GMPc通路参与KA-acetoxy的影响在目前的研究中,准备与ODQ孵化,可溶性guanylyl环化酶抑制剂。在这种情况下,量效曲线与减少KA-acetoxy转移到正确的二萜引发的,这表明松弛剂反应涉及NO-sGC-GMPc通路。

EDHF扮演小角色在导管血管血管活性的反应,它搭建起了一个主要组件的响应endothelium-dependent阻力动脉血管舒张药(28- - - - - -30.]。EDHF是有争议的化学特性,尽管epoxyeicosatrienoic酸,细胞色素p - 450的花生四烯酸的代谢产物,已经被提议作为可能的候选人EDHF [31日,32]。如前所述,EDHF的身份仍然是有争议的,不为人知的酶负责生产。如何调查EDHF vasorelaxant行动的参与与否KA-acetoxy吗?Endothelium-dependent放松耐考克斯和NOS-inhibitors以前认为是归因于EDHF [33- - - - - -35]。为了测试这个假说;我们准备孵化L-NAME和吲哚美辛,同时进行。在这种情况下,KA-acetoxy-induced血管舒张是减毒,但不可能消除。因此,我们建议KA-acetoxy vasorelaxant行动的机制涉及的参与没有和PGI₂以及可能EDHF的参与。但是还需要进一步的实验来清理机制。

血管舒张由膜超极化是由于K⁺渗透率。直接激活K⁺频道通常动脉平滑肌细胞超极化细胞膜,从而抑制Ca^{2 +}通过电压敏感Ca涌入^{2 +}渠道(36]。此外,据报道在文献中,激活K EDRFs诱导血管舒张⁺渠道(37]。此外,一些天然产物已被证明诱导vasorelaxant通过K的激活效应⁺渠道(38,39]。旨在调查K的参与⁺二萜渠道vasorelaxant活动引起的准备与四乙铵早期孵化,一个非选择性K⁺通道阻断剂。这个条件,vasorelaxant活动,并没有改变,这表明K⁺通道是没有参与KA-acetoxy vasorelaxant效应引起的。

维护平滑肌收缩取决于Ca^{2 +}流入从细胞外空间通过电压和/或receptor-operated钙通道(船承运人和/或受体的钙通道,分别地。)(40]。众所周知,收缩肾上腺素能受体受体激动剂,如苯肾上腺素,是由Ca^{2 +}从细胞内释放商店,紧随其后的是激活的Ca^{2 +}激活渠道导致血管平滑肌细胞膜去极化和电压门控钙的活化^{2 +}渠道(41]。而high-K⁺全身的平滑肌收缩是由细胞膜去极化,增加钙流入通过船承运人(42]。在这两种情况下,主要产生的效果是增加细胞内钙离子浓度通过钙条目。

因此,建议二萜的残余vasorelaxant效应是由于机制独立于内皮细胞,可能阻塞活动Ca^{2 +}频道。基于这个假设,我们评估的影响KA-acetoxy与K endothelium-denuded戒指订婚⁺去极化的解决方案(氯化钾80毫米)。KA-acetoxy能够抑制收缩引起的氯化钾(80毫米)endothelium-denuded肠系膜戒指。这一结果表明,KA-acetoxy可能抑制Ca^{2 +}通过船承运人涌入。

为了加强上述假说,KA-acetoxy CaCl的存在进行了测试₂在一个没有钙的去极化介质全身收缩。这个协议是基于CaCl的事实₂全身收缩引起,几乎完全通过Ca^{2 +}涌入,因为去极化得到高浓度的细胞外K⁺诱发的压敏电阻器^{2 +}渠道(43]。在此实验条件下,KA-acetoxy不平行,产生浓度CaCl右转₂量效曲线显著减少最大响应。

释放细胞内存储Ca^{2 +}主要是由IP₃受体系统(IP₃Rs)和阿诺定受体系统(RyRs)。前者诱发Ca^{2 +}当受体直接释放注定IP₃。后来通过Ca可能功能^{2 +}诱导Ca^{2 +}释放(CICR)机制当咖啡因的受体被激活(44]。这些商店的调查参与vasorelaxant KA-acetoxy引起的反应,我们进行实验使用环收缩了苯肾上腺素或咖啡因,在Ca^{2 +}无解决方案,在没有和二萜的存在。因此,KA-acetoxy不抑制瞬态苯肾上腺素和咖啡因引起的收缩,表明复合不影响细胞内钙钙动员的商店。

KA-acetoxy是一个密切相关的衍生物与kaurenoic cid (ent-kaur-16-en-19-oic酸)。同样,KA-acetoxy能够诱导血管舒张血管组织如kaurenoic酸。vasorelaxant行动所涉及的机制有一些相似之处,如细胞外钙^{2 +}涌入阻塞和激活NO-cGMP通路(11]。像其他二萜,KA-acetoxy也诱导vasorelaxant活动作用于多个站点的行动11,45,46]。这里描述的多个效果不可能造成KA-acetoxy对血管细胞的毒性。首先,代理的放松的效果是可再生的。其次,phenylephrine-induced收缩反应KA-acetoxy 60分钟后完全恢复。

最近,我们观察到KA-acetoxy诱发低血压活动与原发性高血压动物(里昂高血压大鼠)(未发表的数据)。众所周知,小动脉,肠系膜上动脉,发挥重要作用的决心外周阻力和血压的调节47]。我们可以建议假设低血压的反应可能是由于降低外周血管阻力引起的血管舒张,自从KA-acetoxy诱导血管舒张血压正常的大鼠肠系膜上动脉环。因此,vasorelaxant活动可以作为潜在的抗高血压治疗药物。

此外,只有物质抑制宫缩在氯化钾的测试模型值得进一步检查寻找天然钙拮抗剂。在这种背景下,氯化钾诱导的KA-acetoxy能够抑制收缩性。在这种情况下,可以认为KA-acetoxy可以发挥降压作用体内其他二萜11,14]。

总之,目前的研究表明,KA-acetoxy产生浓度和endothelium-dependent独立在肠系膜上动脉环血管舒张。Endothelium-dependent放松似乎是由于内皮毒蕈碱的受体激活,没有和PGI₂释放,以及可能EDHF的参与。通过抑制Ca Endothelium-independent放松KA-acetoxy行为^{2 +}涌入。

确认

金融支持从CNPq-Brazil承认感激地。作者报告没有利益冲突。独自负责的内容和作者写这篇文章。