从注释的注射酸草dendrobii通过抑制醛糖还原酶活性预防糖尿病性白内障发病

抽象的

客观的．探讨石斛紫丁香酸(SA)对糖尿病性白内障(DC)发病机制的影响。方法．这两个在体外和在活的有机体内采用D-gal建立DC晶状体模型，采用MMT法检测SA对HLEC的增殖情况。SA治疗60 d后，用裂隙灯解剖显微镜观察大鼠晶状体透明度。采用2-DE和MALDI TOF/TOF方法提取分离SA蛋白靶蛋白。采用qRT-PCR检测AR基因表达。通过分子对接技术和动力学模型确定相互作用位点和结合特征。结果．针对AR, SA通过持续维持晶状体的透明度和延缓晶状体浑浊的发展提供了对d -gal诱导的损伤的保护。qRT-PCR证实SA对AR基因表达有抑制作用。集成电路₅₀SA对AR活性的抑制作用为213.17μ.克/毫升。AR-SA结合位点为Trp111、His110、Tyr48、Trp20、Trp79、Leu300和Phe122。主要的结合模式包括疏水相互作用和氢键。SA与AR非共价键的化学计量比为1.0 ~ 13.3。结论．水杨酸可通过抑制AR活性和基因表达来预防大鼠晶状体内DC，有潜力开发一种治疗DC的新药物。

1.介绍

由于改善的生活水平和饮食而增加人口衰老增加了糖尿病性白内障的发生率，常见的视力障碍和失明的原因[1]．糖尿病性白内障的发病机制复杂。虽然确切的机制尚不清楚，但大量研究表明醛糖还原酶(AR)是DC发展的关键酶[2]．为了减少糖尿病性能发病率并减缓当前患者的糖尿病性白内障的进展，需要进一步了解AR在糖尿病性白内障发育和进展中的机械累及。

在糖尿病患者中，AR激活增加多元醇代谢率。结果，葡萄糖醇在眼内积聚导致渗透压升高、细胞膜通透性改变、水肿和晶状体细胞损伤。这些变化阻碍了营养物质进入晶状体，进一步导致氨基酸水平降低，同时伴有蛋白质变性和聚合。这一过程的最终结果是白内障的形成和发展[3.]．此前对实验性醛糖还原酶抑制剂pg -1447和KIOM-79的研究表明，动物模型中AR还原酶抑制与预防糖尿病性白内障进展之间存在关系[4，5]．此外，在大鼠中，AR缺乏已被证明可以防止糖引起的晶状体混浊[2]但是，这种观察结果的临床有用性受到早期临床指标的限制，即这些药物也可能与肝功能异常有关，胃肠症状如恶心和腹泻，以及皮疹或湿疹[6]．因此，AR目前被认为是醛糖还原酶抑制剂(ARI)预防和治疗糖尿病性白内障和神经病变的重要靶点，尽管在临床实施之前研究人员面临着重大挑战[7]．

许多当代的报告都指出，在糖尿病性白内障的潜在治疗中，尽量减少急性呼吸道感染的副作用。据报道，使用传统的印度药用植物显示阳性，有希望的结果在体外醛糖还原酶在大鼠晶体中的抑制作用[8，9]．使用日本山茱萸树的提取物观察到类似的结果，山茱萸officinalis，抑制AR，减少白内障的发生体外［10.];然而，目前只对这些天然ARIs的酶活性进行了研究在体外．然而，一些最有希望的候选者是兰花石斛兰兰属(兰科)，常用作中药干茶和其他制剂[11.]．

草dendrobii，被称为中药中的shi hu，发现在兰花的茎中石斛兰高贵的Lindl和许多其他兰花种类的石斛兰属。在中国古代医学文献中约会了一千年，石斛兰据报道提取物改善视力[11.];然而，目前对这些提取物的化学成分及作用机理尚不清楚。最近的研究表明石斛兰提取物还可以具有其他生物活性性质，包括在人胃癌细胞中诱导细胞凋亡[12.，促进对应激诱导的PC12细胞凋亡的神经保护[13.]，抑制脂多糖- (LPS-)引起的大鼠记忆损伤[14.和巨噬细胞中脂多糖诱导的一氧化氮生成[15.]．也有人认为石斛兰提取物具有较强的抗氧化性能在体外［16.]．

丁香酸，一种天然存在的o -甲基化三羟基苯甲酸单体草dendrobii它的化学性质已被证明能促进氧化、聚合和缩合反应。像大多数自然产生的ARIs一样，丁香酸是一种酚类化合物，在药理学上作为一种抗氧化剂清除自由基[17.]．提示紫丁香酸可能通过AR抑制糖尿病性白内障的发生。

本实验采用d -半乳糖(D-gal)建立大鼠白内障模型，研究紫丁香酸对糖尿病性白内障的治疗和预防作用在体外和在活的有机体内．探讨了紫丁香酸抑制AR的作用机制，通过实验研究证实了紫丁香酸对糖尿病性白内障发病机制的新作用。

2.方法

活标本石斛兰高贵的采用(赤水执行草Dendrobii公司，贵州，中国)被收购。种属鉴定由广州中医药大学李伟教授完成。紫丁香酸的提取纯度大于98%，使用张雪先前描述的方法[17.]．

2．1．丁香酸对高浓度D-Gal致HLEC损伤组织及活性的影响

使用先前发表的技术培养人晶状体上皮细胞(HLEC)菌株SRA01/04(中国中山大学眼科中心)[18.]．在对数生长期，细胞在10⁴每孔细胞分为5组:正常对照组、模型组、紫丁香酸高剂量组、中剂量组、低剂量组。正常对照组用含10%胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)培养。模型组暴露于与正常对照组相同的培养基中，同时暴露于纯度为>99%的250mm D-gal(美国Amresco公司)。紫丁香酸高、中、低剂量组分别暴露于D-gal、0.4 g/L紫丁香酸、0.2 g/L紫丁香酸和0.1 g/L紫丁香酸。HLECs在Galaxy-s CO中培养120小时₂培养箱(RS Biotech，美国)，5% CO₂温度为37°C。使用pm倒置显微镜(Olympus Company, Japan)观察HLEC的组织学特征并拍照。

使用甲基噻唑基四唑(MMT)法检测HLEC活性(Sigma，美国)。紫丁香酸处理后，PBS缓冲液冲洗细胞，200μ.在培养孔中加入L的MTT(终浓度0.5 g/L)。共培养物在5% CO中培养₂37°C, 4小时。废弃MTT溶液，150μ.加入L DMSO(美国Amresco)。混合溶液在室温下温和搅拌10分钟，在490 nm波长下用全自动ELx800酶标仪(BioTek, USA)测定细胞生长。

所有实验重复三次，结果以平均结果表示。细胞存活率计算为暴露组的平均吸收值除以正常对照组的平均吸收值× 100%。细胞抑制率以100%减去细胞存活率计算。

2．2．丁香酸对透明度的测定效果在体外老鼠的镜头

根据已发表的方法进行大鼠晶状体培养[19.]．简单地说，大鼠被迅速脱位的颈椎和整个球眼(眼球)立即用眼剪提取。用含800 U/mL青霉素(广州白云山天心药业有限公司)和800 U/mL的冷PBS(广州Genebase Biotechnology，中国)冲洗全标本μ.g/mL(广州白云山天鑫药业有限公司)。随后将标本浸泡在含有双抗体溶液的相同浓度的PBS溶液中。10分钟后，将标本转移到含有500 U/mL青霉素和500的DMEM培养液中μ.g / ml链霉素。

从后极切开巩膜，小心地取出晶状体。将虹膜和玻璃体从表面去除后，用PBS溶液清洗两次，用DMEM溶液清洗一次，然后在预热的24孔培养板中培养。每孔加入含20%胎牛血清的DMEM培养基1 mL，青霉素100 U/mL，青霉素100μ.g / ml链霉素。

37℃，5% CO，预培养5小时₂丢弃大气、可见损伤或浑浊的镜片，得到30个完全透明的镜片供实验使用。随机分为正常对照组(DMEM培养基+ 100只)μ.紫丁香酸高、中、低剂量组(分别为紫丁香酸4、2、1 mg/mL)。阳性对照组用D-Gal + 100浸泡μ.L Catalin (pirenoxine钠)滴眼液:(批次070102;武汉天明药业有限公司，中国)。

在实验过程中，每6小时用未改变D-gal浓度的溶液刷新一次培养液。采用以前发表的方法评估晶状体浑浊度[20.]．简而言之，将镜头放置在A的交叉点上 mm slide with a black checked background and observed by anatomical microscopy (Olympus, Japan). Grade 0 turbidity was indicated by clear lines, Grade I (+) turbidity was indicated by vague lines with a distinguished outline, Grade II (++) turbidity was indicated by a vague outline with indistinct centers, and Grade III (+++) turbidity was indicated by a cloudy cortex with all lines invisible. After 24 h culture, digital photos were taken of each lens (Olympus, Japan). The turbidity grade for each specimen was measured by 2 independent observers using a blind observer methodology.

2．3.丁香酸对透明度的测定效果在活的有机体内老鼠的镜头

雄性和女性Wistar大鼠5-6周，由广州中医药大学（中国）的实验动物中心提供了80-120克。所有受试者的眼睛都与Tropicamide EyeDrops（北京双河药业有限公司）进行预处理。SLIT灯技术用于确认为实验选择的八十只大鼠的透镜透明度。使大鼠受试者可适应地饲喂1周，然后将它们随机化为体重和性别分层的4组：正常对照组和三种白内障模型组（注射酸，花萼和生理盐水组）。正常对照组受试者接受腹腔注射10ml / kg生理盐水，并用饮用水和食物喂食。白内障模型通过腹膜内注射10ml / kg 50％D-半乳糖溶液，每日两次，并提供受试者在饮用水和食物中免费获得10％D-半乳糖溶液。当大鼠受试者展示I-II级浊度时，用2％注射酸（3滴TID，注射酸基团），试素眼镜（0.8mg / 15ml，3滴TID，Calatin组）或甘氨酸组）或生理盐水等均处理它们（3滴TID，型号组）。十天后，通过狭缝灯观察镜片，如前所述记录浊度。观察到所有大鼠受试者全面60天。

２.４.2-DE和MS测定丁香酸对晶状体蛋白表达的影响

2.4.1。晶状体总蛋白的提取与检测

取正常对照组、模型组、紫丁香酸组大鼠晶状体，室温下与裂解液(1:10 w/v)一起放置1 h。这些标本在4°C下，在5810-R低温高速离心机(埃彭多夫，德国)以2000 rpm离心30分钟。然后使用Bradford法对含有晶状体蛋白的上清液进行定量[21.]，上清保存在−70℃。

用等电聚焦(IEF)分离晶状体蛋白。样本(350μ.g）浸泡在300μ.L在室温下用IPG Bio-rad线性凝胶条（pH5-8）的L溶液在室温下为12-15小时。Bio-rad等电聚焦槽用于二维电泳。将凝胶固定在固定液体中至少1小时，并洗涤三次10分钟。然后用Coomassie Blizor Blue G-250染色凝胶24小时。用Bio-Rad扫描仪扫描湿染色的凝胶，并用图像分析软件PDQuest7.1.1（美国Bio-rad，USA）分析凝胶图像。

2.4.2。MALDI-TOF-TOF质谱分析和数据库检索

完全冻干的晶体样品溶解在0.1%的三氟乙酸(TFA;采用MS-T100LP/LC质谱仪(Jasco，日本)进行分析。质谱鉴定采用混合点滴法。样品(0.4μ.L)点在384孔不锈钢板上，0.4μ.10毫克/毫升α-cyanocinnamic酸(CHCA;(Sigma，美国)添加底物溶液。

利用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)与飞行时间分析(TOF) (MALDI TOF/TOF)，利用源后衰变或高能碰撞诱导解离揭示肽段的氨基酸序列。样品自然风干后进行质谱分析(MS)。MS系统由337 nm的氮气激光器组成，采用反射技术和正离子检测。扫描在800-4000Da使用标准肽混合物作为外部校准标准。每个样品的MS信号是600-800个单独的激光射击的结果。从每个样品中选择信号噪声比(>100)最强的5个峰作为二阶质谱分析的前体离子。每个选定的前驱体离子的质谱信号是900-1200个单独激光射击的结果。利用GPS Explore V3.6软件对得到的一阶和二阶MS进行分析。将每个样本的一级和二级MSs数据整合到一个文件中，并使用MASCOT (v2.1)数据库鉴定蛋白质。

2．5．丁香酸对AR基因表达影响的RT-PCR检测

2.5.1。全晶状体RNA的提取、分离和检测

将大鼠晶状体标本放在有冰的臼中并磨成匀浆。匀浆在含Trizol (Invitrogen，美国)的冰浴中溶解，提取总RNA。采用紫外吸收法检测RNA纯度，采用1.2%甲醛变性凝胶电泳检测RNA完整性。

2.5.2。引物和cDNA的设计与合成

AR和β-actin由上海博雅生物技术有限公司设计合成。AR的PCR上游引物(P1)为5 ' -AGC GGT TTA GGT ACC ATG GGT TTT-3 '，下游引物(P2)为5 ' -AGG GTA AGC TTC GAA TTC TCA GGC GCG GAT TTG TTG TTG TTG TGA-3 '。片段长度为262 bp。P1的β-actin引物为5 ' -GAGACCTTCAACACCCAGCC-3 '， P2引物为5 ' -GCGGGGCATCGGAACCGTCA-3 '。片段长度为420 bp。

2.5.3。PCR分析

使用美国TaK aRa ExTaq HS酶和SYBR Green I荧光染料，在ABI PRISM 7000实时荧光定量PCR (qRT-PCR)放大器上进行荧光定量PCR。PCR溶液(25μ.l）含有Taq酶（12.5 μ.P1 (0.5 L)μ.L), P2 (0.5μ.L)，荧光探针(0.5μ.L)， cDNA模板(2.0μ.L)和焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液(9.0μ.l）。扩增程序包括在95℃下预制10 s，然后在90℃下循环退化5s，在60℃下进行31℃，重复40个循环。记录40个循环的循环阈值C（t）。使用物体mRNA拷贝的相对含量计算使用α-肌动蛋白作为内部标准。通过比较各组结果来评估基因表达水平的变化。AR基因的表达采用管家基因(β-肌动蛋白)。

2．6．丁香酸对AR活性抑制的测定

醛糖还原酶(AR)购自prospect - tany Technogene Ltd. (Israel)。使用先前发表的方法评估AR活动[22.]，检测温度为25℃。酶反应液(200μ.L)含酶溶液(20μ.L)， 0.104 mmol/L NADPHμ.L;10 mmol/L dl -甘油醛(50μ.L;Sigma，USA），0.1mol / L缓冲磷酸盐（pH6.2）和4个测试浓度（5 μ.克/μ.L, 10μ.克/μ.L，100 μ.克/μ.L, 200μ.克/μ.L)丁香酸。该反应由添加dl -甘油醛底物引起(Sigma，美国)。

在总反应时间为10分钟的情况下，通过观察NADPH在340 nm处每10秒一次的吸收下降来估计AR活性。以依帕司他(南京海陵制药有限公司)为阳性对照，PBS为空白对照。AR抑制率[23.]估计为 在哪里表示在不添加酶、底物或样品的情况下每分钟NADPH吸光度的降低;表示样品加入前每分钟NADPH吸光度的降低;表示样品加入后每分钟NADPH吸光度的降低。丁香酸的浓度对AR (IC)有50%的抑制作用₅₀)，由抑制曲线确定。用双倒数图法确定抑菌类型。动力学常数采用米歇里斯-曼腾方程计算。

2.7。丁香酸与AR相互作用位点及分子结合动力学分析

使用柔性对接模块(Flex X, Sybyl v.17.3)识别与酶活性区域结合的配体分子的中心区域。采用分子操作环境洗涤和能量最小化模块对丁香酸进行了研究。使用Gaussian03W软件进行节能优化，采用基本安装(B3LYP/6-31+G(d)) [24.]．得到优化后的最小构象图，从蛋白质数据库(PDB)中得到AR晶体结构和高分辨率结构(1USO) [25.]．利用这些方法，在配体晶体结构周围的6.5 Å区域确定了紫丁香酸与AR结合的活性位点。

Amber 10软件[26.]建立丁香酸与AR分子结合的动态仿真模型。为制备分子体系，建立拓扑和坐标文件，将力场设置为Parm99。模拟了三种情况:丁香酸体系中加入水，应用TIP3PBOX水模型，以及水和分子之间的9ns间隙。该分子被设计成八面体，因此避免了将蛋白质从水环境中冲走。这保证了整个系统的电中性。采用高斯03W进行节能优化，基本安装设置为HF/6-31G [25.]．通过丁香酸、辅酶NADPH和AR的氢化反应完成能量优化。

利用分子动力学剩余体积固定参数ntb = 1, ntp = 1, pes = 1, taup = 2和算法步长nstlim = 2500000，在1 atm, 300 K, 100 ps和Tb = 2的溶剂环境中进行了分子动力学模拟。经过6 ns的动态模拟，成像系统对分子运动进行跟踪。

2.8。丁香酸与AR结合的冷喷雾电离质谱表征

保留液为0.015 mmol/L无水乙醇加丁香酸，AR保留液为2.8μ.mol/L溶液，含50μ.g AR稀释500μ.L的水。将不同体积的丁香酸储备溶液放入Ep管中，使用加压吹气浓缩器进行浓缩。基于“增大化现实”技术的解决方案(25μ.L的2.8μ.mol/L)。紫丁香酸和AR溶液的摩尔比分别为3:1、9:1、27:1、81:1、243:1和729:1，用旋涡仪混合。用10 mmol/L乙酸铵缓冲液(pH 6.7;Genebase, GeneTech Co.， Ltd.， China)，经MS分析。

MS使用CSI源，扫描范围为m/z 100-1000。探测器电压为2500 V，针电压为−2200 V，相机镜头电压为−10 V，孔1电压为−75 V，孔2电压为−8 V。毛细管温度为10℃。20卷μ.L乙酸铵(10 mmol/L)采用负离子全扫描自动取样1 min。

2.9。统计方法

使用SPSS V.16.0统计软件（IBM，USA）完成统计分析和数据处理。数据表示为平均值和标准偏差．采用Nemenyi倍数比较法分析晶状体浑浊度的组间差异测试。少于被认为是统计学意义的价值（)．

3.结果

3.1。注射酸会影响HLEC的形态特征和活动

与对照组相比，高浓度D-gal (250 mM)处理后HLECs肿胀，可见液泡和颗粒增多，不规则细胞增多。细胞密度下降，漂浮细胞增多，提示细胞死亡。不同浓度丁香酸暴露后，HLECs不同程度恢复正常组织学。与低剂量和高剂量紫丁香酸组相比，暴露于中剂量紫丁香酸组的细胞恢复更完全(数据未显示)。因此，紫丁香酸可以减轻d -gal诱导的大鼠晶状体上皮细胞氧化损伤。

MTT测定结果（表1)，模型组HLEC抑制率(52.99%)明显高于其他各组()．丁香酸中剂量组HLEC生存率(79.97%)显著高于高剂量组(71.67%)和低剂量组(74.38%);)．

3．2．丁香酸的作用在体外和在活的有机体内大鼠晶状体浑浊

模型组培养6 h后光镜显示晶状体浑浊度为I级，其他组为0级(透明)。培养12 h后，正常对照组晶状体仍为0级。同时，模型组浊度从II级到III级，其他各组(包括丁香酸组和卡泰林对照组)浊度从I级到II级。

乘24小时后，对照组的所有镜片维持0级透明度。然而，模型组中的镜片明显小于注射酸基团中的镜片。模型组中的镜头是明显的象牙白的颜色，并且III级浊度显而易见。镜片对照组和注射酸组中的镜片浊度显着不那么严重，而不是模型组（)．此外，紫丁香酸高、中、低剂量组与卡泰林对照组的晶状体浑浊度无显著差异()．紫丁香酸中剂量组恢复程度最高。这些结果表明，丁香酸可以防止培养大鼠晶状体中高浓度D-gal (；表格2,图1)．

注射D-gal后23天，大鼠晶状体发生白内障，晶状体周围散点混浊加重，浊度由II级发展到IV级(图)1)．在正常对照组中，镜片在整个实验中保持透明（表3.)．模型组白内障持续至第90天，即使停止腹腔注射紫丁香酸和口服D-gal。紫丁香酸给药10天后晶状体浊度开始改善，治疗46天后进一步改善至I级或0级。这一可逆性程度甚至比仅达到II级或0级的对照组更快、更完全(图)2)．

3．3.丁香酸对晶状体差异蛋白质组学和靶蛋白分析的影响

双向凝胶电泳(2-DE)图在活的有机体内晶体组织如图所示3.．每组总晶状体蛋白电泳重复3次。在每个凝胶条中，高峰度透镜蛋白斑点主要分布在多肽亚基Mr 14400 ~ 45000和pI 6 ~ 8区域。从3个实验组中随机抽取1份凝胶电泳图，检测差异蛋白点。使用自动检测,观察正常组的蛋白斑点，模型组观察到蛋白斑点紫丁香酸组出现蛋白斑点。重复性分析表明，3种凝胶图的匹配率为%，%,%，表明有良好的组间重复性。

模型组共检测到27个差异蛋白点，其相对灰度值较正常对照组增加2倍以上()．紫丁香酸组有5个斑点与模型组比较增加2倍以上()．此外，鉴定了7个差异下调的蛋白点。将这12个差异蛋白点进行质谱鉴定和肽质量指纹图谱(PFM)。通过搜索蛋白质数据库，α-，β- - - - - -,γ.-蛋白、晶状体蛋白亚基和相关活性酶被鉴定。在这其中,镜头βA3,βB3，γ.B,β在d -半乳糖诱导的白内障大鼠中，A4结构蛋白表达减少，但紫丁香酸干预可恢复正常水平。晶体结构蛋白的类型α一个,αB,βA2，βB1,γ.N、肌动蛋白和泛素羧基末端水解酶L1在模型组表达量高于正常组，而丁香酸组表达量降低。模型组晶状体上皮细胞内与细胞代谢相关的内质蛋白AR高表达，紫荆酸组表达水平降低。基于这些发现，AR可能是丁香酸的靶蛋白。

3．4．丁香酸对晶状体AR基因表达的影响

通过qRT-PCR分析，与正常对照组相比，d -半乳糖模型组AR表达水平增加了4.32倍，丁香酸组AR表达水平增加了1.53倍(图)4)．这些发现可能表明注射酸下调AR的mRNA表达。

3.5。注射酸对Ar活动的影响

丁香酸抑制AR活性呈浓度依赖性(表)4)．的集成电路₅₀是213.17μ.克/毫升。数据表明，通过注射酸的抑制是非竞争性和浓度依赖性的。

3.6。丁香酸与AR的分子结合

以最小的均方根偏差(rmsd)记录10个对接构象，并对得分最高的构象进行建模分析。既往研究报道AR抑制剂的热点残基为Trp111、His110和Tyr48 [24.，25.，27.，28.]．丁香酸与AR结合的二维(2-D)图像识别了7个氨基酸残基Trp111、His110、Tyr48、Trp20、Trp79、Leu300、Phe122与丁香酸之间的相互作用(图)5)．其中，TRP111和HIS110在位1处具有相同的羟基离子（-OH），构成分子间氢键。这些氨基酸来自氢键的距离分别为2.47和2.61Å。

在Tyr48和丁香酸之间没有观察到分子间氢键。然而，在三维图形中，Tyr48和O基团之间的分子间氢键被识别在位置2。这些键被认为在AR与抑制剂的结合以及维持小分子与残基之间的疏水相互作用中发挥着重要作用。因此，提出芳香环与残基侧链之间的氢键和疏水作用是丁香酸与AR结合的驱动力。

丁香酸与AR结合后的动态模拟结果显示，在4ns范围内RMSD的变化为>1,4ns平衡相在正常范围内(<3)(图3)6（a）)．辅酶NADPH RMSD在4 ns内的变化为>0.5，表明系统稳定(图)6（b）)．4 ns内AR框架RMSD变化<1.5，表明实验蛋白框架稳定(图)6（c）)．对接后形成的氢键在2 ns内稳定，但3 ~ 4 ns间的RMSD变化为>5。这表明系统是不稳定的(图)6 (d))．

3.7。丁香酸与AR的非共价键比

紫丁香酸与AR的摩尔比不同，结合后形成紫丁香酸-AR复合物。采用负离子质谱和反褶积软件分析紫丁香酸- ar配合物的相对分子量5)．利用所得到的CSI-MS谱图计算了丁香酸- ar配合物在27.1摩尔比下的平均分子量。

随着紫丁香酸摩尔质量的增加，紫丁香酸- ar复合物的相对分子量逐渐增加，然后保持在饱和相对分子量(图)7)．这一发现可能表明紫丁香酸与AR的结合是浓度依赖的。

紫丁香酸与AR的结合受溶液pH和温度的影响。采用不同pH值，丁香酸与AR的摩尔比为27:1，考察37℃下丁香酸-AR化合物的形成。在pH 9时检测到最大分子量为36206.79，说明改变pH值影响丁香酸与AR的结合(表)6)．采用不同的溶液温度(5、10、15和25℃)研究了pH 6.7下相同摩尔比(27:1)的紫丁香酸- ar化合物的形成。10℃时最大分子量为36214.21，说明溶液温度的变化影响紫丁香酸对AR的结合(表1)7)．

通过检测不同浓度的紫丁香酸与2.8形成的紫丁香酸- ar复合物的分子量μ.mol/L AR，计算得到配合物的最大相对分子质量为36214.21。进一步计算还表明紫丁香酸- ar配合物的最大化学计量比为1:13 .3。

4。讨论

丁香酸是一种酚类成分草Dendrobii在这两种情况下，都能抑制糖尿病性白内障在体外镜片文化和在活的有机体内大鼠模型。协同酸与AR形成复合物，可减少糖代谢功能障碍引起的糖尿病性白内障的发生和进展。这些白内障的典型特征是双眼晶状体皮质混浊和后囊迅速发育，目前不进行手术治疗是无法治疗的[29.]．糖尿病患者的数量在全球范围内呈上升趋势，占全球总人口的2%，在发达国家更是高达5% [30.]．随着糖尿病，特别是2型糖尿病变得越来越普遍，开发有效的糖尿病性白内障非手术治疗方法变得越来越重要。

糖尿病性白内障的发病机制主要与高血糖诱导的渗透压障碍有关[31，32]．在当代研究中，AR已成为寻找抗糖尿病白内障药物的重要靶酶。在动物模型中，AR抑制剂(ARI)已被证明是预防和治疗糖尿病性白内障的有前景的药物[4，5，7，尽管对人体肝脏和胃肠道的显著副作用仍限制了临床应用[6]．这些早期的临床经验表明，如果可以有效地限制或管理副作用，这些化合物可能会改善对糖尿病性白内障的未来治疗。

以往的研究表明，人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells, HLECs)的凋亡是各种非先天性白内障共同的细胞基础[33]．d -半乳糖产生的糖尿病性白内障实验模型已被用于在豚鼠中探索这种情况[34]和老鼠[35]．利用这些完善的糖尿病白内障模型，目前的研究发现丁香酸干预有助于维持HLECs的形态特征和保护晶状体细胞在活的有机体内．有趣的是，发现最佳的工作浓度是一种注射剂的注射剂（0.2mg / ml）。本研究为潜在的抗糖分比度效应提供了初步证据，这些抗脂肪性白内障效应优雅探索。

为了更好地了解紫丁香酸的作用机制，研究晶状体总蛋白的表达在活的有机体内用2-DE进行了研究。镜头βA3,βB3，γ.B,βA4结构蛋白在D-半乳糖白内障大鼠中显现化了降低的表达。然而，对注射酸的干预能够恢复正常表达水平。镜片结构蛋白α一个,αB,βA2，βB1,γ.N、肌动蛋白、泛素羧基末端水解酶L1和AR在对照组中表达量较高，而丁香酸处理组表达量降低。由于AR与糖尿病性白内障之间的联系已被充分证明，AR是紫丁香酸最有可能的靶蛋白。其他透镜结构蛋白和泛素羧基末端水解酶L1也可能是丁香酸的靶点，但这些潜在的机制还需要进一步的研究来证实。

QRT-PCR对Ar活性对注射酸的抑制作用支持的假设是ar是注射酸最重要的靶蛋白。在QRT-PCR研究中，注射酸清楚地下调了AR的mRNA表达。类似地，显示注射酸以非竞争和浓度依赖性的方式抑制AR。这种在酶和mRNA水平的注射酸的这种双向作用方式对先前的药剂具有潜在的益处，该潜在的益处仅针对酶水平5，36]．以往的研究使用实验性醛糖还原酶抑制剂已经建立了AR还原酶抑制与预防糖尿病性白内障进展的关系。专门开发的AR抑制剂KIOM-79和GP-1447在糖尿病性白内障大鼠模型中显示出活性[4，5]．这些之前的研究也使用在体外，例体外， 或者在活的有机体内方法探讨AR抑制对糖尿病性白内障形成的影响。因此，目前的研究旨在包括两者的结合在体外和在活的有机体内本实验旨在为AR抑制机制提供更完整的认识。

利用分子模型预测丁香酸与AR结合的相互作用模式。对合成复合物的分析表明，Trp111、His110、Tyr48、Trp20、Trp79、Leu300和Phe122是参与结合过程的主要氨基酸残基。这一发现与之前的一项研究一致，该研究表明天然酚类海洋醛糖还原酶抑制剂与Tyr48、His110和Trp111残基的hALR2活性口袋形成稳定的氢键[24.]．除了这3个已知的结合残基外，AR上还发现了4个可能参与丁香酸结合的残基。因此，本研究对AR与底物复合结合过程提供了较为完整的认识。

冷喷雾电离质谱(ci - ms)和紫丁香酸- ar配合物负离子源分析表明，紫丁香酸- ar配合物的相对分子质量与紫丁香酸的载电流能力有关。当紫丁香酸与AR的摩尔比为27:1时，配合物的分子量最大。当丁香酸的摩尔重量增加到更高的水平时，结合力逐渐降低。这些结果还表明，丁香酸与AR的结合受温度和pH的影响，在10°C和pH 9.0时达到最佳结合水平。通过记录紫丁香酸- ar复合物结合条件的这些细节，本研究为进一步探索和开发紫丁香酸作为潜在ARI治疗糖尿病性白内障提供了基础。

紫丁香酸的潜在毒性有待进一步研究石斛兰在其他器官和系统中。此外，还需要进一步研究其对糖尿病性白内障组织的特异性，并探讨该治疗的相关副作用。由于历史上对石斛兰中药提取物用于视力治疗，具有很强的应用潜力，且无明显副作用;然而，当剂量和浓度超过天然提取物时，还需要进一步的研究来评估潜在的副作用。基于这些初步发现，丁香酸对普通白内障(非糖尿病性白内障)的治疗作用也值得进一步研究。

本研究首次明确证实了丁香酸在中药中的有效作用成分草Dendrobii，证明它能够保护大鼠免于实验性糖尿病和白内障的发展在体外和在活的有机体内．进一步研究丁香酸的作用机制发现，丁香酸以非竞争性和剂量依赖性的方式下调AR mRNA表达，抑制AR活性。因此，丁香酸对糖代谢和白内障的形成具有生理作用。通过结合残量、结合比、pH、最佳溶液温度等指标对AR紫丁香酸配合物进行了表征。这些参数的记录为丁香酸的进一步开发提供了有用的基础，丁香酸未来可能用于人类糖尿病和白内障的治疗管理。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金的补助金（81274157，81102674,30850012），广东自然科学基金（S201101005661）和广东科技规划项目（2011B031700076和2009B090300335）。

补充材料

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