两种不同的维生素E异构体预防绝经后骨质疏松大鼠模型的骨质损失

抽象的

绝经后骨质疏松性骨质疏松主要是由于卵巢功能停止，这与自由基增加有关。维生素E是一种脂溶性维生素，是一种有效的抗氧化剂，能清除体内的自由基。在本研究中，我们研究了α -生育酚和纯生育三烯醇对去卵巢大鼠骨微结构和细胞参数的影响。将3个月大的Wistar雌性大鼠随机分为去卵巢对照组、假手术组和去卵巢大鼠分别给予α -生育酚或生育三烯醇治疗。在为期四周的研究期结束时，取股骨进行骨组织形态分析。卵巢切除术导致对照组骨丢失，表现为小梁体积(BV/TV)和小梁数量(Tb.N)减少，小梁间距(Tb.S)增加。卵巢切除术中破骨细胞表面(Oc.S)和成骨细胞表面(Ob.S)的增加表明骨转换率的增加。使用α -生育酚或生育三烯醇治疗可防止BV/TV和结核病的减少。以及结核病的增加。S，同时降低Oc。S和增加obs。综上所述，两种形式的维生素E能够预防卵巢切除术引起的骨丢失。 Both tocotrienol and alpha-tocopherol exert similar effects in preserving bone microarchitecture in estrogen-deficient rat model.

1.介绍

骨质疏松是一种致残和痛苦的条件，由此骨损失占主导地位，从而使骨高度易于骨折[1］.骨质疏松发生时由破骨细胞的骨吸收远远超过由成骨细胞的骨形成的地方。内分泌功能和代谢异常是骨质疏松症最常见的原因。对女性而言，雌激素缺乏，由于卵巢功能的停止是随着年龄的骨质流失的一个重要因素。在骨质疏松症的发病机制中涉及的其他因素包括在钙代谢中破骨细胞功能的增加，成骨细胞活性的抑制，和不平衡[2］.

活性氧(ROS)是氧的自由基形式，与包括骨质疏松在内的许多疾病过程有关。ROS的过度积累会导致氧化应激，而氧化应激又会通过脂质膜、蛋白质和核酸的过氧化作用导致细胞损伤。当机体抗氧化防御无法克服活性氧的生成时，氧化应激就会发生。最近的生化和遗传学研究已经提供了证据来支持骨质疏松症和氧化应激之间的联系[3.- - - - - -5］.也许最令人信服的证据是Muthusami等人的研究。在绝经后骨质疏松症大鼠模型中，所以显示不存在雌激素导致脂质过氧化指数的增加，其相应的内源性抗氧化酶的减少[6］.此外，自由基负责导致成骨细胞凋亡和减少骨菌细胞发生。据报道，过氧化氢，具有最高氧化活性的RO，涉及骨吸收前的形成和激活骨髓细胞体[7］.

抗氧化维生素可能被用于治疗和预防骨质疏松症的进展。目前，骨质疏松症治疗的目的是防止骨折发生(一级预防)，避免进一步骨折(二级预防)，稳定骨代谢，缓解疼痛。然而，没有一种单一的药物能够保持骨量和密度而不产生不良的和大多数不便的不利影响。这项研究是为了寻找一种使用维生素e的两种异构体治疗骨质疏松症的替代疗法。这种强大的脂溶性抗氧化剂维生素是生育酚的总称，即生育酚和生育三烯醇。此前的一项研究表明，在骨质疏松模型中，α -生育酚和棕榈维生素E(富含生育三烯醇)能保持骨密度(BMD) [8］.维生素E发挥其在预防骨质损失和维持BMD方面的作用的机制仍然不清楚。在本研究中，我们报道了α-生育酚和Tocotrienol对卵巢切除大鼠骨微体系结构的影响，这是绝经后骨质疏松症的良好的动物模型。

2.材料和方法

2.1。动物

将体重200-250 g的3月龄雌性Wistar大鼠随机分为5组，每组8只。基线组在实验开始时被杀死。另一组大鼠采用假操作，给予橄榄油(SHAM)作为载体。其余大鼠切除卵巢后分别给予vehicle (OVX)、生育三烯醇(OVX + PTT) 60mg /kg体重或相似剂量的α -生育酚(OVX + ATF)。卵巢切除术后两周开始治疗，以使大鼠恢复健康。橄榄油、生育三烯醇或生育酚通过口服灌胃针口服给大鼠，每周6天，连续4周。大鼠饲养在标准笼子中，每组3只，室温，光照-黑暗周期12小时。他们被喂食商业鼠粮(黄金硬币，巴生，雪兰莪，马来西亚)。饮用自来水自由．该研究是通过克班达州马来西亚大学动物伦理委员会（批准号码/ IMA / 23-7月/ 075）的批准进行的。

2.2。生育三烯酚和α-生育酚

-生育酚购自美国Sigma化学公司。由马来西亚棕榈油研究所(PORIM;-生育三烯醇、-生育三烯醇和-生育三烯醇的含量分别为37.2%、39.1%和22.6%。生育三烯醇的总组成为98.79%。以惠普HP 1100为流动相，以0.5% IPA/己烷为流动相，采用高效液相色谱法对棕榈生育三烯醇进行分析，并用荧光检测器检测。HPLC未检测到α -生育酚。

α-生育酚和Tocotrienol分别在橄榄油（Bertolli Classico，Italy）中稀释，以获得60mg / kg体重的浓度。

2.3。骨组织形态学

在尸检时，取出股骨并固定在4％甲醛溶液中用于进一步的处理之前24小时。左股骨脱钙骨部分按程序如通过Difford [所述制备9］.使用旋转电子锯（Black＆Decker，USA）切割股骨的远端半部，然后嵌入甲基丙烯酸甲酯聚合物中。重型切片机（2135型; Leica，德国）用于切割8微米厚的连续骨段。对于结构组织形态，未甲状腺切片用von kossa染色。在远距离股骨形状的次级Spongosiosa上进行组织素质测量，从生长板的最低点和1mm的双侧皮质的距离在3mm至7mm之间进行。在4倍的图像分析仪（VideoTest-Master，Russia）下，在4倍客观放大率下获得总组织区域，松质骨面积，骨表面和周边数据。结构参数如下：小梁骨体积（BV / TV） - 松散空间内的小梁骨的量，表示为％ - 向图形厚度（Tb.th） - 小梁的平均厚度表示为μ.m -小梁数(Tb.N)为每mm表达的小梁数目的平均值，小梁间距(Tb.S)为小梁边缘之间的距离，表达为μ.m。

从右股骨骨的脱钙部分获得细胞参数。骨骼在EDTA溶液中脱钙5周，然后在嵌入石蜡蜡之前，以梯度浓度脱水。将癸钙化股骨骨骨在5微米厚的使用中，后来用苏木精和曙红（H＆E）染色该部分。该参数是骨质体表面（OC.S）和成骨细胞表面（OB.S）。这些参数被计算为总骨表面的百分比，如透光显微镜（Olympus BX50，USA）与图像分析仪接口（图像Pro-Express，Media Cyber​​netics，USA）。

本研究使用的所有公式、命名法、符号和单位均为美国骨骼和矿物研究协会(ASBMR)命名委员会推荐的[10］.

3.统计分析

统计检验表明，所有数据均为正态分布。进行方差分析后进行Tukey的HSD与被认为是显着的。

4.结果

4．1.体重

治疗4周后，大鼠的所有组显示出体重在整个研究期间持续增加。然而，去卵巢大鼠曾在体重，与假研究结束和显著增加治疗的大鼠（表1）.

4．2．骨Histomorphometric参数

与基线组、假手术组和治疗组相比，去卵巢大鼠骨体积(BV/TV)和骨小梁数量(Tb.N)显著减少，而骨小梁间距(Tb.S)显著增加(图)1，2,3.）.卵巢切除也引起相对于其他三组两个破骨细胞表面（Oc.S）和成骨细胞表面（Ob.S）（表显著增加2）.卵巢切除不引起任何改变小梁厚度（Tb.Th）参数（图4）.

与任一α-生育酚或生育三烯切除卵巢的大鼠的治疗防止了骨小梁体积和骨小梁数量的减少和防止骨小梁分离的增加。与这两种形式的维生素E处理的大鼠有更高显著BV / TV和Tb.N而Tb.S被显著比OVX组降低（图1，2,3.）.小梁厚度参数无明显变化(图)4）.棕榈生育三烯醇或α -生育酚的治疗也可以防止破骨细胞表面的增加。OVX + PTT和OVX + ATF组的破骨细胞表面明显低于OVX组(见表2)2）.与BV / TV，TB.N，TB.S，TB.Th和OC.S，TB.TH和OC.S.与基线和假组进行任何形式的维生素E治疗没有导致任何差异。然而，与两种类型的维生素E处理的卵巢切除大鼠与具有完整卵巢的大鼠相比具有高骨细胞表面（表2）.

4.3。骨骼组织学

数字5显示各组大鼠远端股骨形而上的显微照片。在切除卵巢的患者中，骨小梁明显缺失(图)5(一个)），同时在切除卵巢的大鼠任一形式的维生素E防止骨损失（图治疗5 (c)和5 (d)）.

5.讨论

长久以来建立的卵巢切除对体重增加的影响。去卵巢大鼠已经增加食物摄入量为他们的食欲增加[11，12］.食欲的这种变化部分是由于当雌激素缺乏时由脂肪组织释放的低水平的瘦素。瘦素在下丘脑上工作，以控制食物摄入和能源支出[13，14］.

摘除卵巢导致大鼠骨质减少，切除卵巢的动物已被用作绝经后骨丢失的模型[15- - - - - -18］.在我们的研究中，在去卵巢的大鼠中发现了骨丢失与骨吸收和形成指数的增加。这些大鼠的结构变化明显，其小梁骨体积明显低于对照组。骨小梁总数量减少，骨间分离广泛，可见骨小梁分离指数高。破骨细胞表面的再吸收指数(Oc.S)较假手术大鼠增加2倍。去卵巢大鼠的成骨指数和成骨细胞表面(Ob.S)也有所增加。由于雌激素缺乏，骨吸收和形成指标的增加表明骨转换率增加。骨吸收和破骨细胞活动必须大于成骨细胞形成的骨，才能说明骨的净损失。骨丢失反映在骨小梁的显微照片上，与假手术组相比，去卵巢的大鼠骨小梁穿孔和停止(图)5(一个)和5 (b)、职责)。这些在绝经后大鼠模型中的发现与之前的研究一致[19，20.］.

本研究还显示小梁数量减少，小梁表面增加，小梁体积减少，但小梁厚度没有变化。这些观察结果与以前的报告一致[12，21］.他们证实了卵巢切除术引起的骨丢失的主要机制是破骨细胞吸收导致的骨小梁穿孔和缺失。骨丢失不伴有骨板变薄。这种破骨吸收最终导致小梁骨完全丧失。雌激素缺乏早期骨丢失的主要机制是穿孔。这是骨丢失的快速阶段，它只发生短暂，因此得名“短暂重构”[20.］.随后的骨质丢失伴随着小梁变薄，这在对去卵巢大鼠的长期研究中可见[22］.

雌激素缺乏刺激骨吸收的细胞和分子机制越来越受欢迎。雌激素缺乏上调RANKL，导致骨质体招生和激活的增加，以及骨质体细胞凋亡的降低。缺乏雌激素也通过骨细胞造成骨质细胞产生的OPG生产，导致骨吸骨吸收的RANKL / OPG比率增加。此外，有报道称雌激素抑制了像M-CSF，TNF-的骨再吸收细胞因子的表达α.IL-1和IL-6，而雌激素的缺乏会增加这些因素。雌激素对破骨细胞也有直接作用，缺乏这种激素会直接抑制破骨前体细胞的凋亡，增加破骨前体细胞向成熟破骨细胞的分化[23］.

雌激素缺乏对骨骼系统的影响可能是由自由基活性的增加引起的。最近，有很多研究表明反应性氧物种，雌激素缺乏和骨质损失之间的联系。几种细胞内信号对于骨细胞形成必不可少的核因子-kappa b（nf-B），c-Jun的氨基末端激酶和磷脂酰肌醇3-激酶是活性氧物种[敏感24］.雌激素的急性丢失会增加ROS的水平并激活NF-κ..B.它也增强了，是一种氧化还原酶，可放大ROS的生成并刺激成骨细胞凋亡[25］.另一项研究表明，雌激素缺乏降低了破骨细胞中的抗氧化剂防污，导致破骨细胞痉挛增加[7］.

或任一α-生育酚的施用纯生育三烯酚防止卵巢切除引发的骨丢失。这通过增加骨小梁体积与在小梁间距下降在骨小梁数量一起的相应增加本研究中是明显的。给定的α-生育酚和棕榈大鼠的骨小梁的显微照片生育三烯酚出现类似于假大鼠（图5 (c)和5 (d)）.这一结果与另一项研究一致，该研究也使用维生素E来防止尼古丁引起的骨质减少[26］.维生素E保护骨流失的作用也与本研究显示的破骨细胞表面减少与成骨细胞表面平行增加相对应。本研究结果强烈表明，维生素E可能通过抑制破骨细胞的发生和刺激成骨细胞合成更多的骨来保护骨微结构。维生素E的合成代谢特性已在以前的一项研究中得到证实，在补充α -生育酚或生育三烯醇的雄性大鼠中，维生素E可增加骨量[27］.此外，维生素E可以通过促进骨钙化和矿化来防止小梁骨流失[8，28］.

抗氧化维生素在清除氧化胁迫中的ROS中的主要作用已经很好地建立了。维生素E系列由八个天然存在的异构体组成α.-，β-，γ.-， 和δ.-Tocophhers以及α.-，β-，γ.-， 和δ.- tocotrienols。涉及维生素E的大多数研究报告了α-生育酚异构体，因为它在市场上广泛可用。Tocotrienols类似于生育酚，除了它们在烃尾部有三个双键而不是在生育酚（Tocophherols）中发现的饱和尾巴[29，30.］.该化合物为纯生育三烯醇，HPLC检测不含生育酚。生育三烯醇主要由γ异构体组成，其次是α，其余是delta生育三烯醇。本研究中α -生育酚的作用与纯生育三烯醇相当。然而，大多数调查维生素E对骨骼影响的研究表明，生育三烯醇比生育酚更好[26，31.- - - - - -33.］.

本研究中使用的Tocotrienol剂量基于Ahmad等人的先前研究。[33.] which showed that, at the dose of 60 mg/kg body weight, tocotrienol was able to prevent the increase of bone-resorbing cytokines in a free-radical-induced rat model. This dose was proven to be safe as toxicity studies in rats showed there was no adverse effect observed even at an extremely high dose of 2500 mg/kg body weight [34.］.

通过预防氧化应激可以通过涉及等级/ RANKL的类似途径介导维生素E对骨的正效应。Lee等人。[35.]和IIa等。[36.表明维生素E通过抑制RANKL表达和信号通路，而不影响OPG表达，从而阻止破骨细胞发生和骨吸收。维生素E也被证明能抑制骨吸收细胞因子的释放和表达[36.］.这些对维生素E作用的有限研究表明，维生素E可能直接影响破骨细胞的募集和破骨细胞的形成。当然，为了确定其对骨代谢的确切作用机制，还需要进一步的研究。

综上所述，以α -生育酚或生育三烯醇的形式补充维生素E可防止卵巢切除术引起的骨质减少大鼠的骨丢失并维持骨微结构。需要进一步的研究来探索不同维生素E异构体在代谢性骨病中的潜力。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

参考文献

1. p·m·多兰(P. M. Doran)和s·科斯拉(S. Khosla)合著的《骨质疏松症》(Osteoporosis)当代内分泌学:诊断内分泌学手册，J. E. Hall和L. K. Nieman，EDS。，PP.257-275，Humana Press，Totowa，NJ，美国，2003年。视图:谷歌学术
2. A. M. Parfitt，“骨骼异质性和骨重建的目的:对骨质疏松症理解的启示”，刊于骨质疏松症，R.马库斯D.费尔德曼和J.凯尔西，编，第433-447，学术出版社，圣迭戈，加利福尼亚州，美国，第二版，2000。视图:谷歌学术
3. B. E. Bax，A.S.M.T. Alam，B.Banerji等，“促进过氧化氢骨质体骨吸收的刺激”生物化学与生物物理研究通讯第183卷，第183期。3，第1153-1158页，1992。视图:出版商网站|谷歌学术
4. I. R. Garrett, B. F. Boyce, R. O. C. Oreffo, L. Bonewald, J. Poser, and G. R. Mundy，“体外和体内的啮齿动物骨骼中，氧衍生的自由基刺激破骨细胞骨吸收”，临床调查杂志第85卷第1期3，第632-639页，1990。视图:谷歌学术
5. W. Dröge，“自由基对细胞功能的生理控制”，生理评测，卷。82，没有。1，pp。47-95,2002。视图:谷歌学术
6. S. Muthusami，I. Ramachandran，B.Muthusamy等，“卵巢切除术，诱导氧化应激并损害成年大鼠的骨抗氧化系统，”Clinica Chimica Acta，卷。360，没有。1-2，pp。81-86,2005。视图:出版商网站|谷歌学术
7. J. M. Lean, J. T. Davies, K. Fuller等人，“硫醇抗氧化剂在雌激素缺乏性骨质流失中的关键作用，”临床调查杂志，卷。112，没有。6，pp。915-923，2003。视图:出版商网站|谷歌学术
8. M. Norazlina，S.IMA-NIRWANA，M.T.A。扫铁和B.A.Kadir Khalid，在种植女性大鼠中正常骨钙化需要Tocotrienols，“亚太临床营养杂志，第11卷，第5期。3，页194-199,2002。视图:出版商网站|谷歌学术
9. J. Difford，“一种制备未脱钙骨甲基丙烯酸甲酯包埋介质的简化方法”，医学实验室技术，卷。31，不。1，第79-81，1974。视图:谷歌学术
10. A. M. Parfitt，M.K.Drezner，F.H.Glorieux等，“骨组织形态：命名法标准化，符号和单位。ASBMR组织形态形态术语命名委员会的报告，“骨矿物研究杂志，卷。2，没有。6，第595-610，1987。视图:谷歌学术
11. K. Kippo，R.Hannuniemi，T.Virtamo等，“Clodronate对大鼠卵巢切除术引起的骨质周转和骨质损失的影响，”骨，第十七卷，第二期6，第533-542页，1995。视图:出版商网站|谷歌学术
12. T.Tanizawa，A. Yamaguchi，Y.Uchiyama等，“在卵巢切除大鼠中，特别参考急性炎症的卵形切除大鼠骨形成和骨吸收升高，”骨第26卷第2期1，页43-53,2000。视图:出版商网站|谷歌学术
13. M. Cnop, M. J. Landchild, J. Vidal等，“腹腔内和皮下脂肪的同时积累解释了胰岛素抵抗和血浆瘦素浓度之间的关系:两个脂肪室的独特代谢效应。”糖尿病，卷。51，不。4，第1005至15年，2002年。视图:谷歌学术
14. J. S. Mayes和G. H. Watson，《性类固醇激素对脂肪组织和肥胖的直接影响》，肥胖评论，第5卷，第5期。4，页197-216,2004。视图:出版商网站|谷歌学术
15. D. N.Kalu，“绝经后骨质损失的卵巢切除大鼠模型”骨矿，卷。15，不。3，第175-191，1991。视图:出版商网站|谷歌学术
16. T. J. Wronski和C. F. Yen，“将切除卵巢的大鼠作为绝经后骨质流失的动物模型，”细胞和材料，增刊1，第69-74，1991。视图:谷歌学术
17. S. Ima-Nirwana, M. Norazlina，和B. A. K. Khalid，“性腺切除术后生长中的雄性和雌性大鼠骨密度的模式”，中国内分泌社会东盟联合会，卷。16，PP。21-26,1998。视图:谷歌学术
18. S. Ayres, W. Abplanalp, J. H. Liu，和M. T. R. Subbiah，“雌激素保护作用的机制β脂质过氧化和DNA损伤，"美国生理学杂志第274期6, pp. E1002-E1008, 1998。视图:谷歌学术
19. H. M.霜冻和W.S.S. Jee，“对人骨骨骨和骨质疏松症的大鼠模型，”骨矿第18卷第2期3，第227-236页，1992。视图:出版商网站|谷歌学术
20. N. A.模拟人生，H. A.莫里斯，R. J.摩尔，和T. C. Durbridge，“增加的骨吸收的增加先于在卵巢切除大鼠的骨形成，”钙化组织国际，第59卷，第59期2，页121-127,1996。视图:出版商网站|谷歌学术
21. A. Gal- moscovici, M. Gal, M. M. Popovtzer，“24,25(OH) 2D3治疗骨质疏松切除卵巢大鼠”，欧洲临床研究杂志，卷。35，不。6，pp。375-379,2005。视图:出版商网站|谷歌学术
22. D. W. Dempster，R.Birchman，R.Xu，R. Lindsay和V.沉，卵巢切除术后立即大鼠松质骨骼结构的时间变化，“骨，卷。16，不。1，pp。157-161,1995。视图:出版商网站|谷歌学术
23. E. Seeman，《男女骨质脆弱的发病机制》《柳叶刀》，第359卷，第2期9320页，1841-1850,2002。视图:出版商网站|谷歌学术
24. B. L.克拉克和S.科斯拉，《骨流失生理学》，北美的放射学诊所，第48卷，第48期3，页483-495,2010。视图:出版商网站|谷歌学术
25. W. Dröge，“自由基对细胞功能的生理控制”，生理评测，卷。82，没有。1，pp。47-95,2002。视图:谷歌学术
26. M. Almeida, L. Han, E. Ambrogini, S. M. Bartell和S. C. Manolagas，“氧化应激刺激细胞凋亡和激活NF-κ..B通过PKC在成骨细胞中β/ P66SHC信号级联：雌激素或Androgens的计数器调节，“分子内分泌，卷。24，不。10，pp。2030-2037，2010。视图:出版商网站|谷歌学术
27. H. Hermizi，O. Faizah，S.Ima-Nirwana，S.Ahmad Nazrun和M. Norazlina，“Tocotrienol和生育酚对尼古丁停止后Sprague-Dawley雄性大鼠骨组织性参数的”诺拉泽“的有益作用”钙化组织国际，卷。84，否。1，pp。65-74,2009。视图:出版商网站|谷歌学术
28. A. N. Shuid, Z. Mehat, N. Mohamed, N. Muhammad, and I. N. Soelaiman，“维生素E在正常雄性大鼠中表现出骨合成代谢作用，”骨质和矿物质新陈代谢杂志，卷。28，不。2，第149-156，2010。视图:出版商网站|谷歌学术
29. M. Norazlina，C.W。蔡氏和S. IMA-娜，“维生素E在雌性大鼠中缺乏降低腰椎骨的钙含量，”医学杂志马来西亚，第59卷，第59期5，第623-630，2004。视图:谷歌学术
30. E. Serbinova，V.Kagan，D. Han和L.Placker，“自由基回收和intremmermane流动性在α-生育酚和α-Tocotrienol的抗氧化性质”中，“自由基生物学与医学，第10卷，第5期。5，页263-275,1991。视图:出版商网站|谷歌学术
31. J.P.Kamat，H. D.Sarma，T.A.Avasagayam，K.Nesaretnam和Y. Basiron，来自棕榈油的Tocotrienols，作为蛋白质氧化和脂质过氧化在大鼠肝微粒体中的有效抑制剂，“分子与细胞生物化学，卷。170，没有。1-2，pp。131-137,1997。视图:出版商网站|谷歌学术
32. S. Maniam，N. Mohamed，A. N. Shuid，以及I. N. Soelaiman，“Palm Tocotrienol在骨中发挥了更好的抗氧化活性α.生育酚”,基本和临床药理学与毒理学，卷。103，没有。1，pp。55-60,2008。视图:出版商网站|谷歌学术
33. N. S. Ahmad, B. A. K. Khalid, D. A. Luke，和S. I. Nirwana，“生育三烯醇比生育酚对自由基诱导的大鼠骨骼损伤提供更好的保护，”临床和实验药理学和生理学，卷。32，不。9，第761-770，2005。视图:出版商网站|谷歌学术
34. H. Nakamura，F.Furukawa，A. Nishikawa等，“Tocotrienol在大鼠中的口腔毒性”，食品和化学毒理学，卷。39，没有。8，第799-805，2001。视图:出版商网站|谷歌学术
35. J. H. Lee，H. N.Kim，D. Yang等人，“Trolox通过抑制RANKL表达和信号来阻止骨酸溶发生，”生物化学杂志第284期20, pp. 13725-13734, 2009。视图:出版商网站|谷歌学术
36. H. Ha, J. H. Lee, H. N. Kim，和Z. H. Lee，”α.生育三烯酚抑制破骨细胞骨吸收抑制RANKL表达和信令和骨吸收活性，”生物化学与生物物理研究通讯，卷。406，没有。4，PP。546-551,2011。视图:出版商网站|谷歌学术

版权

版权所有©2012 Norliza Muhammad等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。