1。介绍
增长的人口衰老由于生活水平和改善饮食增加了糖尿病性白内障的发生率,频繁导致视力损害和失明(
1 ]。一个复杂的发病机理是糖尿病白内障。虽然确切的机制仍然是不确定的,大量的研究表明,醛糖还原酶(AR)是一个关键酶参与特区发展(
2 ]。为了减少糖尿病性白内障发病率和延缓糖尿病性白内障的发展在当前病人,进一步了解机械的基于“增大化现实”技术的参与糖尿病白内障发展和发展是必需的。
在糖尿病患者中,基于“增大化现实”技术激活多元醇代谢率增加。因此,山梨醇积聚的眼睛造成渗透压增加,细胞膜通透性改变,水肿,破坏细胞的光学透镜。这些变化块通过营养物质进入镜头,进一步导致氨基酸水平降低伴随着蛋白质变性和聚合。这个过程的最终结果是白内障的形成和发展
3 ]。先前的研究实验的醛糖还原酶抑制剂gp - 1447和kiom - 79已经证明了基于“增大化现实”技术之间的关系还原酶抑制和预防糖尿病白内障进展在动物模型(
4 ,
5 ]。此外,基于“增大化现实”技术的缺陷已被证明能够防止sugar-induced镜头不透明的老鼠(
2 ),尽管这个观察的临床实用性受到早期临床指标,这些药物也可能与肝脏功能异常有关,胃肠道症状,如恶心、腹泻、皮疹或湿疹(
6 ]。因此,基于“增大化现实”技术是当今被视为一个重要目标,醛糖还原酶抑制剂(ARI)旨在预防和治疗糖尿病性白内障和神经病变,尽管面临重大挑战研究者在临床的实现是可能的(
7 ]。
众多当代报告处理的ARI副作用最小化潜在的治疗糖尿病性白内障。有前景的结果已报告使用传统印度药用植物展示积极的
在体外 抑制醛糖还原酶在大鼠晶状体
8 ,
9 ]。类似的结果已经观察到使用从日本山茱萸树提取物,
山茱萸officinalis ,抑制和减少白内障创世纪
体外 (
10 ];但是,只有这些自然阿里斯的酶活性进行了研究
在体外 。然而,一些最有希望的候选人的兰花
石斛兰 属(家庭兰科),中医常用的干茶和其他准备工作
11 ]。
草dendrobii 中医称为“胡,是兰花的茎中找到
石斛兰高贵的 采用和其他许多种兰花的
石斛兰 属。在中国古代医学文献追溯到一千多年,
石斛兰 据报道提取物改善视力(
11 ];然而,仍然没有公司的理解这些提取物的化学成分及机制的愿景。最近的研究表明,
石斛兰 提取可能也有其他生物活性属性,包括细胞凋亡的诱导人胃癌细胞(
12 ),神经保护的便利与压力诱导PC12细胞凋亡(
13 ),抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠记忆障碍(
14 ),LPS-induced巨噬细胞一氧化氮产量(
15 ]。它也被建议
石斛兰 提取物有很强的抗氧化特性
在体外 (
16 ]。
Syringic酸,一种天然O-methylated trihydroxybenzoic酸单体提取
草dendrobii 化学性质,已被证明有助于氧化、聚合、缩合反应。像大多数天然的阿里斯,syringic酸是一种酚类化合物,药物作为一种抗氧化剂清除自由基(
17 ]。这些发现表明,syringic酸可能通过基于“增大化现实”技术来抑制糖尿病性白内障的发展。
在目前的研究大鼠白内障模型建立使用D-galactose (D-gal)建立用于调查的影响syringic酸在治疗和预防糖尿病性白内障
在体外 和
在活的有机体内 。基于“增大化现实”技术的抑制的作用机理也检查,证明小说syringic酸对糖尿病性白内障的发病机制的影响通过实验研究。
2。方法
活标本
石斛兰高贵的 采用(赤水执行
草Dendrobii 有限公司,贵州,中国)。物种的鉴定是由广州中医药大学教授李伟。Syringic酸提取纯度大于98%使用前面描述的方法由张雪(
17 ]。
2.1。Syringic酸对组织学的影响,活动受伤HLEC引起的高浓度D-Gal
人工晶状体上皮细胞(HLEC)应变SRA01/04(中山大学眼科中心,中国)是培养使用以前公布的技术(
18 ]。在对数生长阶段,细胞在104 细胞每被分为5组:正常的控制,模型组,高剂量syringic酸组的中等剂量syringic酸组和低剂量syringic酸组。正常对照组培养在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)与10%的边后卫(美国Gibco)。模型组被暴露在相同的培养基作为正常对照组与250毫米D-gal的纯度> 99%(美国Amresco)。同样,高剂量、中等剂量和低剂量接触D-gal syringic酸组和0.4 g / L syringic酸,0.2 g / L syringic酸,分别和0.1 g / L syringic酸。HLECs galaxy s公司培养了120 h2 美国孵化器(RS生物技术)5%股份的氛围2 和温度37°C。使用PM-inverted HLEC组织学特性观察和拍摄显微镜(日本奥林巴斯公司)。
HLEC活动检测使用甲基噻唑基四唑(MMT)试验(σ,美国)。接触syringic酸后,细胞与PBS缓冲溶液清洗,200
μ L (MTT(最终浓度0.5 g / L)添加到文化井。cocultures孵化在5%的股份有限公司2 在37°C 4 h。MTT的解决方案是丢弃,150
μ L DMSO(美国Amresco)补充道。混合解决方案是温和室温下搅拌10分钟,和细胞生长在波长490纳米的化验全自动ELx800 enzyme-labeled计(美国BioTek)。
所有的实验都重复一式三份,结果表示为平均的结果。计算细胞存活率作为暴露组的平均吸收值除以平均吸收值的正常对照组×100%。细胞抑制率- 100%计算细胞存活率。
2.2。测量Syringic酸对透明度的影响体外<斜体> < /斜体>鼠镜头
大鼠晶状体文化进行根据以前公布的方法(
19 ]。简单地说,老鼠被快速颈椎脱位,和整个
球眼 (眼球)从每个主题中提取眼睛立即用剪刀。整个标本用冷洗净PBS(广州Genebase生物技术、中国)含800 U /毫升的青霉素(广州Baiyunshan Tianxin制药有限公司,有限公司,中国)和800年
μ 克/毫升的链霉素(广州Baiyunshan Tianxin制药有限公司,有限公司,中国)。标本随后被浸泡在同一个PBS溶液含有双抗体溶液的浓度。十分钟后,标本被转移到一个DMEM培养液含500 U /毫升的青霉素和500年
μ 链霉素的g / mL。
巩膜切开后的钢管,镜头是小心地删除。删除后的虹膜和玻璃体表面,镜头在PBS溶液洗两次,一次预热24-well DMEM解决方案之前文化文化板块。每种文化包含1毫升含20%胎牛血清的DMEM培养基,100 U /毫升青霉素,100
μ 链霉素的g / mL。
在37°C preculturing 5 h后5%的股份有限公司2 氛围,明显受伤或多云的镜头被丢弃,导致30完全透明的镜头用于实验。这些眼镜是随机分为正常对照组(DMEM培养基+ 100
μ L的边后卫),模型对照组(正常组中+ 250毫米D-gal)和高,中,低剂量syringic酸组(4、2、1毫克/毫升syringic酸、职责)。一个积极的对照组是浸泡在D-Gal + 100
μ L铸塑酚醛塑料(pirenoxine钠)眼药水:(批070102;武汉天明(制药有限公司、中国)24 h。
在实验过程中,文化的解决方案是刷新每6 h使用解决方案与一个一成不变的D-gal浓度。镜头浊度由以前公布的评估方法(
20. ]。简单地说,镜头是放置的交叉点上
1
×
1
毫米幻灯片和一个黑色的背景检查和解剖显微镜观察到(日本奥林巴斯)。0级浊度被清晰的线,表示一级(+)浊度与杰出的轮廓被模糊的线条表示,二级(+ +)浊度与模糊中心显示了一个模糊的轮廓,和三级(+ + +)表明浊度多云皮层与无形的所有行。24小时后文化、数码照片拍摄的镜头(奥林巴斯、日本)。每个样品的浊度等级是衡量2使用盲观察者的方法独立观察员。
2.3。测量Syringic酸对透明度的影响体内<斜体> < /斜体>鼠镜头
男性和女性Wistar鼠年龄在5 - 6周重80 - 120克提供的广州中医药大学实验动物中心(中国)。所有受试者使用的眼睛Tropicamide眼药水(北京Shuanghe制药有限公司,中国)。裂隙灯的技术被用来确定在八十大鼠晶状体透明度选择实验。老鼠受试者可以适应饲料1周,然后他们随机分成4组体重和性别分层:正常对照组和三个白内障模型组(Calatin syringic酸,生理盐水组)。正常对照组受试者收到10毫升/公斤生理盐水腹腔注射和喂养饮用水和食物。白内障模型成立10毫升/公斤的腹腔注射50% D-galactose解每日两次,受试者提供免费获取D-galactose解决10%的饮用水和食物。当老鼠主题展示i ii级浊度,另外2%处理syringic酸(3滴TID syringic酸组),铸塑酚醛塑料眼药水(0.8毫克/ 15毫升,3滴TID Calatin集团),或生理盐水(3滴TID,模型组)。十天后,眼镜被裂隙灯观察,浊度是记录如前所述。所有的老鼠受试者观察满60天的时间。
2.4。测量Syringic酸2 de和MS对晶状体蛋白表达的影响
2.4.1。总晶状体蛋白的提取和检测
镜头中提取大鼠正常控制,模型,syringic酸组和放置在一个迫击炮与溶菌产物(1:10 w / v)在室温下1 h。这些标本是离心机为30分钟2000转5810 - r在4°C低温高速离心机(埃普多夫,德国)。包含透镜产生的浮在表面的蛋白质被量化使用布拉德福德的方法(
21 ),上层清液保存在−70°C。
Isoelectrofocusing (IEF)被用来隔离晶状体蛋白质。样本(350
μ g)在300年被浸泡
μ L的解决方案与IPG Bio-Rad线性凝胶贴片(pH值5 - 8)在室温下12 - 15小时。Bio-Rad等电聚焦槽用于二维电泳。这种凝胶固定在固定液至少1 h和洗了三次10分钟。然后凝胶染色与考马斯亮蓝g - 250 24 h。湿凝胶染色Bio-Rad扫描仪进行扫描,和凝胶图像分析与图像分析软件PDQuest7.1.1(美国Bio-Rad)。
2.4.2。MALDI-TOF-TOF质量色谱分析和数据库搜索
完全冻干透镜样品溶解在0.1%三氟乙酸(组织;美国σ)进行了分析使用一个MS-T100LP / LC质谱仪(Jasco、日本)。质谱确定了使用混合定位方法。样品(0.4
μ L)被发现在384不锈钢板,和0.4
μ L 10毫克/毫升
α -cyanocinnamic酸(CHCA;美国σ)衬底的解决方案是补充道。
Matrix-assisted激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)分析(MALDI TOF / TOF)被用来揭示肽的氨基酸序列利用postsource衰变或高能collision-induced离解。样品进行了质谱仪(MS)后被允许自然风干。女士系统是由一个氮气体激光器(337海里)使用反射技术与正离子检测。扫描是在800 - 4000 da使用标准肽混合物作为外部校准的标准。女士信号为每个样本的结果600 - 800年个人激光枪。5峰与最强的信号噪声比(> 100)从每个样本被选为前体离子女士二阶分析。每个选择的信号女士前体离子是900 - 1200个人的结果激光枪。结果分析了一阶和二阶女士使用GPS探索V3.6软件。第一,二阶MSs数据对于每个示例都集成到一个单一的文件,和蛋白质被确定使用吉祥物(v2.1)数据库。
2.5。测量Syringic酸通过rt - pcr对AR基因表达的影响
2.5.1。总镜头RNA的提取、分离和检测
大鼠晶状体标本放在与冰和地面砂浆形成匀浆。匀浆细胞溶解在冰浴含有试剂盒(英杰公司、美国),和总RNA提取。使用紫外吸收测定RNA纯度是化验,RNA完整性化验用1.2%甲醛变性凝胶电泳。
2.5.2。底漆和cDNA设计和合成
引物序列的AR和
β 设计并合成肌动蛋白由上海博雅生物技术(中国)。上游引物PCR (P1) AR 5′AGC GGT TTA GGT ACC ATG GGT TTT-3′,下游引物(P2) 5′gg GTA AGC TTC棉酚TTC柠檬酸GGC GCG手枪TTG TTG TGA-3′。片段长度是262个基点。P1的
β 肌动蛋白引物5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′, P2 5′-GCGGGGCATCGGAACCGTCA-3′。片段长度是420个基点。
2.5.3。PCR分析
荧光定量PCR进行使用达克aRa ExTaq HS酶(美国达克)和绿色SYBR荧光染料在ABI 7000棱镜定量实时PCR(存在)放大器。PCR(25的解决方案
μ 包含Taq酶(12.5 L)
μ P1 (0.5 L)
μ L), P2 (0.5
μ 荧光探针(0.5 L)
μ (2.0 L), cDNA模板
μ L)和焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液(9.0
μ L)在95°C,放大过程包括predegeneration 10年代,紧随其后的是循环退化在90°C为31 5 s和60°C年代,重复40周期。循环阈值C (t)的40个周期被记录。信使rna复制对象的相对含量计算使用
α 肌动蛋白作为内部标准。基因表达水平的变化进行评估通过比较每组的结果。AR基因的表达是规范化使用管家基因(
β 肌动蛋白)展览甚至在老鼠镜头表达。
2.6。测量的AR活性抑制Syringic酸
醛糖还原酶(AR)是购自Prospec-Tany Technogene有限公司(以色列)。基于“增大化现实”技术的游戏活动是使用以前公布的方法评估
22 )的检测温度25°C。酶反应的解决方案(200
μ (20 L)包含酶解决方案
μ L), 0.104更易与L NADPH (50
μ L;意大利罗斯,意大利),10更易与L DL-glyceraldehyde (50
μ L;σ,美国),0.1 mol / L磷酸缓冲(pH值6.2)和4(5浓度进行了测试
μ 克/
μ L, 10
μ 克/
μ L, 100
μ 克/
μ L, 200
μ 克/
μ L) syringic酸。的反应是由添加DL-glyceraldehyde衬底(σ,美国)。
AR估计通过观察活动的减少NADPH吸光度在340海里每隔10年代总10分钟的反应时间。Epalrestat(南京药业有限公司,有限公司,中国)被用作积极控制,和PBS被用来作为一个空白的控制。基于“增大化现实”技术的抑制率(
23 据估计为
(1)
(
1
- - - - - -
(
一个
2
- - - - - -
一个
0
)
(
一个
1
- - - - - -
一个
0
)
]
×
One hundred.
%
,
在哪里
一个
0
代表了降低NADPH每分钟吸光度不增加酶底物,或样品;
一个
1
代表了降低NADPH每分钟吸光度样品之前添加;
一个
2
代表了降低NADPH每分钟吸光度后样本之外。syringic酸的浓度导致50%抑制AR (IC50 )确定的合成抑制曲线。申请双重相反阴谋方法抑制类型的定义。使用Michaelis-Menten方程动力学常数进行了计算。
2.7。互动网站的分析和分子动力学Syringic酸绑定到基于“增大化现实”技术
灵活的对接模块(Flex X, Sybyl v.17.3)被用来确定配体分子的中部地区绑定到酶的活跃区域。分子洗操作环境和能源减少模块被用来研究syringic酸。Gaussian03W软件被用于减少能源优化使用基本安装(B3LYP / 6-31 + G (d)) (
24 ]。一个最低构象图得到优化,基于“增大化现实”技术的晶体结构和高分辨率结构uso(1)获得的蛋白质数据库(PDB)数据库(
25 ]。6.5使用这些方法时,周围配体晶体结构被确定为活性部位参与syringic酸绑定到基于“增大化现实”技术。
琥珀10软件(
26 )是用于创建一个动态仿真模型的分子结合AR syringic酸。准备分子系统,建立了拓扑和坐标文件,将Parm99力场。三个场景建模:添加水syringic酸系统,TIP3PBOX水模型的应用程序,一个9 ns水和分子之间的差距。分子设计作为一个八面体,从而避免洗水环境的蛋白质。这确保了整个系统的电中性。高斯03 w是用于能源优化,减少与一组基本安装高频/我感觉[
25 ]。能源优化完成后的加氢syringic酸、辅酶NADPH,基于“增大化现实”技术。
进行了分子动力学模拟在溶剂环境1 atm, 300 K, 100 ps,使用分子动力学和结核病= 2剩余体积固定参数的“挪威通讯社”星期六报导= 1,国家结核控制规划= 1,pes = 1, taup = 2,和算术一步宽度nstlim = 2500000。分子运动跟踪的成像系统在动态模拟6 ns。
2.8。描述Syringic酸和AR绑定的冷喷雾电离(CSI)女士
储备溶液包含0.015 L更易与无水酒精syringic酸,和基于“增大化现实”技术的储备解决方案包含2.8
μ 包含50 mol / L的解决方案
μ 500年g AR稀释
μ L的水。不同的卷syringic酸储备解决方案放在Ep管和集中使用加压气体吹集中器。基于“增大化现实”技术的解决方案(25
μ L的2.8
μ mol / L)被添加到每个管。Syringic酸的摩尔比率和基于“增大化现实”技术解决方案3:1,9:1,27日:1,81:1,243:1 - 729:1使用涡流计涨跌互现。解决方案是稀释50倍10更易与L乙酸铵缓冲(pH值6.7;Genebase,通用有限公司,中国),分析了MS。
女士使用CSI源在m / z扫描范围100 - 1000。检测器电压是2500 V,针−2200 V电压,镜头电压−10 V,洞1−75 V电压,电压和洞2−8 V。毛细管温度是10°C。一个卷的20
μ L醋酸铵(10更易/ L)是自动采样使用负离子全扫描1分钟。
2.9。统计方法
统计分析和数据处理完成后用SPSS v.16.0统计软件(美国IBM)。数据被表示为手段和标准偏差
(
的意思是
±
SD
)
。组间差异使用Nemenyi多个镜头浊度进行了分析比较
H
测试。
P
的值小于被认为是统计学意义(
P
<
0.05
)。
3所示。结果
3.1。Syringic酸影响HLECs的形态学特征和活动
与对照组相比,HLECs处理高浓度D-gal(250毫米)变得肿胀,证明液泡增多和颗粒,并演示了不规则的细胞的数量增加。细胞密度的减少和增加数量的漂浮细胞显示细胞死亡的发生。后接触不同syringic酸浓度,HLECs组织学在不同程度恢复正常。细胞暴露在中等剂量的syringic酸完全恢复比低收入和高剂量syringic酸组(数据未显示)。因此,syringic酸似乎减少D-gal-induced鼠晶状体上皮细胞氧化损伤。
MTT试验结果(表
1 )明显高于HLEC抑制(比例52.99%)比其它组(模型组
P
<
0.05
)。HLEC生存在中等剂量syringic酸组(79.97%)明显高于高剂量(71.67%)或低剂量syringic酸组(74.38%;
P
<
0.05
)。
表1
syringic酸在不同浓度的影响HLEC扩散。
集团
Syringic酸浓度(克/升)
HLEC扩散
存活率(%)
抑制率(%)
正常的控制
- - - - - -
0.5545
±
0.0029
One hundred.
0
模型控制
- - - - - -
0.2606
±
0.0029
*
47.01 *
52.99 *
高剂量syringic酸
0.4
0.4720
±
0.0032
74.38
25.62
中等剂量syringic酸
0.2
0.5250
±
0.0013
* *
79.97 * *
20.30 * *
低剂量syringic酸
0.1
0.4610
±
0.0035
71.67
28.33
*
P
<
0.05
相比syringic酸组和正常对照组。
* *
P
<
0.05
相对于高剂量和低剂量syringic酸组。
数据被表示为平均数±标准差(
n
=
6
)或百分比。部落之间的差异进行了分析使用Nemenyi多重比较
H 测试。
3.2。Syringic酸对体外<斜体> < /斜体>和<斜体>在老鼠体内< /斜体>浊度镜片
晶状体混浊了光学显微镜培养6 h后我在模型组和年级年级0(透明)其他组。文化12 h后,镜头还在正常对照组0级。同时,从二年级到三浊度观察模型组,和我从年级二世浊度在其他组织(包括syringic酸组和铸塑酚醛塑料控制)。
24小时后,所有的镜头在对照组保持年级0透明度。眼镜模型组则明显小于syringic酸组。镜头在模型组明显乳白色的颜色,和三级浊度明显。晶状体混浊明显不太严重的铸塑酚醛塑料对照组和syringic酸组比模型组(
P
<
0.05
)。此外,之间没有显著差异在镜头观察浊度高,中,低剂量syringic酸组和对照组铸塑酚醛塑料(
P
>
0.05
)。有趣的是,中等剂量syringic酸显示出复苏的最高学位三个syringic酸洗组。日积月累,这些结果表明,syringic酸可以防止浊度的进步培养鼠镜头引起的高浓度的D-gal (
P
<
0.01
;表
2 ,图
1 )。
表2
浑浊的分数,表示为总数+(+)的迹象,培养镜头在不同组织在不同的时间点
在体外 。
组
N
*
6小时
12小时
18 h
24小时
正常的控制
5
0
0
0
0
模型控制
5
5
9
13
15
铸塑酚醛塑料控制
5
0
4 * *
7 * *
9 * *
Syringic酸组
高剂量
5
3
6
7
11
中等剂量
5
1
2#
3#
6#
低剂量
5
3
7
11
12
N
*
:每组中使用的动物数量。
* *
P
<
0.05
相比其他组。
#
P
<
0.05
高和低剂量相比syringic酸组。
组间差异分析使用Nemenyi多重比较
H 测试。
清晰的线条表示等级0浊度;模糊的线和一个杰出的轮廓显示年级我(+)浊度,一个模糊的轮廓模糊线中心表示二级(+ +)浊度,多云的皮质,无形的所有行表示三级浊度(+ + +)。(数字列从6小时到24小时每组的总结“+”,表示一般浊度。)
代表镜头的照片不同组的老鼠显示syringic酸对晶状体浑浊化的影响
在体外 (×25)。(一)对照组;(b) Med-dose syringic酸组(2毫克/毫升);(c)模型组;(d)铸塑酚醛塑料集团;(e)高剂量syringic酸组(4毫克/毫升);(f)低剂量syringic酸组(1毫克/毫升)。铸塑酚醛塑料组与模型组相比,浊度和3 syringic酸组明显减少。中等剂量的最佳效果观察syringic酸组。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
老鼠镜头开发注入D-gal白内障23天后,此时镜头周围的散射点浊度变得恶化,发达的二级四世浊度(图
1 )。在正常对照组,镜头保持透明的在整个实验过程中(表
3 )。白内障模型组,持续90天,甚至停工后腹腔内注射D-gal syringic酸和口服。晶状体浑浊后开始改善syringic酸了10天的管理,进一步提高年级46天的治疗后我或年级0。这种程度的可逆性是更快和更完整的观察对照组铸塑酚醛塑料,它只取得了二级或年级0(图
2 )。
表3
比较组晶状体混浊的药物后在不同的时间点。
组
N
*
20天
30天
40天
60天
90天
正常的控制
40
0
0
0
0
0
模型控制
40
77年
92年
98 * *
110 * *
130 * *
铸塑酚醛塑料控制
40
77年
92年
65年
33
23
Syringic酸(2%)
40
77年
92年
57#
29日#
15#
N
*
:每组的眼睛使用数量。
* *
P
<
0.01
与正常相比控制和其他团体。
#
P
<
0.05
相比之下,铸塑酚醛塑料控制。
使用Nemenyi多个组间差异进行了分析比较
H 测试。
清晰的线条表示等级0浊度;模糊的线和一个杰出的轮廓显示年级我(+)浊度,一个模糊的轮廓模糊线中心表示二级(+ +)浊度,多云的皮质,无形的所有行表示三级浊度(+ + +)。(数字列从20 d - 90 d是每个小组的总结“+”,表示一般浊度。)
代表大鼠在不同组的镜头的照片显示syringic酸在白内障的效果
在活的有机体内 (×4)。(一)对照组;模型组(b);(c)铸塑酚醛塑料集团;(d) syringic酸组。在正常对照组,镜头保持透明。模型组、白内障坚持即使syringic酸腹腔注射和口服D-gal已停止(90天)。syringic酸组表现好于铸塑酚醛塑料集团与透镜浊度降低到年级我或年级0。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.3。Syringic酸对镜头的影响差异蛋白质组学和靶蛋白分析
双向凝胶电泳(2 de)的图形
在活的有机体内 镜头组织如图
3 。镜头总蛋白质的电泳每组重复了三次。在每个凝胶地带,斑点high-kurtosis晶状体蛋白主要是分布在多肽子单元的面积14400 - 45000先生和π6到8。一凝胶electropherogram随机选择从3实验小组,和点的微分蛋白质检测。使用自动检测,
340年
±
6
蛋白质斑点观察正常组,
427年
±
5
蛋白质斑点观察模型组,
345年
±
8
蛋白质斑点观察syringic酸组。可重复性分析表明,3凝胶图的匹配率
91年
±
5
%,
87年
±
6
%,
93年
±
3
%在正常、模型和syringic酸组,分别表示组间重复性好。
鼠晶状体蛋白质的二维图形。在每个凝胶地带,斑点high-kurtosis晶状体蛋白主要是分布在多肽子单元的面积先生14400年至45000年,π6到8.27。模型组差异蛋白质斑点被确定,显示增加比正常对照组(
P
<
0.01
)。syringic酸组,5点观察值增加2倍以上相比,模型组(
P
<
0.01
),观察7微分表达下调的蛋白质斑点。
(一)
正常组
![]()
(b)
模型组
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(c)
Syringic酸组
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总共有27个差异蛋白质斑点确定模型组的相对灰度值比正常对照组增加2倍多(
P
<
0.01
)。syringic酸组,5点被确定的值增加2倍以上相比,模型组(
P
<
0.01
)。此外,7微分表达下调的蛋白质斑点被确定。这12个差异蛋白质斑点受到女士的识别和肽质量指纹(PFM)。通过搜索蛋白质数据库,
α - - - - - -,
β - - - - - -,
γ ——,晶状体蛋白质亚基,和相关的酶活性被确定。在这其中,镜头
β A3,
β B3,
γ B,
β A4结构蛋白显示减少表达与D-galactose-induced白内障大鼠,虽然恢复了正常水平的干预syringic酸。镜头结构蛋白的类型
α 一个,
α B,
β A2,
β B1,
γ N、肌动蛋白和泛素羧基末端水解酶L1显示模型组的表达水平高于正常组,但他们的表达水平降低syringic酸组。内质AR蛋白,与细胞代谢在晶状体上皮细胞,模型组中高度表达,但是其表达水平是减少syringic酸组。基于这些研究结果,提出了基于“增大化现实”技术的可能的靶蛋白syringic酸。
3.4。Syringic酸对镜头AR基因表达的影响
与常规控制相比,AR的表达水平增加D-galactose模型组的4.32倍和1.53倍syringic酸组分析时存在(图
4 )。这些发现可能表明syringic酸会使AR的mRNA表达。
图4
syringic酸(2%)对AR D-galactose mRNA表达诱导0.5%。AR基因的表达规范化使用管家基因(
β 肌动蛋白)均匀鼠晶状体细胞表达。与正常对照组相比,模型组AR基因的mRNA水平增加了4.32倍和1.53倍syringic酸组,分别。
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3.5。Syringic酸对AR活性的影响
Syringic酸抑制浓度的方式(表基于“增大化现实”技术的活动
4 )。的集成电路50 是213.17
μ 克/毫升。数据表明,基于“增大化现实”技术的抑制syringic酸非竞争性和浓度依赖性。
表4
抑制syringic酸的基于“增大化现实”技术的活动。
Syringic酸(
μ g / mL)
抑制率(%)
5
11.728
10
30.740
One hundred.
52.970
200年
68.630
Syringic酸抑制基于“增大化现实”技术的活动在一个非竞争性和浓度的方式(IC50 = 213.17
μ g / mL)。
3.6。分子绑定Syringic酸的基于“增大化现实”技术
十对接构象记录以最小均方根偏差(rmsd),和最高的分数进行建模分析。先前的研究已经报道,热点残基的AR抑制剂Trp111, His110, Tyr48 [
24 ,
25 ,
27 ,
28 ]。二维(2 d)图形syringic酸绑定的基于“增大化现实”技术确定7个氨基酸残基之间的相互作用,Trp111 His110, Tyr48, Trp20, Trp79, Leu300, Phe122, syringic酸(图
5 )。其中,Trp111和His110有相同的氢氧离子在位置1(-哦),构成一个分子间氢键。这些氨基酸的氢键的距离是2.47和2.61,分别。
绑定syringic酸AR。(a)周围残留syringic酸和AR。(b)三维(3 d)图形syringic酸对接AR。syringic酸与AR在7个氨基酸残基Trp111, His110, Tyr48, Trp20, Trp79 Leu300, Phe122。(一)Trp111 His110有相同的氢氧离子在位置1(-哦),构成一个分子间氢键。3 d图形识别分子间氢键Tyr48和O组之间在位置2。
(一)
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(b)
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没有观察到分子间氢键Tyr48和syringic酸之间用二维图形。然而,在三维(3 d)图形之间的分子间氢键Tyr48和O组确认在位置2。这些债券被认为中扮演重要角色的绑定AR抑制剂和维护只之间的疏水作用和残留物。因此,建议芳环之间的氢键和疏水作用和残基侧链作为绑定syringic酸AR的驱动力。
动态仿真的结果syringic酸和AR绑定后显示RMSD在4 ns的变化> 1,平衡阶段4 ns是在正常范围内(<(图3)
6(一) )。辅酶NADPH的变化表示在4 ns > 0.5,表明一个稳定的系统(图
6 (b) )。基于“增大化现实”技术的框架表示的变化在4 ns < 1.5,表明一个稳定实验蛋白质框架(图
6 (c) )。对接后形成的氢键稳定在2 ns,但变化RMSD从3 - 4 ns > 5。这个观察表明,系统是不稳定的(图
6 (d) )。
syringic酸和基于“增大化现实”技术的动态模拟。(a)动力学仿真轨迹syringic酸和基于“增大化现实”技术;在4 ns (b) NADPH的变化;(c)变化的基于“增大化现实”技术的框架内4 ns;(d)的变化之间的氢键syringic酸和氨基酸残基在4 ns。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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3.7。非共价结合比率Syringic酸和基于“增大化现实”技术
不同摩尔比的syringic酸和AR形成syringic acid-AR复合物后绑定。的相对分子量syringic acid-AR分析了配合物阴离子女士和反褶积软件(表
5 )。的平均分子量syringic acid-AR复合物在27日:1克分子比使用获得CSI-MS光谱被计算。
表5
分子质量的syringic acid-AR复杂syringic酸的摩尔比率和基于“增大化现实”技术。
Syringic酸
基于“增大化现实”技术的分子质量
3:1
36196.69
9:1
36206.79
27日:1
36214.21
81:1
36202.75
243:1
36206.79
729:1
36198.04
当syringic酸的分子量增加,相对分子量的syringic acid-AR复杂的逐渐增加,然后保持在其饱和相对分子量(图
7 )。这一发现可能表明,AR的绑定syringic酸浓度相关的。
质谱的相对分子量syringic acid-AR复杂syringic酸的摩尔比率AR。(a)质谱的摩尔比率syringic acid-AR 27: 1;(b)计算的平均分子量syringic acid-AR复杂。
(一)
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(b)
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绑定syringic酸AR是受pH值和温度的解决方案。不同的pH值被应用于syringic酸的摩尔比率AR 27: 1调查的形成syringic acid-AR化合物在37°C。pH值的最大分子量36206.79发现,表明改变pH值影响syringic酸和AR的绑定(表
6 )。不同溶液温度(5、10、15和25°C)也被用于调查的形成syringic acid-AR化合物的摩尔比(27日:1)在pH值6.7。发现的最大分子量36214.21 10°C,表明改变溶液温度影响syringic酸AR绑定(表
7 )。
表6
pH值影响syringic酸和AR绑定。
pH值
先生的syringic acid-Ar化合物
6.0
36197.38
6.7
36202.75
8.0
36204.77
9.0
36206.79
pH值的最大分子量36206.79发现,表明改变pH值影响syringic酸和AR绑定。
表7
溶液温度影响syringic酸和AR绑定。
Tm (°C)化合物
先生的syringic acid-Ar化合物
5
36203.43
10
36214.21
15
36197.36
20.
36199.38
发现的最大分子量36214.21 10°C,表明溶液温度的变化影响syringic酸和AR绑定。
通过检测syringicacid-AR复杂由绑定的分子量不同浓度的syringic酸至2.8
μ mol / L,最大相对分子质量的复杂计算是36214.21。进一步计算还透露,最大的化学计量ratioofthe syringic acid-AR复杂是1:13.3。
4所示。讨论
Syringic酸、酚醛成分之一
草Dendrobii ,抑制糖尿病性白内障在两种
在体外 镜头的文化和
在活的有机体内 鼠模型在当前的研究中。协同酸形成一个复杂的基于“增大化现实”技术,可以减少糖尿病性白内障的发生和发展由糖代谢障碍引起的。这些白内障通常表现为快速发展的晶状体皮质浊度和后胶囊的眼睛,和条件目前不能没有外科手术治疗(
29日 ]。全球糖尿病患者的数量正在上升,占世界人口总数的2%,多达5%的人口在发达国家(
30. ]。糖尿病,特别是2型糖尿病,变得越来越流行,越来越重要的发展有效的非手术治疗糖尿病性白内障。
糖尿病性白内障的发病机制主要是与高血糖诱导渗透压障碍(
31日 ,
32 ]。在当代的研究中,基于“增大化现实”技术一直是一个重要的目标酶在寻找糖尿病白内障的药物。AR抑制剂(ARI)已被证明是有前景的药物预防和治疗糖尿病性白内障动物模型(
4 ,
5 ,
7 ),尽管重要的人类肝脏和胃肠道副作用仍然限制临床适用性
6 ]。这些早期的临床经验表明,如果副作用可以有效地限制或管理,这些化合物可以改善未来治疗糖尿病性白内障。
之前的研究表明,人类晶状体上皮细胞凋亡(HLECs)是常见的各种细胞基础noncongenital白内障(
33 ]。D-galactose-produced实验性糖尿病白内障模型被用来探索这个条件在豚鼠
34 )和大鼠(
35 ]。使用这些行之有效的糖尿病性白内障模型,目前的研究发现,syringic酸干预辅助维护HLECs和保护晶状体细胞的形态学特征
在活的有机体内 。有趣的是,最佳工作浓度被发现中等剂量的syringic酸(0.2毫克/毫升)。这项研究提供了初步证据为潜在的抗糖尿病的白内障的效果,值得进一步探索。
为了更好地理解syringic酸行动的机制,镜头的总蛋白表达
在活的有机体内 研究了使用两种。镜头
β A3,
β B3,
γ B,
β A4结构蛋白可以降低小鼠表达与D-galactose白内障。干预与syringic酸,然而,能够恢复正常的表达水平。镜头结构蛋白
α 一个,
α B,
β A2,
β B1,
γ N、肌动蛋白泛素羧基末端水解酶L1, AR表达水平高于对照组,但表达水平降低时对待syringic酸。由于证据确凿的基于“增大化现实”技术协会与糖尿病性白内障,基于“增大化现实”技术是最有可能的靶蛋白syringic酸。其他镜头结构蛋白和泛素羧基末端水解酶L1 syringic酸也可能是目标,但是还需要进一步的研究来检验和证实这些潜在机制。
中存在的发现和抑制syringic酸对AR活动支持假设的影响,基于“增大化现实”技术的最重要的靶蛋白syringic酸。在中存在的研究中,syringic酸明显下调mRNA表达AR。同样,syringic酸是在一个非竞争性抑制AR和浓度的方式。这种双重作用方式syringic酸酶和mRNA水平提供了潜在的好处在先前的代理,只针对酶水平(
5 ,
36 ]。之前的研究使用实验醛糖还原酶抑制剂之间的关系建立了AR还原酶抑制和预防糖尿病白内障进展。专门开发的AR抑制剂kiom - 79和gp - 1447人被证明是活跃在大鼠糖尿病性白内障模型(
4 ,
5 ]。这些以前的研究使用
在体外 ,
例体外 ,或
在活的有机体内 方法调查AR抑制糖尿病性白内障形成的影响。因此,当前的研究旨在包括两者的结合
在体外 和
在活的有机体内 实验以提供一个更完整的基于“增大化现实”技术的抑制机制的理解。
Syringic酸AR绑定是探索使用分子建模预测这两个分子的相互作用模式。分析合成复杂的证明Trp111 His110, Tyr48, Trp20, Trp79, Leu300, Phe122主要氨基酸残基参与绑定过程。这一发现与之前的研究一致显示稳定的氢键的形成自然酚醛海洋的醛糖还原酶抑制剂hALR2残留Tyr48活性口袋,His110, Trp111 [
24 ]。除了这些3绑定残留物,4其他残留物被确定基于“增大化现实”技术可能参与syringic酸绑定。因此,目前的研究提供了一个更完整的基于“增大化现实”技术的理解和基质复杂的绑定过程。
Cold-spray电离质谱(CSI-MS)和消极的离子源的分析syringic acid-AR复杂显示的相对分子量syringic acid-AR复杂与syringic酸的电流承载能力。复杂的分子量最高当syringic酸的摩尔比率AR是27日:1。增加syringic酸的分子量更高水平导致逐渐减少绑定。这些结果也表明绑定syringic酸AR既依赖于温度和pH值,达到最优结合水平10°C和pH值9.0。记录这些细节的syringic acid-AR复杂的约束条件,本研究为进一步勘探和开发提供了基础syringic酸作为一个潜在的ARI治疗糖尿病性白内障。
未来的研究将需要调查的潜在毒性syringic酸来自
石斛兰 在其他器官和系统。此外,需要进一步的研究,以研究其对糖尿病性白内障的组织特异性和探索相关的这种治疗的副作用。由于证据确凿的历史使用
石斛兰 提取在中药治疗视力,没有明显的副作用强潜力使用;然而,需要进一步的研究来评估潜在的副作用发生的剂量和浓度增加超出自然的提取。进一步调查syringic酸的治疗作用的常见的白内障,而不是由糖尿病引起的,也可能基于这些初步研究结果值得进一步研究。
累计,目前的研究提供了第一个明确确认syringic酸作为有效的工作组件
草Dendrobii ,证明它能够防止老鼠实验诱导糖尿病白内障
在体外 和
在活的有机体内 。syringic酸作用机制的进一步调查显示,它表达下调的mRNA表达AR和抑制AR活动在一个非竞争性和是剂量依赖性的方式。因此,syringic酸能够产生生理影响葡萄糖代谢和白内障的形成。AR syringic酸复杂特点确定了残留的绑定,绑定比、pH值、温度和最佳的解决方案。文档这些参数的进一步发展提供了一个有用的基础syringic酸对未来潜在的用于治疗人类糖尿病白内障的管理。