高效液相色谱系统配备了BAS pm - 80泵,一个DGU-20A5脱气装置,CMA / 170 autosampler,瓦里安(340)光电二极管阵列检测器。色谱分离进行了使用Phenomenex融合rp - 80(2504.6毫米,4米)。移动阶段乙酸乙腈(溶剂)和2%(溶剂B)。对阿魏酸的分析,所涉及的流动相以下线性渐变:从25%到75%在0-15分钟1.0毫升/分钟的流量,以及检测波长280纳米。进样体积是20 μl

人类胚胎皮肤纤维母细胞从生物资源收集和研究中心(BCRC)没有。底特律60118 (551)。细胞培养在10厘米培养皿(康宁)与最低基本培养基鹰谷酰胺(MEM)包含2毫米,1.5 g / L碳酸氢钠,0.1毫米不重要的氨基酸,和1.0毫米丙酮酸钠(MEM alpha-modificationsσ),补充10%胎牛血清(SAFC生物科学),50个单位/毫升青霉素、链霉素0.05毫克/毫升、和0.1毫克/毫升新霉素(σ);细胞生长在湿润的气氛在37°C和5%的公司₂。通道,成纤维细胞已经融合的培养皿中约有90%在10厘米,介质被丢弃和5毫升PBS细胞洗两次。他们然后使用2毫克/毫升EDTA和收获5毫克/毫升胰蛋白酶磷酸盐(PBS)。与5毫升PBS两次,洗后收集的细胞在1300转离心5分钟。浮在表面的丢弃,细胞用移液器吸取新鲜培养基。然后他们被整除为几个10厘米文化菜肴。

细胞生存能力分析进行根据制造商的手册中描述的过程(罗氏)小修改。这是一个比色测定细胞增殖的量化基础上的乳沟水溶性四唑盐(WST-1)在可行的细胞线粒体脱氢酶。药物治疗细胞被播种在4×10的浓度⁴细胞/(大约40%汇合)在1毫升培养基24-well培养板,在37°C的环境含有5%孵化器有限公司₂。细胞连接后,他们接受0.1% DMSO, 300 μ3.5 g / mL提取,或 μM FA 24小时。浮在表面的丢弃,细胞增殖试剂WST-1(罗氏)被添加到每个在1:50比新鲜培养基。细胞培养是一个额外的1小时在黑暗。吸光度测量在450 nm使用ELISA读者(热,Multiskan频谱),和背景的吸光度测量在690海里。吸光度450 nm和690 nm之间的差异表明0.1% DMSO相比相对细胞生存能力。每个样本的实验进行了三个复制。

成纤维细胞被洗两次磷酸盐(PBS)和细胞溶解1毫升NP-40裂解缓冲包含10毫米Tris-HCl (pH值7.5),50 mM氯化钠,NP-40 1%, 30毫米Na₂P₂O₇氟化钠,30毫米,1毫米Na₃签证官₄1%,1%蛋白酶抑制剂,磷酸酶抑制剂(σ)。整个细胞溶解产物在14000转离心20分钟在4°C除去不溶性材料。上层清液被转移到一个集中器(GE健康,vivaspin 20, 100 k MWCO)和离心机在6000×g, 4°C,直到体积小于500 μL,然后用dH裂解缓冲所取代₂O包含1%的蛋白酶抑制剂和1%的磷酸酶抑制剂(σ)。蛋白质浓度由布拉德福德量化蛋白质化验(Bio-Rad),和样本直接申请2 d页面分析。

2 d页面执行根据制造商的手册中描述的方法(Amersham生物科学)和一些细微的修改。能源论坛第一个维度合作,pH值4 - 7,IPG条(18厘米)患者有400人 μL补液缓冲区(0.5% IPG缓冲区,8 M尿素,2%的皮套裤,50 mM二硫苏糖醇(德勤),和一丝溴酚蓝)在100年之前至少4小时 μ克蛋白质样本装入杯装载。IEF当时在以下条件下进行:150 V 5人力资源步骤并持有,500 V 3人力资源步骤和持有,7小时梯度1000 V, 8000 V 3人力资源梯度和8000 V 18小时step-and-hold。二维SDS - page,之前的带平衡4毫升的平衡缓冲,包含50 mM Tris-HCl pH值8.8,6 M尿素,2% SDS, 30%的甘油,50 mM德勤,和0.01%溴酚蓝在室温下15分钟,其次是平衡在50 mM Tris-HCl pH值8.8,6 M尿素,2% SDS、30%甘油、5%碘乙酰胺,0.01%溴酚蓝在室温下15分钟。使用的second-dimensional sds - page分离胶和12.5%进行叠加凝胶。平衡IPG凝胶地带被放置在sds - page和适当的压力,以确保公司地带和凝胶板之间的联系。电泳进行了35岁马/凝胶直到追踪染料达到凝胶的底部。2 d页面然后银染色。

2 d PAGE电泳,凝胶后被移除,沉浸在修复解决方案(dH 40%甲醇和10%醋酸₂与dH O) 10分钟,洗净₂O 10分钟两次,然后浸在溶液中硫代硫酸钠(0.25毫米)30分钟,当时被dH所取代₂O为10分钟。接下来,凝胶是沉浸在方案B(3.5毫米硝酸银)30分钟。与dH冲洗后₂O, C(0.357米)的混合解决方案和解决方案在dH D(4.37毫米)₂O用于开发蛋白质点在二维凝胶页。反应停在5%醋酸。

页面2 d图像获得和分析了蛋白质的数量在每个地方使用ImageMaster 2 d精英软件5.0版本(Amersham生物科学)。蛋白质点的体积被定义为强度之和的像素单元内的蛋白质斑点。纠正强度的定量变化的蛋白质斑点,现货成交量规范化的总量的比例斑点出现在一个给定的凝胶。

文档中描述的过程是生物化学研究所的,台湾中央研究院生物化学研究所( http://proteome.sinica.edu.tw/),这是使用小修改。选择silver-stained蛋白质斑点切除的2 d页面。然后他们被de-silver-stain使用1:1 Na₂年代₂1毫升H O (0.1 g₂O)和K₆铁(CN)₆(0.1 g 1毫升H₂O)在25毫米碳酸氢铵直到被透明。下凝胶片被添加到25毫米碳酸氢铵pH值8.5 10分钟,vacuum-dried,患者有50%乙腈在25毫米碳酸氢铵pH值8.5在室温下10分钟。上层清液被丢弃和vacuum-dried示例。随后,现货是使胰蛋白酶化0.1% sequencing-grade内的蛋白质修饰胰蛋白酶(WI Promega,麦迪逊,美国)在25毫米碳酸氢铵,pH值为8.5,在37°C至少16小时。每个上层清液被到一个新的埃普多夫管,然后25毫米碳酸氢铵pH值8.5添加到前面的凝胶样品,和混合物用近1分钟,10次。上层清液的治疗也进入一个新的埃普多夫管移除。这个过程重复第三次通过添加50%的乙腈25毫米碳酸氢铵pH值8.5样本,其次是声波降解法1分钟,10次。上层清液中提取的三池和蒸发在真空下干燥,和干颗粒用于开展综合nanoLC-MS / MS系统(Micromass)(国家基因组医学研究项目,台湾中央研究院)。十一个罕见的监管差异蛋白质斑点被质/ MS (Orbitrap)质谱系统(国立阳明大学蛋白质组学研究中心)。nanoLC-MS /数据采集是由女士Micromass ProteinLynx全球服务器(后卫)2.0数据处理软件默认模式和输出作为一个单一Mascot-searchable峰值(.pkl)文件列表。 The LC-MS/MS (Orbitrap) data were processed by SWQUEST (Thermo Finnigan). The peak list files were used to query the Swiss-Port version 2010_05 database using Mascot program version 2.2 (release date, 28-Feb-2007, Matrix Science, London, UK) with the following parameters: a taxonomy of 智人(20400序列),肽质量公差50 ppm, MS / MS离子质量公差0.25 Da,胰蛋白酶消化一个错过的乳沟,没有固定的修改,和变量的修改考虑蛋氨酸氧化、半胱氨酸carboxyamidomethylation,赖氨酸乙酰化和磷酸化酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸。只吉祥物概率分析被认为是定义的重大打击。蛋白质识别是公认的具有统计学意义的吉祥物搜索分数≥36或SEQUEST得分= 2.5(关键),对应于一个错误的概率 P < 0.05 使用我们的数据集。选择得分最高的蛋白质识别消除蛋白质数据库中冗余。

阴谋的校准强度表达式值的每个蛋白质以ImageMaster 2 d精英软件5.0版本(Amersham生物科学、瑞典)在不同组的样本与平均连接一起使用层次聚类算法(UPGMA,未加权的一对组与算术平均法);这是通过使用层次聚类浏览器3.5 [ 17]。偏心皮尔逊相关系数的确定作为相似性度量的测量,和最小相似度的阈值设置为0.8。聚类后,每个蛋白质都分配在一个全球时间分类颜色热图。我们使用BGSSJ(大部分为Java基因搜索系统; http://bgssj.sourceforge.net/)[ 17)和Swiss-Prot蛋白知识数据库的功能分类的蛋白质。

蛋白质提取物成纤维细胞(551年底特律)12.5% sds - page分离,然后转移到硝化纤维素(NC)膜。5%脱脂牛奶的NC膜被TBST室温1小时和探索各种主要抗体(anti-p-Erk1/2(没有。9101),1:2000;anti-Erk1/2(没有。9102),1:1000;anti-p-Akt(没有。9271),1:1000和anti-Akt(没有。9272),1:1000年,细胞信号;anti-TGF - β(sc - 52829) 1: 1000年,圣克鲁斯;反 β微管蛋白(T4026), 1: 5000年,西格玛奥德里奇;anti-HSPB1 (ab39399), 1: 1000和anti-STMN (cb1047), 1: 1000年,Abcam;anti-GSTP1 (GTX112953), 1: 3000和anti-TPIS (GTX104618), 1: 3000年,GeneTax)在TBST 5% BSA或脱脂牛奶。洗NC膜后,NC膜处理HRP-conjugated二级抗体。乐队是由化学发光可视化使用化学发光成像系统(las - 4000,富士胶片)和执行使用富士光密度分析MultiGauge软件版本。2.0。结果表示为平均值±标准偏差。学生的 t 以及用于评估统计学意义, P 值< 0.05被认为是统计显著( n = 4 对于每个实验)。

测量的ROS内容DMSO后成纤维细胞,提取,或FA治疗,H的细胞内的内容₂O₂ROS比例,确定使用redox-sensitive荧光染料2′,7′二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)(σ)。简单地说,细胞培养的融合,使胰蛋白酶化。离心后,丢弃上层清液和细胞resuspended孵化和10 μM DCF-DA (20 mM在DMSO对股票的解决方案并存储在−20°C),解决1×PBS 10分钟37°C在黑暗中。离心机,细胞被清洗和resuspended在新鲜培养基。总共8×10⁴细胞被添加到一个黑色的平96 - ELISA板,200 μL的媒介。ROS能够氧化DCF-DA光纤荧光,因此细胞内ROS的相对浓度是由使用激发荧光读者在485 nm和发射在538 nm)。学生的 t 以及用于评估统计学意义, P 值< 0.05被认为是统计显著( n = 3 对于每个实验)。

细胞培养融合后,他们使胰蛋白酶化,离心机,resuspended培养基。总共2×10⁴成纤维细胞被播种在Transwell(24,康宁)和DMSO溶液处理,提取,或足总;当时Transwell插入培养基没有泡沫。6小时后,Transwell被使用甲醇从培养基和细胞固定10分钟。甲醇被丢弃和细胞脱水。最后,细胞染色沾5% (dH的解决₂O)在室温下过夜。Transwell用dH洗净₂啊,和内部细胞Transwell被刮用棉签移除。细胞迁移的数量下来的Transwell是手工显微镜下计算。学生的 t 以及用于评估统计意义, P 值< 0.05被认为是统计显著( n = 3 对于每个实验)。

总共2.5×10⁴成纤维细胞被播种到双方文化的插入(ibidi) 24-well板产生500 μm±50 μ药物治疗之前m细胞层之间的差距。细胞连接后,插入被小心地文化。细胞被处理的各种药物,被添加到培养基中。细胞培养24小时。中被丢弃和PBS去除细胞洗两次独立的细胞。照片被拍摄的数码相机使用显微镜(奥林巴斯)和测量的大小差距。学生的 t 以及用于评估统计意义, P 值< 0.05被认为是统计显著( n = 3 对于每个实验)。

Sircol胶原蛋白分析中描述的过程是通用协议(Biocolor)。总之,3毫升细胞培养基收集药物治疗后,和胶原蛋白是由4 M氯化钠沉淀,以避免干扰的边后卫。离心收集的胶原蛋白颗粒是在室温下,15000×g和颗粒溶解在乙酸0.5毫升的0.5米。1毫升Sircol染色试剂是混合了100年 μL解决胶原蛋白样品,然后轻轻地倒在室温下30分钟。由此产生的胶原蛋白收集然后在10000×g离心10分钟。1毫升的颗粒溶解碱试剂由涡流和胶原蛋白的浓度是由OD540分光光度计。学生的 t 以及用于评估统计意义, P 值< 0.05被认为是统计显著( n = 3 对于每个实验)。

为了建立一个模型系统分析总草药提取物的功效,我们使用 当归乙醇提取物(提取)及其活性成分阿魏酸(FA),作为样品。就像使用绝对乙醇提取,然后分析了高效液相色谱法来确定数量的FA提取。足总浓度的提取(见图1的补充材料可以在doi: 10.1155 / 2012/467531)为2.278毫克/毫升。传统上,是一种常见的基本组件制定中国草药对伤口愈合,因此我们使用人类皮肤成纤维细胞作为实验细胞模型来阐明随着艾滋病的潜在机制和伤口愈合的过程。提取和足总溶解在DMSO浓度从10到500 μ克/毫升,1到200 μM,分别,为了确定最佳药物浓度对成纤维细胞细胞生长。如图 1,提取物能够显著提高细胞生存能力达125%剂量依赖性的方式(图 1(一)),但英足总对细胞生长没有明显的影响(图 1 (b))。指出,500年 μg / mL的提取浓度最高,还能够帮助细胞生长,抑制细胞生长和浓度超出这一点。基于这些观察结果,我们选择300 μg / mL的提取在这项研究中,为了避免任何复杂的药理作用。相应地,适当浓度的FA基于提取是3.5的水平 μm .明显,提取显著促进细胞生长,但活性成分FA是不能产生类似的效果。这证实单个组件的药理效应的草本植物不是相当于一个整体提取来自同一植物在这种情况下。

进一步调查其活性成分提取和FA如何影响伤口愈合的过程中受伤的皮肤,二维(2 d)页面然后执行。在这项研究中,0.1% DMSO, 300 μ3.5 g / mL提取,或 μM FA-treated细胞溶解产物分离和2 d页面的可视化银染色。彩色2 d页面凝胶图像主5.0进行分析。这个软件识别蛋白质定量显示不同的表达水平在2 d页面使用DMSO溶液凝胶治疗细胞作为参考。如图 2,我们能够确定29日和22个蛋白质斑点和FA分别显著增加或减少超过1.5或0.67倍强度的响应中提取,分别或FA治疗相比,DMSO溶液。这些蛋白质斑点数字标记,如图 2。

进一步描述这些差异表达蛋白,总蛋白质溶解产物的浓度增加到超过1毫克,其次是2 d页面和染色与Coomassie蓝色。四十丰富监管差异蛋白质斑点这2 d页面上可识别的凝胶,而这些被切除和分析质/ MS (Q-TOF)质谱。此外,十一个罕见的监管差异蛋白质斑点从早期切除银染色凝胶和分析的2 d页面更敏感质/ MS (Orbitrap)质谱。由此产生的肽筛选使用吉祥物数据库在线搜索引擎和SEQUEST识别蛋白质。并给出了详细的蛋白质鉴定的结果表 1使用DMSO溶液治疗作为参考。吉祥物36分≧或SEQUEST得分= 2.5(关键)表示重要的蛋白质同源性( P < 0.05 )。如图 229日和22日差异表达蛋白质点从细胞提取物处理特征提取或FA,分别。

生物信息学工具被用来分类的差异表达蛋白质。所有发现的蛋白质质谱分析的参数(表 1),比如蛋白质ID和蛋白表达水平的比率,是引入HCE 3.5(分层集群Explorer),已广泛用于基因组或蛋白质组学数据挖掘和精确定位隐藏的有意义的结果 17, 18]。基于蛋白质的表达水平比景点后,各种治疗方法(如提取/ DMSO溶液;FA / DMSO,表 1),可以分类34个蛋白质斑点成五个集群(图 3)。在集群,13个蛋白质斑点都是调节成纤维细胞在治疗作为提取或足总。在集群B, 8蛋白斑点是调节成纤维细胞治疗中提取,但这些蛋白点的表达水平不显著改变在治疗足总。5 C蛋白斑点组成集群,这些只是在成纤维细胞治疗。集群D 5蛋白斑点是表达下调成纤维细胞时处理提取,但没有表达水平的变化与足总治疗。只有3 E蛋白斑点形成集群,这些都是在治疗作为提取或FA表达下调。值得注意的是,除了在集群和E,蛋白表达是不同的,当细胞治疗作为提取或足总。

聚类后,我们使用NCBI PubMed和BGSSJ (Java大部分基因搜索系统)与Swiss-Port数据库对这些蛋白质的生物功能进行分类。划定蛋白功能包括蛋白质运输、蛋白质代谢,钙离子绑定,氧化还原酶活动,antiapoptosis,蛋白质绑定、代谢、信号转导、细胞迁移,细胞生长。

有趣的是,七oxidation-related蛋白质被发现在这些差异表达的蛋白质。其中,五oxidation-related蛋白质被发现是调节成纤维细胞在处理,提取或足总。这些蛋白质酶类(PRDX) 2, PRDX4, PRDX6,谷胱甘肽S-transferaseπ(GSTP1)和帕金森病蛋白7 (PARK7)(图 3集群)。其他两个氧化相关的蛋白质,glutaredoxin-3 (GLRX3)和铁蛋白轻链(FRIL),只有在细胞治疗FA(图规范 3、集群C)。这些蛋白质的蛋白质表达模式暗示FA独自可能施加在成纤维细胞抗氧化能力大于提取。此外,四个确定蛋白参与细胞生长或antiapoptosis的规定,即翻译控制肿瘤蛋白(TCTP),热休克蛋白beta 1 (HSPB1), GSTP1(双功能蛋白)和calpain小亚基1 (CAPNS1)(图 3集群A和B)。TCTP被调节成纤维细胞治疗作为提取或FA(图 3集群)。相比之下,HSPB1, GSTP1, CAPNS1调节细胞处理提取(图 3、集群B)。这表明,随着提取对细胞生存而FA更大影响。这些科学发现的结果是一致的,WST-1细胞生长测试(图 1)。

钙离子是非常重要的在伤口愈合过程的监管,和它的功能是调节基因的表达参与细胞生长、分化、附件、能动性,胶原蛋白分泌( 19]。与上述相关的一些蛋白质功能被确定在本研究中。表达的膜联蛋白A2 (ANXA2)是调节在成纤维细胞治疗作为提取或FA(图 3集群);然而,膜联蛋白A5 (ANXA5)只是调节细胞治疗FA(图 3、集群C)。相比之下,突触囊泡膜蛋白VAT-1同族体(VAT1)只是调节细胞处理提取(图 3集群B),而triosephosphate异构酶(tpi)是调节细胞内处理作为提取或足总。此外,磷酸甘油酸酯激酶1 (PGK1)和L-lactate脱氢酶B链(LDHB)只有调节细胞处理提取。在伤口愈合过程中,细胞缺氧( 20.)和细胞增殖消耗大量的能量以修复受伤的组织。tpi和PGK1是重要的糖酵解,LDHB催化乳酸的生成丙酮酸的减少。超表达的蛋白质似乎提供额外的能源资源允许细胞生存压力。

许多motility-associated蛋白质也确定了。Actin-related蛋白质2/3复杂的亚基5 (ARPC5)和stathmin (STMN1)只有调节细胞治疗FA(图 3集群C),而波形蛋白(来)只是表达下调细胞处理提取(图 3、集群D)。令人惊讶的是,NDKB和MARE1被抑制在细胞治疗后(图 3、集群E)。这些结果表明,治疗成纤维细胞作为提取或FA改善细胞的能力在环境压力下生存。除了VIME(流动性),治疗的成纤维细胞提取的upregulation调节相关蛋白与细胞生长(LEG1 CAPNS1),代谢(PGK1 LDHB),钙离子调节(VAT1)和antiapoptosis (HSPB1)。另一方面,足总可能有独特的能力(图 3集群C),调节与细胞迁移相关的蛋白质的upregulation (STMN1 ARPC5)、抗氧化功能(GLRX3 FRIL)和钙离子调节(ANXA5)。有趣的是,我们发现了一些重叠的蛋白质作为提取或引起的足总治疗。两种蛋白质与细胞迁移(MARE1 NDKB,图 3、集群E)抑制成纤维细胞治疗时作为提取或足总。相比之下,一些与代谢相关的蛋白质(tpi),抗氧化功能(PRDXs PARK7) antiapoptosis (TCTP GSTP1)和钙离子调节(ANXA2)调节成纤维细胞治疗时,提取或FA(图 3集群)。

免疫印迹分析是用来证实蛋白质表达的变化检测到蛋白质组学的方法。人类皮肤成纤维细胞被播种到盘子,然后处理,提取或FA 24小时;然后细胞溶解产物准备材料和方法表示。如数据所示 4(一)和 4 (b),问题和tpi(图的表达式 3在治疗后,集群)是调节成纤维细胞作为提取或足总,这是与我们的蛋白质组学分析(图一致 3和表 1)。HSBP1(图 3,集群B)显著调节后,成纤维细胞作为提取治疗,但英足总治疗没有显著改变这种基因(图的表达式 4 (c))。此外,STMN1只是显著调节细胞接受英足总并没有这样的变化是发现当细胞治疗(图 4 (d));这也同意蛋白质组分析(图 3、集群C)。因此选择蛋白质免疫印迹分析是在协议与蛋白质的表达模式检测到我们的2 d页面(图和质谱分析 3),它提供了验证的方法。

PRDX家族的蛋白质和GSTP1充当抗氧化剂( 21],这些蛋白质显示最大的增加表达对治疗的反应和提取或FA(表 1)。这些研究结果似乎表明,这些蛋白质的增加可能有助于改变药物治疗后细胞的氧化还原状态。redox-sensitive荧光染料2′,7′二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)是用来衡量药物治疗后细胞的氧化还原状态。如图 4 (e),ROS水平细胞的提取是处理显著降低了8%,但这并没有发生在细胞治疗与足总。值得注意的是,足协是一种有效的活性氧清除剂由于其结构( 11];尽管如此,看起来,FA本身并不是完全有效的抗氧化活性。因此一些组件(s)的提取可能是必要的,加上FA,获得最大的氧化活性。

胶原蛋白分泌和交联修复受伤的组织和胶原蛋白合成时最重要的一步是由转化生长因子β(TGF - β),这是由巨噬细胞和成纤维细胞分泌 22]。因此提取和FA的影响成纤维细胞分泌胶原蛋白的检查。如图 5(一个),提取能够显著促进胶原蛋白由成纤维细胞和分泌增加控制相比上升了5%;相比之下,足总不会增加胶原蛋白的分泌。表达TGF - β还分析了西方墨点法,发现表达的TGF - β在对治疗的反应作为提取或FA与胶原蛋白分泌试验的结果(图 5 (c))。

STMN1的功能,ARPC5、NDKB MARE1已知与细胞迁移和伤口愈合 23- - - - - - 26];然而,这些蛋白的表达水平,根据我们的蛋白质组学分析发现,不同,分组到不同的集群(图 3集群,C, D, E)对药物治疗的反应。在这些情况下重要的是要澄清成纤维细胞上的每个治疗的影响,因此细胞迁移和伤口愈合实验是进行细胞治疗作为提取或足总。Transwell试验是用于细胞迁移测试。如图 5 (b),我们发现作为提取和FA似乎促进细胞迁移到相同的程度。此外,既是提取和足总对促进纤维母细胞有相同的影响伤口愈合(补充图2)。这些结果表明,足总可能作为提取的主要活性成分,促进细胞迁移和伤口愈合。

只有CAPNS1参与细胞生长(图基于蛋白质组分类 3、集群B)。磷酸化Akt,已知的因素参与促进细胞生长,因此实验测量的表达这两个因素在治疗后成纤维细胞作为提取或足总。如数据所示 5 (d)和 5 (e)的表达水平p-Akt和p-Erk只有调节成纤维细胞作为提取处理。这些结果与我们的细胞生存能力分析是一致的,这表明成纤维细胞细胞生长时增加了25%成纤维细胞作为提取处理,但这没有发生在细胞治疗FA(图 1)。这些发现表明,促进细胞生长是由作为提取治疗,这可能涉及upregulation Akt和Erk通路的成纤维细胞细胞治疗。

ROS扮演着一个重要的角色在伤口愈合的早期阶段( 30.受伤的地区),但过度ROS也有害附近的正常细胞。(PRDXs),抗氧化蛋白帕金森病蛋白质7 (PARK7),谷胱甘肽S-transferaseπ(GSTP1)归类为集群中的蛋白质调节成纤维细胞通过提取或FA(图 3集群)。PRDXs是多功能的家庭抗氧化剂thioredoxin-dependent氧化酵素,保护细胞免受过氧化氢( 31日, 32]。PRDXs家庭由六个成员组成,三个(PRDx2、PRDX4 PRDX6)被确定为调节在这项研究。PARK7充当协调者和诱导抗氧化基因的表达如谷氨酸半胱氨酸连接酶,谷胱甘肽( 33]。问题是一种多功能蛋白,可以减少氢过氧化物,进行解毒,和抑制物磷酸化;后者导致减少凋亡细胞数( 34]。质谱分析表明,PRDX-2、PDRX-4 PDRX-6, PARK7确认在我们的样例(表 1)序列覆盖率较低。然而,过氧化氢的量,提取后的成纤维细胞治疗大大降低(图 4 (e)),这表明抗氧化剂在药物治疗后细胞的存在。此外,GSTP1显著调节成纤维细胞中被处理,提取或FA(图 4(一))。一起我们的研究结果显示,在细胞ROS确实明显减少提取或FA治疗,很可能PRDX-2 PDRX-4, PDRX-6, PARK7, GSTP1参与这个过程。

TCTP(翻译控制肿瘤蛋白也叫fortilin)和GSTP1调节治疗作为提取或FA(图 3集群);此外,提取但不是足协能够诱导热休克蛋白β1 (HSPB1)表达式(图 3、集群B;图 4 (c))。TCTP分子的n端能够与Bcl-xL互动和帮助避免凋亡的细胞;TCTP表达差别相比之下,对这些增加凋亡细胞的数量( 35, 36]。它也报道称,下调的问题导致增加c-Jun NH2-terminal kinase-mediated凋亡[ 37, 38]。HSPB1 (HSP27)是伴侣,有助于蛋白质折叠;另外,它可以激活蛋白酶体允许它与变性蛋白质( 39]。磷酸化HSPB1能够抑制Daxx的交互与Fas或ASK1减少下游apoptosis-related激活蛋白( 40]。此外,伤口关闭延迟在混战SW480细胞指示HSPB1参与调节细胞迁移( 41]。我们的研究结果似乎表明,提取和足总可能激活抗凋亡细胞移植TCTP的表达和问题。此外,正如提取但不是足总可能抑制细胞凋亡的附加功能和调节细胞迁移在伤口愈合过程中通过upregulation HSPB1。

在伤口愈合钙离子起着重要的作用,细胞增殖、分化、粘附、迁移,和胶原蛋白分泌( 19]。包含膜联蛋白的膜联蛋白是膜蛋白核心域和守恒calcium-lipid绑定模块参与钙离子调节。此外,表达的膜联蛋白A2已经观察到在迁移增加肠道上皮细胞( 42]。在这项研究中发现膜联蛋白A2被调节成纤维细胞治疗作为提取或FA(图 3集群)。此外,突触囊泡膜蛋白VAT-1同族体(VAT-1)也被参与调节钙离子通量( 43]。我们发现,治疗与足总提取但不能够诱导的upregulation VAT-1(图 3集群B)。有趣的是,我们的生化分析进一步表明,胶原蛋白的分泌以及表达TGF - β大幅增加后,成纤维细胞提取物治疗但不是FA(数据吗 5(一个)和 5 (e))。因此我们建议提取能力大于FA影响钙离子调节以及任何相关的伤口恢复的效果。

细胞迁移是伤口愈合过程的一个重要组成部分 28]。核苷二磷酸激酶B (NDKB)和microtubule-associated蛋白质RP / EB家庭成员1 (MARE1)都是抑制在细胞治疗作为提取或FA(图 3、集群E)。NDKB(也叫nm23)似乎是一个转移抑制基因和被认为是参与细胞迁移,增殖,分化和发展( 25]。MARE1也被认为促进微管聚合和稳定微丝 26]。Downregulation NDKB和MARE1在成纤维细胞治疗作为提取或足总建议减少移民的抑制,这可能有利于细胞参与伤口愈合过程。Actin-related蛋白质2/3复杂的亚基5 (ARPC5)和stathmin (STMN1)都是调节FA但不是通过提取(图 3、集群C)。ARPCs能够调节肌动蛋白动力学和功能作为起始模板的新肌动蛋白丝分支现有灯丝( 24]。STMN1胞质磷蛋白质和行动被称为微管不稳定蛋白,结合自由形成微管蛋白,抑制微管的聚合( 23]。因此,我们的研究结果表明,随着提取和足总都是能够调节细胞流动性可能通过控制微管动力学。此外,值得注意的是,ARPC5, STMN1, NDKB序列覆盖率和得分最高质量光谱分析(表 1)。迁移和伤口愈合化验(图 5 (b))表明,提取和足总都促进细胞迁移,这同意上述发现。

CAPNS1 (calpain小亚基1)能够促进细胞增殖、迁移、粘附[ 44]。相比之下,LEG1 (galectin-1)超表达被认为是抑制正常小鼠纤维母细胞生长和细胞凋亡增加 45]。有趣的是,我们观察到CAPNS1调节(图 3集群B),而LEG1衰减(图 3、集群D)成纤维细胞治疗时提取;CAPNS1之间的这种对比变化的表达式和LEG1应该有利于纤维母细胞伤口愈合过程。此外,我们的研究结果还表明,在成纤维细胞有激活p-Akt提取和处理p-Erk表达式(数字 5 (d)和 5 (e))。因此,除了规范的表达CAPN1 LEG1,提取似乎也通过Erk和Akt通路调节细胞生长。

成纤维细胞的主要能源是糖酵解,LDHB表达这些细胞的增加将促进丙羟化酶活性,进而会增加乳酸生产胶原蛋白和羟基化;反过来,这些影响将有助于细胞容忍一个缺氧的环境,加快伤口愈合过程( 46]。我们发现作为提取和足总能够上调Triosephosphate异构酶的表达(tpi)在成纤维细胞(图 3,集群),而只有当提取可以激活磷酸甘油酸酯激酶的表达(PGK1)和L-lactate脱氢酶B链(LDHB)(图 3、集群B)。因此,我们得出结论,提取可能有更大的伤口愈合过程的有效性提供额外的能量通过上调糖酵解,这将帮助保护细胞缺氧。

综上所述,我们的结果显示一个可能的药理伤口愈合过程诱导成纤维细胞的提取和FA治疗(图 6)。多种因素可能参与伤口愈合过程诱导通过提取或足总。作为提取和FA似乎激活抑制活性氧的生产(PRDXs和PARK7),增强细胞迁移(MARE1和NDKB),促进糖酵解(tpi),增加antiapoptosis (GSTP1和TCTP),并调节钙离子(ANXA2),所有这些都应该在伤口愈合过程中增加细胞的可行性。独特的药理作用,提取已显示在这项研究包括增强人体皮肤由于LEG1表达的抑制成纤维细胞增殖,并增加CAPNS1表达式,和upregulation PGK1 LDHB,促进糖酵解和Erk和一种蛋白激酶信号转导通路的激活。成纤维细胞处理提取似乎也接受细胞凋亡的抑制由于增加HSPB1表达式。此外,胶原蛋白分泌增加(TGF - β),钙离子调节(VAT1)和增强细胞迁移(VIME下调)也有助于实现一个更有效的伤口愈合过程。此外,许多独特的功能,足总也透露,其中包括ROS抑制(GLRX3和FRIL)和促进细胞迁移的upregulation STMN1 NDKB ARPCS和下调。FA上面提到的额外功能应该加强与成纤维细胞相关的愈合过程作为一个整体。在这项工作中,我们已经描述了一个技术平台,能够揭示中药的基本原则;即如何作为其活性成分提取和FA参与伤口愈合过程的调制与成纤维细胞有关。这些结果将有助于和福利的临床应用时草药用于治疗热烧伤或创伤性损伤皮肤。