中医伤口愈合机制研究，当归，使用蛋白质组学方法

抽象的

当归（AS）是一种传统中草药，临床上用于治疗各种形式的皮肤创伤并帮助伤口愈合。然而，它的工作机制仍然是个谜。在这项研究中，我们建立了一个新的平台，利用蛋白质组学和生化分析来评估总AS草药提取物及其主要活性成分阿魏酸（FA）的药理作用。检测AS乙醇提取物（AS提取物）和FA的细胞毒性和促增殖浓度，然后对细胞提取物进行2D PAGE分析。我们发现了51个差异表达的蛋白质点，并通过质谱鉴定。此外，涉及胶原分泌、迁移和活性氧测量的生物分子分析给出了与蛋白质组学分析一致的结果。在这项工作中，我们已经证明了一系列与药物相关的药理作用当归开发一个伤口愈合的药物制剂的草药时可能是有益的。

1.介绍

当归（AS），其被称为当归在中文中，已在医学中用于东亚超过两千年，包括中国，日本，韩国和印度。过去，正如主要用于治疗妇科病症和贫血[1，2]或用板蓝根lithosperme为帮助伤口愈合[3.]. 最近的研究表明，AS具有多种特性，包括调节免疫系统[4]和作为抗氧化剂[5]，抗炎药[6]，抗癌[7和其他人。AS的组成部分已被确定并分为两组;香精油及水溶性成分[8]. 阿魏酸（FA）是AS中最丰富的水溶性成分之一，据报道是AS的活性成分[9］．FA是突出作为ROS清除剂，因为它的结构是能够稳定苯氧自由基中间体。此外，FA还能够激活蛋白如血红素氧合酶-1（HO-1），热休克蛋白70（HSP70），ERK的½，和Akt，这有助于细胞对环境压力的反应[10.，11.］．

草药由于其复杂性和生物碱的毒性而难以分析。为了避免这些并发症，经常探索草药的单一活性成分的作用，并且这种单一活性成分代表了整个草药的作用；例如紫草宁板蓝根lithosperme［12.，和冬凌草宁Isodon Rubescens.［13.]. 然而，这种单一成分方法的缺点是，其结果永远不可能与整个草药的完整生化和药理学机制相同，并且可能无法揭示中药配方的真正机制。

蛋白质组学是一种强大的工具，已被广泛用于阐明药物治疗反应中的蛋白质谱变化和识别疾病相关的生物标志物。利用蛋白质组学,Rhizoma Paricis.总皂苷(RPTS)被鉴定为有助于这种传统药物的抗肝细胞癌效应(HCC)使用HepG2细胞[14.］．类似地，在蛋白质组学分析唐纳里亚rhynchophylla.（MIQ）杰克及其主要组分rhynchophylline能够证明在大鼠Kineic酸诱导的癫痫中的MIF和环托宾A表达中的上调[15.］．

当归（AS）是许多用于伤口愈合的中药的基本成分，例如shiunko[16.］．尽管如此已在动物模型和临床上应用，但是有助于帮助伤口愈合的机制保持澄清。因此，本研究的目的是探讨乙醇提取物的机制，其用生化和蛋白质组学方法施加对人体皮肤成纤维细胞的保护作用。这种方法还探讨了FA的药物活性水溶性组分的影响。基于这些发现，当用一些包含含有的中国传统草药治疗时，应该可以识别其有助于这些药理学效应。

2。材料和方法

2.1。HPLC分析

HPLC系统配备有BAS PM-80泵，DGU-20A5脱气剂，CMA / 170自动进样器和VARIAN（型号340）光电二极管阵列检测器。使用现象融合RP-80（2504.6mm，4m）进行色谱分离。流动相是乙腈（溶剂A）和2％乙酸（溶剂B）。对于对阿魏酸的分析，流动相涉及以下线性梯度：在0-15分钟的流速为1.0ml / min的25％a至75％a，并且检测波长设定为280nm。样品注射体积为20 μ.l

2.2。细胞培养

从生物资源保存和研究中心（BCRC）没有获得人类胚胎皮肤成纤维。60118（底特律551）。Cells were cultured in 10 cm culture dish (Corning) with minimum essential medium eagle (MEM) containing 2 mM L-glutamine, 1.5 g/L sodium bicarbonate, 0.1 mM nonessential amino acids, and 1.0 mM sodium pyruvate (MEM alpha-modifications, Sigma), supplemented with 10% fetal bovine serum (SAFC Bioscience), 50 units/mL penicillin, 0.05 mg/mL streptomycin, and 0.1 mg/mL neomycin (Sigma); the cells were grown in a humidified atmosphere at 37°C and 5% CO₂．传代时，当成纤维细胞在10cm培养皿中生长到约90%的汇合时，丢弃培养基，用5ml PBS洗涤细胞2次。然后用2 mg/mL EDTA和5 mg/mL胰蛋白酶在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中收获。用5 mL PBS洗涤2次后，1300 rpm离心5 min收集细胞。丢弃上清液，将细胞移入新鲜培养基中。然后将它们放入几个10厘米长的培养皿中。

2.3. 细胞活力测定（WST-1测定）

细胞活力测定法根据稍作修改的制造商的手册（Roche）的所描述的方法进行。这是细胞增殖的基于水溶性四唑盐（WST-1）通过在活细胞的线粒体脱氢酶裂解定量比色测定。药物处理的细胞以4×10的浓度接种⁴将1ml培养基中的细胞/孔（约40％汇合）中的1mL培养基中成为24孔培养基，并在37℃下在含有5％CO的培养箱中温育₂．细胞附着后，将它们用0.1％DMSO，300处理 μ.克/毫升AS提取物，或3.5 μ.mfa 24小时。The supernatant was discarded and cell proliferation reagent WST-1 (Roche) was added to each well at a 1 : 50 ratio with fresh culture medium. The cells were then incubated for an additional 1 hr in dark. The absorbance was measured at 450 nm using an ELISA reader (Thermo, Multiskan Spectrum), and the absorbance of the background was measured at 690 nm. The difference in absorbance between 450 nm and 690 nm indicates the relative cell viability compared to 0.1% DMSO. The experiments were performed with three replicates for each sample.

2.4。2D页面的样品准备

成纤维细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，并用1ml含10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、50 mM NaCl、1% NP-40、30 mM Na的NP-40裂解缓冲液裂解₂P₂O₇，30. mM NaF, 1 mM Na_3.vo.₄， 1%蛋白酶抑制剂，1%磷酸酶抑制剂(Sigma)。整个细胞裂解液在4°C下14000 rpm离心20分钟，去除不溶性物质。上清转移到浓缩器(GE Health, vivaspin 20, 100k MWCO)，在6000 ×g, 4°C下离心，直到体积小于500μ.L，然后用dH取代裂解液₂o含有1％蛋白酶抑制剂和1％磷酸酶抑制剂（Sigma）。通过Bradford蛋白质测定（Bio-rad）量化蛋白质浓度，并将样品直接用于2D页面分析。

2.5。使用2D页面分析蛋白质谱

根据制造商手册（Amersham Biosciences）中描述的方法进行的2D页面进行了较小的修改。对于第一维IEF，PH 4-7，IPG条带（18厘米）被400再合水 μ.L rehydration buffer (0.5% IPG buffer, 8 M urea, 2% CHAPS, 50 mM dithiothreitol (DTT), and a trace of bromophenol blue) for at least 4 hr before 100 μ.通过杯载荷加载蛋白样品。然后在以下条件下进行IEF：150 v 5小时步骤并保持，500 V，持续3小时并保持，7小时梯度，8000V，3小时梯度，8000V，8000V级 - 和 -抓住。在第二尺寸SDS-PAGE之前，用4mL平衡缓冲液平衡IPG条，含有50mM Tris-HCl pH 8.8,6M尿素，2％SDS，30％甘油，50mM DTT和0.01％室温下的溴苯酚蓝15分钟，然后在50mM Tris-HCl pH 8.8,6M尿素，2％SDS，30％甘油，5％碘乙酰胺中的平衡，在室温下为0.01％溴苯甲络蓝色15分钟．第二维SDS-PAGE使用12.5％分离凝胶，并且在没有堆叠凝胶的情况下进行。将平衡的IPG凝胶条带放置在SDS-PAGE的顶部，具有适当的压力，以确保条带和凝胶板之间的牢固接触。电泳在35mA /凝胶中进行，直到跟踪染料达到凝胶的底部。2D页面然后是银染色。

2.6。快速银染色

在2D页电泳后，除去凝胶，浸入固定溶液中（DH的40％甲醇和10％乙酸₂o）10分钟，用DH洗涤₂O两次10分钟，然后浸入溶液A（0.25mm硫代硫酸钠）中30分钟，然后由DH替换₂10人一组 然后将凝胶浸入溶液B（3.5 30毫米硝酸银） 用dH冲洗后的最小值₂O，a mixture of solution C (0.357 M) and solution D (4.37 mM) in dH₂o用于在2D页面凝胶上开发蛋白质点。将反应溶于5％乙酸。

2.7。2D页面凝胶的检测和定量分析

获得了2D页面图像，并使用ImageMaster 2D Elite软件5.0版（Amersham Biosciences）分析了每个点中的蛋白质的量。蛋白质点的体积定义为蛋白质点内像素单元的强度之和。为了校正蛋白质斑点强度的定量变化，点体积被标准化为给定凝胶中所有斑点的总体积的百分比。

2.8。LC-MS / MS的蛋白质鉴定

该过程描述于中国科学院生物化学研究所生物化学研究所（http://proteome.sinica.edu.tw/)这是经过轻微修改后使用的。从2D PAGE上切除选定的银染蛋白质斑点。然后用1.5%的溶液对其进行去银染色 : 1 Na₂年代₂o（0.1克在1毫升H中₂O） 和K₆铁(CN)₆(0.1 g in 1ml H₂O）in 25 mM ammonium bicarbonate until being transparent. Next the gel slices were added to 25 mM ammonium bicarbonate pH 8.5 for 10 min, vacuum-dried, and rehydrated with 50% acetonitrile in 25 mM ammonium bicarbonate pH 8.5 at room temperature for 10 min. The supernatant was then discarded and the sample vacuum-dried. Subsequently, the protein within the spot was trypsinized with 0.1% sequencing-grade modified trypsin (Promega, Madison, WI, USA) in 25 mM ammonium bicarbonate, pH 8.5, at 37°C for at least 16 hr. Each supernatant was removed into a new Eppendorf tube, then 25 mM ammonium bicarbonate pH 8.5 was added to the previous gel sample, and the mixture sonicated for 1 min, 10 times. The supernatant from this treatment was also removed into a new Eppendorf tube. The process was repeated a third time by adding 50% acetonitrile in 25 mM ammonium bicarbonate pH 8.5 to the sample, which was followed by sonication for 1 min, 10 times. The three extracted supernatants were pooled and evaporated to dryness under vacuum, and the dried pellet used to carry out integrated nanoLC-MS/MS system (Micromass) (National Research Program for Genomic Medicine, Academia Sinica). Eleven rare differentially regulated protein spots were identified by LC-MS/MS (Orbitrap) mass spectrometry system (Proteomics Research Center, National Yang-Ming University) in this way. The nanoLC-MS/MS data acquisition was carried out by Micromass ProteinLynx Global Server (PGS) 2.0 data processing software in a default mode and outputted as a single Mascot-searchable peak list (.pkl) file. The LC-MS/MS (Orbitrap) data were processed by SWQUEST (Thermo Finnigan). The peak list files were used to query the Swiss-Port version 2010_05 database using Mascot program version 2.2 (release date, 28-Feb-2007, Matrix Science, London, UK) with the following parameters: a taxonomy ofHOMO SAPIENS.(20,400 sequences), peptide mass tolerance of 50 ppm, MS/MS ion mass tolerance of 0.25 Da, trypsin digestion with one missed cleavage, no fixed modification, and the variable modifications considered were methionine oxidation, cysteine carboxyamidomethylation, lysine acetylation and phosphorylation of tyrosine, serine, and threonine. Only significant hits as defined by Mascot probability analysis were considered. Protein identifications were accepted with a statistically significant Mascot protein search score ≥36 or SEQUEST score = 2.5 (critical), which corresponds to an error probability of使用我们的数据集。具有最高得分的蛋白质鉴定被选择，以消除在数据库中蛋白质的冗余。

2.9。聚类分析和差异表达蛋白的功能分类

通过ImageMaster 2D Elite Software 5.0版（Amersham Biosciences，Sweden）在不同组中测量的每个蛋白质表达值的校准强度的曲线与平均连锁分层聚类算法（Upgma，未加权对算术平均分组方法）;这是使用分层聚类资源管理器3.5的完成[17.］．未命示的Pearson的相关系数被确定为相似度量的测量，并且最小相似性的阈值设定为0.8。在聚类后，将每个蛋白质分配其在全局时间分类颜色热图中的位置。我们使用了BGSSJ（批量基因搜索系统用于Java;http://bgssj.sourceforge.net/）[17.]和Swiss-Prot蛋白知识库，用于蛋白质的功能分类。

2.10。Western Blotting.

将来自成纤维细胞（底特特551）的蛋白质萃取通过12.5％SDS-PAGE分离，然后转移到硝酸纤维素（NC）膜上。将NC膜在TBST中在室温下用5％非牛奶封闭1小时并用各种一抗探测（抗P-ERK1 / 2（NO.9101），1：2000;抗ERK1 / 2（NO。9102），1：1000;抗P-AKT（NO.9271），1：1000和抗AKT（NO.9272），1：1000，细胞信号传导;抗TGF-β(sc-52829), 1 : 1000, Santa Cruz; anti-β-tubulin (T4026)， 1: 5000, Sigma Aldrich;抗hspb1 (ab39399)， 1: 1000;抗stmn (cb1047)， 1: 1000;TBST中5% BSA或脱脂乳中抗gstp1 (GTX112953)、1:3000和抗tpis (GTX104618)、1:3000,GeneTax)。洗涤NC膜后，用酶标二抗处理NC膜。使用化学发光成像系统(LAS-4000，富士胶片)进行化学发光显示，并使用富士胶片MultiGauge软件进行密度分析。2.0。结果用均数±标准差表示。学生的- 最低用于评估统计学意义，以及一个价值<0.05被认为是统计学意义（对于每个实验)。

2.11。细胞内活性氧(ROS)测定

测量DMSO后成纤维细胞的ROS含量，作为提取物或FA处理，H细胞内含量₂O₂使用氧化还原敏感荧光染料2'，7'-二氯流荧光素二乙酸酯（DCF-DA）（Sigma）测定，这与RO比成比例。简而言之，将细胞培养为汇合和胰蛋白酶化。离心后，重新悬浮丢弃上清液和细胞并与10孵育 μ.M DCF-DA (20 mM in DMSO for stock solution and stored in −20°C), which solved in 1 × PBS for 10 minutes at 37°C in the dark. Centrifuge again and cells were then washed and resuspended in fresh culture medium. A total of 8 × 10⁴将细胞加入96孔黑色平板酶联免疫吸附测定板(200孔)μ.L的媒介。ROS能够将DCF- da氧化为荧光DCF，因此细胞内ROS的相对浓度由荧光阅读器通过485 nm激发和538 nm发射来测定。学生的- 最低用于评估统计学意义，以及一个价值<0.05被认为是统计学意义（对于每个实验)。

2.12。Boyden室迁移测定

将细胞培养汇合后，将它们胰蛋白酶化，离心并重新悬浮在培养基中。共2×10⁴将成纤维细胞接种在Transwell（24孔，康宁）中并用DMSO处理，如提取物或FA;然后将Transwell插入没有气泡的培养基中。6小时后，从培养基中除去roustwell，使用甲醇固定10分钟。然后弃去甲醇，并且将细胞风干。最后，用5％Giemsa染色细胞（在DH中解决）₂O）在室温下过夜。跨孔用卫生署₂O，并且在Transwell小室的内细胞通过用棉签除去刮。通过Transwell小向下迁移细胞的数目显微镜下手动计数。学生的-检验用于评估统计显著性，a价值<0.05被认为是统计学意义（对于每个实验)。

2.13. 伤口愈合试验

总共2.5 × 10⁴将成纤维细胞接种在24孔板中的培养物（Ibidi）的两侧以产生500 μ.m±50. μ.在药物处理前细胞层之间的间隙。在电池附着后，仔细除去培养物。然后用各种药物处理细胞，将其加入到培养基中。然后将细胞孵育24小时。然后丢弃培养基，并且细胞用PBS洗涤两次以去除未连接的细胞。然后使用显微镜（OLYMPU）和测量间隙的尺寸来通过数码相机拍摄照片。学生的-检验用于评估统计显著性，a价值<0.05被认为是统计学意义（对于每个实验)。

2.14。Sircol Collagen测定

该方法在Sircol Collagen测定通用协议（Biocolor）中描述。简而言之，在药物处理后收集3ml细胞培养基，通过4m NaCl沉淀胶原，以避免FBS干扰。通过在室温下以15000×g离心收集胶原丸，将沉淀物溶于0.5ml 0.5m乙酸中。将1ml硫醇染料试剂与100混合 μ.L resolved collagen sample and then gently inverted at room temperature for 30 min. The resulting collagen was collected then centrifugation at 10000 ×g for 10 min. The pellet was dissolved in 1 mL alkali reagent by vortexing and the collagen concentration was determined by a spectrophotometer at OD540. Student’s-检验用于评估统计显著性，a价值<0.05被认为是统计学意义（对于每个实验)。

结果

3.1。乙醇提取物和FA治疗的安全性和有效性分析

为建立中药总提取物的药效分析模型体系当归以乙醇提取物(AS提取物)及其有效成分阿魏酸(FA)为样品。用无水乙醇提取紫荆，用高效液相色谱法测定紫荆提取物中FA的含量。AS提取物中FA的浓度(见补充材料中的图1)http://dx.doi.org/10.1155/2012/467531）是2.278 mg / ml。传统上，在制定中草药进行伤口愈合时，常见的基本组分是常见的基本组分，因此我们使用人体皮肤成纤维细胞作为实验细胞模型，以阐明作为伤口愈合过程的潜在机制。作为萃取物和Fa溶解在DMSO中，得到10至500的浓度 μ.g/mL, 1 ~ 200μ.分别用于确定成纤维细胞生长的最佳药物浓度。如图所示1，因为提取物能够以剂量依赖的方式显着增强细胞活力，高达125％（图1(一)）但是FA对细胞生长没有明显影响（图1 (b)）.有人指出，500 μ.G / ml作为提取物的最高浓度仍然能够帮助细胞生长，并且浓度超出该点抑制细胞生长。根据这些观察，我们选择了300 μ.作为本研究的提取物的G / ml作为提取物，避免了任何复杂的药理学效应。相应地，基于AS提取物的水平的适当浓度为3.5 μ.M.值得注意的是，AS提取物能显著促进细胞生长，但活性成分FA不能产生类似的作用。这证实了在这种情况下，一种草本植物的单一成分的药理作用与同一植物的整个提取物的药理作用是不相同的。

３．２．从经DMSO、AS提取物或FA处理的成纤维细胞中，2D PAGE蛋白图谱和差异表达蛋白斑点的鉴定

为了进一步调查如何作为提取物及其活性成分Fa会影响受伤皮肤的伤口愈合过程，然后进行二维（2D）页面。在这项研究中，0.1％DMSO，300 μ.克/毫升AS提取物，或3.5 μ.M fa处理的细胞裂解液用2D PAGE分离，银染色显示。然后使用Image Master 5.0对染色的2D PAGE凝胶进行分析。该软件以DMSO处理的细胞作为参考，鉴定了在2D PAGE凝胶上定量显示不同表达水平的蛋白。如图所示2，我们分别鉴定出29和22个AS和FA蛋白点，与DMSO相比，在AS提取物或FA处理下，它们的强度分别显著增加或减少了1.5倍或0.67倍以上。这些蛋白点进行了数字标记，如图所示2．

为了进一步表征这些差异表达的蛋白质，总蛋白质裂解物的浓度增加到超过1mg，然后用2D页面和Coomassie蓝色染色。在该2D页凝胶上可识别40个丰富的差异调节的蛋白质斑点，并且通过LC-MS / MS（Q-TOF）质谱法进行切除并分析。另外，从早期的银染色的2D页凝胶中切除11个罕见的差异调节的蛋白质点，并通过更敏感的LC-MS / MS（Orbitrap）质谱法分析。使用吉祥物数据库在线搜索引擎筛选所得肽并续集以鉴定蛋白质。蛋白质鉴定的详细结果显示在表中1使用DMSO处理作为参考。吉祥物分数≧36或SEQUEST得分= 2.5（临界）表示显著蛋白的同源性（）.如图所示2，第29个22个差异表达蛋白质点从分别与AS提取物或FA，所治疗的细胞提取物来表征。

3.3。该差异展示的蛋白质的功能分类

使用生物信息学工具对差异表达蛋白进行分类。质谱法鉴定的所有蛋白参数(见表1)1（例如蛋白质ID和蛋白质表达水平的比例）被引入HCE 3.5（分层聚类探险仪）中，这已广泛用于基因组或蛋白质组学挖掘，并针对隐藏的有意义的结果进行精确定位[17.，18.］．基于各种治疗后蛋白质点的表达水平比（作为提取物/ DMSO; FA / DMSO，表1），可以将34个蛋白质分类为五个集群（图3.）.在簇A中，13个蛋白质斑点所有成纤维细胞中上调与任一AS提取物或FA治疗。在簇B中，8个蛋白质斑点被上调与AS提取物处理的成纤维细胞，但这些蛋白斑点的表达水平没有显著处理后与FA改变。五个蛋白质斑点组成的丛集C，这些都是只有在与FA处理成纤维细胞中过表达。在簇d，当成纤维细胞用AS提取物处理5个蛋白斑点下调，但在与FA处理的表达水平没有变化。只有3个蛋白质斑点形成簇E，而这些处理后或者与AS提取物或FA下调。值得一提的是，除了在簇A和E，当细胞用或者作为提取物或FA处理的蛋白表达是不同的。

集群后，我们使用NCBI PubMed和BGSSJ（散装基因检索系统的Java）与瑞士端口数据库，这些蛋白质的生物学功能分类。所描绘的蛋白质的功能包括蛋白转运，蛋白质代谢，钙离子结合，氧化还原酶活性，抗凋亡，蛋白质结合，代谢，信号转导，细胞运动性和细胞生长。

有趣的是，在这些差异表达的蛋白质中发现了七种氧化相关的蛋白质。其中，当用萃取物或Fa处理时，发现存在五种氧化相关的蛋白质在成纤维细胞中上调。这些蛋白质是过氧化毒素（PRDX）2，PRDX4，PRDX6，谷胱甘肽S-转移酶PI（GSTP1）和帕金森病蛋白7（Park7）（图3.，聚集a）。另外两个氧化相关蛋白质，戊二糖胺-3（GLRX3）和铁蛋白轻链（FRIL）仅在用FA处理的细胞中调节（图3.，群集c）。这些蛋白的表达模式意味着对成纤维细胞比AS提取物，FA单独强权施加更大的抗氧化能力。此外，鉴定出的蛋白质的4参与细胞生长或凋亡抑制，即，翻译控制肿瘤蛋白（TCTP），热休克蛋白β-1（HSPB1），GSTP1（双功能蛋白）的调节，和钙蛋白酶小亚基1（CAPNS1）（图3.，集群A和B）。在用萃取物或FA处理的成纤维细胞中上调TCTP（图3.，聚集a）。与此相反，HSPB1，GSTP1，和CAPNS1是在与AS提取物处理的细胞中只表达上调（图3.这表明，与FA相比，AS提取物对细胞存活的影响更大。这些生物信息学结果与WST-1细胞生长试验的结果一致(图)1）.

钙离子在创面愈合过程的调控中非常重要，其功能是调节细胞生长、分化、附着、运动、胶原分泌等相关基因的表达[19.］．本研究中确定了一些与上述功能相关的蛋白质。当用提取物或FA（图）处理时，在成纤维细胞中上调膜蛋白A2（ANXA2）的表达（图3.，聚集a）;然而，当用FA治疗细胞时，吞噬蛋白A5（ANXA5）仅上调（图3.相比之下，突触囊泡膜蛋白VAT-1同源物(VAT1)仅在AS提取物处理的细胞中上调(图)3.，簇B），而Triosephosphate异构酶（TPIs）在用萃取物或Fa处理的细胞中上调。此外，磷酸甘油酮激酶1（PGK1）和L-乳酸脱氢酶B链（LDHB）仅在用作提取物处理的细胞中上调。在伤口愈合过程中，细胞缺氧[20.细胞增殖消耗大量能量以修复受伤的组织。TPI和PGK1对糖酵解是重要的，并且LDHB通过减少丙酮酸催化来催化乳酸的产生。这些蛋白质的过度表达似乎提供额外的能量资源，使细胞在压力下存活。

还鉴定了一些运动相关蛋白。肌动蛋白相关蛋白2/3复合亚单位5（ARPC5）和stathmin（STMN1）仅在经FA处理的细胞中上调（图3.而波形蛋白(VIME)仅在AS提取物处理的细胞中下调(图)3.令人惊讶的是，在两种处理后，NDKB和MARE1在细胞中均下调(图4)3.，群集e）。这些结果表明，作为提取物或FA的成纤维细胞的治疗改善了细胞在环境胁迫下存活的能力。除了静脉（用于移动性），用AS提取物治疗成纤维细胞调节与细胞生长（LEG1，CAPNS1），代谢（PGK1，LDHB），钙离子调节（VAT1）和抗曝培剂相关的蛋白质的上调蛋白质的上调（hspb1）。另一方面，FA可能具有独特的能力（图3.，丛集C），以调节与细胞运动性（STMN1，ARPC5），抗氧化功能（GLRX3，FRIL），和钙离子调节（ANXA5）相关的蛋白质的上调。有趣的是，我们发现通过任一AS提取物或FA处理诱导蛋白的一些重叠。与细胞运动性相关的两种蛋白质（MARE1，NDKB，图3.当用AS提取物或FA处理成纤维细胞时，其表达下调。相反，当成纤维细胞被AS提取物或FA处理时，一些与代谢相关的蛋白(TPIS)、抗氧化功能(PRDXs, PARK7)、抗凋亡(GSTP1, TCTP)和钙离子调节(ANXA2)上调(图)3.，聚集a）。

3.4。通过蛋白质组学分析检测到的各种蛋白质的差异表达的确认

蛋白组学方法检测到的蛋白表达变化采用Western blot分析。将人皮肤成纤维细胞接种到培养皿中，然后用AS提取物或FA处理24小时;然后按照材料和方法制备细胞裂解液。如图所示4（a）和4（b），GSTP1和TPI的表达（图3.在使用AS提取物或FA治疗后，成纤维细胞中表达上调，这与我们的蛋白质组分析一致(图)3.和表格1）.HSBP1(图3.，簇B）在提取物处理之后的成纤维细胞中显着上调，但是FA治疗没有显着改变该基因的表达（图4（c））.此外，STMN1仅显著与FA处理的，并且当细胞用AS处理中没有检测到这样的变化细胞中上调（图4（d））;这也同意蛋白质组学分析（图3.因此，蛋白的western blot分析与我们的2D PAGE和质谱分析检测到的蛋白表达模式一致(图3.），它提供了我们方法的验证。

3.5。成纤维细胞的氧化还原状态处理后作为抽取和FA

PRDX蛋白家族和GSTP1作为抗氧化剂[21.]，这些蛋白质表达表达最大的表达响应于作为提取物或FA的治疗（表1）.这些结果似乎表明这些蛋白质的增加可能有助于在药物处理后改变细胞的氧化还原状态。使用氧化还原荧光染料2'，7'-二氯流荧光素二乙酸酯（DCF-DA）测量药物处理后细胞的氧化还原状态。如图所示4（e），用作提取物处理的细胞的ROS水平显着降低了8％，但是当用FA处理细胞时，不会发生这种情况。值得注意的是，由于其结构，FA是一个有效的ROS清道夫[11.];尽管如此，它似乎FA本身并不是在抗氧化活性方面完全有效。因此，一些成分（S）从所述AS提取物可能是必要的，与FA一起，以获得最大的抗氧化活性。

3.6。作为抽取的胶原分泌和迁移影响的功能确认

胶原的分泌和交联是修复损伤组织最重要的步骤，胶原的合成是由转化生长因子- (TGF-)控制的β），由巨噬细胞和成纤维细胞分泌[22.］．因此，研究了作为成纤维细胞分泌萃取物和FA对胶原蛋白分泌的影响。如图所示5(一个)，AS提取物能够通过成纤维细胞显著促进胶原蛋白的分泌和增加是高达5％相比于对照;相比之下，英足总也没有增加胶原蛋白的分泌。TGF-β的表达β通过Western Blotting还分析，发现TGF的表达β响应于治疗或者作为提取物或FA与胶原蛋白分泌测定的结果（图相关5（c））.

已知STMN1，ARPC5，NDKB和MARA1的功能与细胞流动性和伤口愈合相关[23.- - - - - -26.];然而，通过我们的蛋白质组学分析，这些蛋白的表达水平是不同的，它们分成不同的簇(图)3.，簇C，D，E）响应药物治疗。在这种情况下，重要的是阐明每种治疗对成纤维细胞的影响，因此对用萃取物或FA处理的细胞进行细胞迁移和伤口愈合测定。Transwell测定用于细胞迁移测试。如图所示5 (b)我们发现，无论是作为抽取和FA似乎促进细胞迁移到相同的程度。此外，两个AS提取物和FA对促进成纤维细胞伤口愈合（补充图2）的相同的效果。这些结果表明，FA可能是AS提取物的主要活性成分，促进细胞迁移和伤口愈合。

仅基于蛋白质组学分类才参与CAPNS1的细胞生长（图3.，B组）。众所周知，磷酸化Akt和Erk是促进细胞生长的因子，因此进行了实验，以测量经AS提取物或FA处理后成纤维细胞中这两种因子的表达。如图所示5（d）和5（e），p-Akt和p-Erk的表达水平仅在AS提取物处理的成纤维细胞中上调。这些结果与我们的细胞活力测定结果一致，该测定结果表明，当成纤维细胞用AS提取物处理时，成纤维细胞的生长增加了约25%，但当细胞用FA处理时，没有出现这种情况（图1）1）.这些发现表明，细胞生长促进是由AS提取物处理启动的，这可能涉及到处理后的成纤维细胞中Akt和Erk通路的上调。

4.讨论

细胞活力测试表明，即使在高浓度下，AS提取物也能有效促进人皮肤成纤维细胞增殖，且细胞毒性较低。众所周知，皮肤成纤维细胞在伤口愈合的增殖阶段起着重要的作用[27.，28.]，并因此与AS提取物治疗似乎对成纤维细胞生长有益的影响。先前已发现功能相关的蛋白质常常是协同表达[29.］．与这一假设一致的是，通过2D PAGE分析发现了5个蛋白簇，它们在AS/FA处理下的细胞表达水平变化相似。

4.1。蛋白质参与抗氧化活性

ROS在创面愈合的早期阶段起着重要作用[30.]，但损伤区过量的ROS也对附近的正常细胞有害。过氧化物还原蛋白(PRDXs)、帕金森病蛋白7 (PARK7)和谷胱甘肽s -转移酶Pi (GSTP1)被归类为聚类A蛋白，它们在成纤维细胞中通过as提取物或FA上调(图)3.，A组）。PRDXs是一个多功能抗氧化剂硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶家族，可保护细胞免受过氧化氢的伤害[31.，32.］．prdx家族有6个成员，其中3个(PRDx2、PRDX4和PRDX6)在本研究中被确定为上调。PARK7作为协调者，诱导谷氨酸、半胱氨酸连接酶和谷胱甘肽等抗氧化基因的表达[33.］．GSTP1是一种多官能蛋白，可降低氢过拓，进行排毒，抑制JNK磷酸化;后者导致凋亡细胞数减少[34.］．质谱分析表明，在我们的样本中鉴定了PRDX-2，PDRX-4，PDRX-6和PARK7（表1)，序列覆盖率较低。然而，AS提取物处理后的成纤维细胞中过氧化氢的数量显著减少(图)4（e）），表明药物治疗后细胞中存在抗氧化剂。此外，GSTP1显着上调，以萃取剂或FA（图）治疗的成纤维细胞（图4（a））.我们的研究结果表明，在AS提取液或FA处理后，细胞中的ROS确实显著减少，而PRDX-2、PDRX-4、PDRX-6、PARK7和GSTP1可能参与了这一过程。

4.2。在细胞凋亡的调控参与蛋白质

TCTP(一种翻译控制的肿瘤蛋白，也命名为fortilin)和GSTP1在AS提取液或FA治疗后上调(图)3.，聚集a）;另外，作为提取物，但没有Fa能够诱导热休克蛋白β1（Hspb1）表达（图3.，B组；图形4（c））.TCTP的N-末端能够与Bcl-xL的相互作用，并帮助细胞避免凋亡;与此相反，TCTP表达的下调会增加细胞凋亡细胞的数量[35.，36.］．还据报道，GSTP1的下调导致C-Jun NH2-末端激酶介导的细胞介导的细胞增加[37.，38.］．HSPB1 (HSP27)作为伴侣蛋白，帮助蛋白质折叠;或者，它可以激活蛋白酶体，使其与变性蛋白质相互作用[39.］．磷酸化HSPB1能够抑制Daxx的与的Fas或ASK1的相互作用，这降低了下游凋亡相关蛋白的活化[40］．此外，伤口闭合被延迟在倒下的SW480细胞中，表明Hspb1参与调节细胞迁移率[41.］．我们的研究结果似乎表明，AS提取物和FA可能通过上调TCTP和GSTP1的表达来激活细胞的抗凋亡作用。此外，AS提取物而非FA可能通过上调HSPB1，在创面愈合过程中具有抑制凋亡和调节细胞流动性的附加功能。

4.3. 参与调节钙离子或蛋白质运输的蛋白质

钙离子在伤口愈合、细胞增殖、分化、粘附、迁移、胶原分泌等方面发挥重要作用[19.］．膜联蛋白是一种膜蛋白，它包含膜联蛋白核心结构域和一个保守的钙脂结合模块，参与钙离子调节。此外，在迁移的肠上皮细胞中发现膜联蛋白A2的表达增加[42.］．在这项研究中，我们发现AS提取物或FA处理后的成纤维细胞中膜联蛋白A2上调(图)3.，聚集a）。此外，已知突触囊泡膜蛋白VAT-1同源物（VAT-1）参与调节钙离子磁通[43.］．我们发现，治疗AS提取物，但不与FA能够诱导VAT-1的上调（图3.，B组）。有趣的是，我们的生化分析进一步表明，胶原分泌以及TGF的表达-β在提取物处理之后的成纤维细胞中显着增加，但不是FA处理（图5(一个)和5（e））.因此，我们认为AS提取物比FA具有更大的能力来影响钙离子调节以及任何相关的伤口恢复作用。

4.4。参与细胞流动性的蛋白质

细胞运动性是伤口愈合过程的重要组成部分[28.］．核苷二磷酸激酶B（NDKB）和微管相关蛋白RP / EB系列成员1（MARE1）在用萃取物或FA处理的细胞中均下调（图3.，群集e）。NDKB（也称为NM23）似乎是一个转移抑制基因，被认为是参与细胞迁移，增殖，分化和发展[25.］．Mare1也被认为促进微管的聚合并稳定微丝[26.］．在AS提取物或FA处理的成纤维细胞中，NDKB和MARE1的下调表明对迁移的抑制减弱，这可能有利于参与伤口愈合过程的细胞。肌动蛋白相关蛋白2/3 complex subunit 5 (ARPC5)和stathmin (STMN1)均被FA上调，而AS提取物没有上调(图)3.，群集c）。ARPC能够调节肌动蛋白动力学和功能作为启动新的肌动蛋白长丝的模板，该长丝分支为现有灯丝[24.］．STMN1是胞质磷蛋白，已知用作微管稳定的蛋白质，其结合自由形式微管蛋白，其抑制微管聚合[23.］．因此，我们的结果表明，作为提取物和FA可以通过控制微管动态来调节细胞迁移率。此外，值得注意的是，ARPC5，STMN1和NDKB在我们的质谱分析中具有最高的序列覆盖率和得分（表1）.迁移和伤口愈合试验(图5 (b)）表明，作为提取和FA均促进细胞移动性，这与上述研究结果同意。

4.5. 参与细胞生长或代谢的蛋白质

CAPNS1 (calpain small subunit 1)能够促进细胞增殖、迁移和粘附[44.]. 相反，LEG1（半乳糖凝集素-1）的过度表达被认为可以抑制正常小鼠成纤维细胞的生长并增加细胞凋亡[45.］．有趣的是，我们观察到Capns1被上调（图3.，群集b），虽然leg1被下调（图3.AS提取物处理成纤维细胞时，簇D);这种CAPNS1和LEG1表达的对比变化应该有利于成纤维细胞创面的愈合过程。此外，我们的研究结果还表明，AS提取物处理成纤维细胞时，p-Akt和p-Erk表达被激活(图)5（d）和5（e））.因此，除了调节CAPN1和LEG1的表达之外，由于提取物似乎还通过ERK和AKT途径调节细胞生长。

成纤维细胞的主要能量资源是糖酵解，这些细胞中的LDHB表达的增加将促进丙基羟化酶活性，这又会增加乳酸盐产生和胶原羟基化;反过来，这些效果将有助于细胞耐受缺氧环境并加速伤口愈合过程[46.］．我们发现，无论是作为抽取和FA能够上调磷酸丙糖异构酶的（TPIS）在成纤维细胞中表达（图3.而只有AS提取物能激活磷酸甘油酸激酶(PGK1)和l -乳酸脱氢酶B链(LDHB)的表达(图1)3.，群集b）。因此，我们得出结论，随着提取物可以通过上调糖酵解提供伤口愈合过程的额外能量，这将有助于保护来自缺氧的细胞。

4.6。AS提取物和FA调控成纤维细胞创面愈合过程的潜在分子药物作用机制

综上所述，我们的结果揭示了AS提取物或FA处理成纤维细胞可能诱导的药理学伤口愈合过程（图6）.多种因素可能参与由提取物或FA诱导的伤口愈合过程。随着提取物和FA似乎激活ROS生产（PRDX和PARK7）的抑制，增强细胞迁移率（MARE1和NDKB），促进糖酵解（TPI），增加抗血液凋亡（GSTP1和TCTP），并调节钙离子（ANXA2），所有这些都应该在伤口愈合过程中增加细胞的活力。作为本研究揭示的提取物的独特药理功能包括抑制Leg1表达的增强的人体皮肤成纤维细胞增强，以及增加的PGK1和LDHB的上调，促进糖酵解和ERK和AKT信号的激活转导途径。由于HSPB1表达增加，用作为提取物处理的成纤维细胞似乎也经历了抑制凋亡。此外，胶原蛋白分泌的增加（TGF-β），钙离子调节（VAT1）和增强的细胞迁移率（静脉调节）也有助于更有效的伤口愈合过程。此外，还揭示了许多FA的独特功能，包括ROS抑制（GLRX3和FRIL），并通过上调STMN1和ARPC和NDKB的下调来促进细胞迁移率。上述FA的额外功能应加强与整体成纤维细胞相关的愈合过程。在这项工作中，我们描述了一种能够揭示草药的基本原理的技术平台;即，作为提取物及其活性组分FA如何参与与成纤维细胞相关的伤口愈合过程的调节。当它用于治疗皮肤的热灼伤或创伤性损伤时，这些结果将有助于和利用这种草药的临床应用。

致谢

这项研究是由美国国家研究计划基因组医学（NRPGM），NSC 99-3112-B-010-006，和美国国家科学委员会，NSC 98-2320-B-010-008-MY3资助。

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