HMC05，草药配方，抑制TNF-α-人脐静脉内皮细胞诱导的炎症反应

摘要

血管炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病的进展有关。在本研究中，我们发现HMC05，一种从八种不同草药混合物中提取的提取物，剂量依赖性地抑制肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)诱导单核细胞与内皮细胞的粘附。HMC05的这种抑制作用与单核细胞趋化蛋白-1、CC趋化因子受体2、血管细胞粘附分子-1、细胞间粘附分子-1的抑制表达有关。此外，HMC05显著抑制活性氧(ROS)和核因子(NF)-的产生κ肿瘤坏死因子B激活-α．这些抑制作用的HMC05 (1-10μG 毫升^−1.)关于肿瘤坏死因子-α-诱导的炎症事件与小檗碱相似（1-10） μM） ，它是HMC05的主要成分，是已知具有血管舒张和降脂活性的草药化合物之一。然而，小檗碱以时间和浓度依赖性方式显著降低HUVEC的活性。相比之下，HMC05（1-10 μG 毫升^−1.)在48小时内不影响细胞活力 总之，我们认为HMC05可能是一种安全有效的抗血管炎症中药配方，其作用可能归因于抑制ROS-和NF-κ粘附分子和趋化因子的B依赖性表达。

1.导言

血管内皮在调节炎症反应中起着中心作用，其方式是吸引炎症细胞，激活凝血和补体系统，增加血管通透性[1.]促炎介质激活内皮细胞后，粘附分子水平增加，如血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、E-选择素和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）以及趋化因子，促进单核细胞与内皮细胞的粘附[2.,3.]这种内皮细胞激活是动脉粥样硬化和高血压等血管疾病病理生理学中最早和重要的过程之一[4.,5.].促炎细胞因子如肿瘤坏死因子的产生-α(肿瘤坏死因子-α)可被各种病理生理现象刺激，包括修饰的低密度脂蛋白（LDL）[6.,7.]血流动力学应激[8.,9]高血压[10]．

HMC05是八种草药混合物的水提取物，源自流行的传统草药Banhabackchulchunmatang，并经过改良[11]以前对每种草药成分的研究表明，通过促进抗炎介质的产生，对动脉粥样硬化和炎症具有保护作用[12,13和抑制过氧亚硝酸盐诱导的氧化损伤[14]在最近一项基于小檗碱和橙皮苷的标准化HMC05研究中，HMC05通过抑制促炎细胞因子的产生显示出抗动脉粥样硬化活性[15]然而，HMC05对内皮炎症反应的影响尚未得到明确证明。此外，我们之前已经证明，黄连是一种从中草药中分离出来的生物碱(黄连)，对内皮细胞具有细胞毒性作用，而含有小檗碱的草药配方Zoagumhwan对内皮细胞不具有细胞毒性[16]．HMC05含有小檗碱作为主要成分，其对内皮细胞的细胞毒性尚未得到明确证明。因此，在本研究中，我们研究了HMC05对TNF-的影响α与单用小檗碱的作用相比，单用小檗碱可诱导内皮细胞的炎症反应和活力。

2.方法

2．1．材料

人脐静脉内皮细胞系（HUVEC）和人单核细胞前体细胞系U937分别购自Clonetics（美国加利福尼亚州圣地亚哥）和American Type Culture Collection（美国弗吉尼亚州ATCC）（补充剂和生长因子）购自Cambrex（圣地亚哥）。胎牛血清（FBS）购自Hyclone（美国犹他州洛根），青霉素和链霉素购自Gibco BRL（美国马里兰州洛克维尔）。3-[4.，5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）、丙酮酸钠、小檗碱和2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯、乙酰酯（DCF-DA）均来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。抗核因子抗体-κB (p65)和lamin B购自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)。抗人ICAM-1和VCAM-1的小鼠单克隆抗体(mAbs)购自R&D Systems公司(Minneapolis, MN, USA)，兔ccr2多克隆抗体购自Abcam公司(Cambridge, UK)。

2.2.草药成分和水提取物（HMC05）的制备

所有用于HMC05的草药，半夏10.前布雷滕b。，白术科伊兹。，天麻布鲁姆,蜜柑马可。，茯苓狼山楂Bunge var。提皮卡施耐德，Siegesbeckia下毛竹Makio.和日本黄连Makino，从东方药店（韩国首尔Kyungdong herb market）购买。这些草药在东国大学东方医学院（韩国Gyongju）鉴定，优惠券样本保存在那里。这些草药的水分含量<10%（按重量计）。HMC05用500%的水提取 毫升蒸馏水回流3小时 h通过煮沸配方，用10 μm墨盒纸，并浓缩至约50 在50°C的真空条件下，使用旋转式蒸发器，冷冻干燥至干燥。在小檗碱和橙皮苷的基础上，在乙腈：0.1%甲酸梯度下，使用HPLC在25天内对其进行标准化 最小值：乙腈0–10%，0–10 闵；10–40%, 10–20 闵；40–90%, 20–25 闵[15]．HMC05中黄连素和橙皮苷的含量分别为1.93±0.11%和1.02±0.11%。

2.3。细胞培养

人脐静脉内皮细胞在0.2%明胶涂层烧瓶上生长，EBM-2培养基中添加2%FBS、抗坏血酸、氢化可的松、人成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、人表皮生长因子、长R胰岛素样生长因子-1、硫酸庆大霉素（GA-1000）和肝素。实验中使用第2代和第6代之间的人脐静脉内皮细胞。

U937细胞保存在补充有10%FBS的RPMI 1640培养基中，1 mM丙酮酸钠，100 国际单位 毫升^−1.青霉素和100 μG 毫升^−1.细胞融合后，按1:5的比例进行传代培养。

2.4.细胞活力的测量

采用MTT染色法检测细胞活力，将4-5天培养的细胞接种于密度为1×10的96孔培养板中^4.细胞良好^−1..油井中的介质体积为100 μl、 在对照实验中，细胞在含有无药物载体的相同培养基中生长。细胞与药物一起培养48小时 h、 然后是10 μMTT (5 g l .^−1.)四 h、 向每种培养物中添加200微升二甲基亚砜，并通过移液管混合以溶解还原的MTT晶体。通过在540 nm处测量微孔板读取器（分子器件，Versa MAX Sunnyvale，CA，USA）中的光密度来测定相对细胞活力。

2.5.U937细胞荧光标记和细胞粘附试验

用U937人单核细胞前体细胞研究白细胞与内皮细胞的相互作用[17]这些细胞表达CCR2，一种MCP-1受体[18]用2′，7′标记U937细胞-比斯（2-羧乙基）-5（6）-羧荧光素乙氧基甲酯（BCECF/AM，10 μG 毫升^−1.)一 37°C下培养h。在24孔培养板中培养的HUVEC用HMC05水提取物或小檗碱预处理30小时 min，然后与TNF孵育-α额外的3小时。然后，HUVECs与BCECF/ am预标记的U937细胞(1 × 10)共孵育^6.细胞良好^−1.)在37°C下放置30分钟。去除未粘附的U937细胞，PBS冲洗2次。取细胞组，连接数码相机(TMS;在其他条件下，细胞在0.1 mol l的0.1% Triton X-100中裂解^−1.三。荧光测量采用荧光星optima微板阅读器(BMG LABTECH GmbH, Germany)，激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。

2.6.定量实时逆转录聚合酶链反应

根据制造商的说明，收集细胞并使用RNeasy试剂盒（德国希尔登Qiagen）用旋转柱提取总RNA。使用逆转录试剂盒（Qiagen）反转录分离的mRNA。通过定量实时PCR系统分析基因表达水平（Rotor Gene 6000；Corbett，悉尼，澳大利亚）。使用SYBR绿色PCR试剂盒（Qiagen）进行实时PCRMCP-1、CCR2、VCAM-1和ICAM-1的引物序列如下：MCP-1，顺义5′-TCGCGAGTAGAAGAATC-3′和反义5′-AATCGCTGATCACTCT-3′；CCR2，顺义5′-CTGGTGCATCTTTGGTTT-3′和反义5′-CCCACAATAGAGAGATA-3′；VCAM-1，顺义5′-GGGAGCCTGTCACTGTCACTAGTAAG-3′和反义5′-ATCCCCGCAGATCAAAACT 3′；TCCM-1′，正反义5′-CCTTCCTCCCGTACTGG-3′和反义5′-AGCGTAGGAAGGTTCTTGC-3′。反应混合物由2 μcDNA模板l，10 μ1份SYBR绿色PCR主混合物和5份 总体积为20的底漆的pmol μl.将cDNA在95℃变性15 min，然后进行40个PCR循环(95℃5 s, 55℃10 s, 72℃20 s)。所有基因的mRNA水平以甘草醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH (Qiagen)为内参。

2.7.ICAM-1和VCAM-1表达的免疫细胞化学分析

用免疫细胞化学方法检测粘附分子ICAM-1和VCAM-1的细胞定位。人脐静脉内皮细胞在无菌八腔玻片（Nalge Nunc International，Naperville，IL，USA）中单独培养或含有HMC05或载体的培养基中培养1小时 h在附加3之前 h肿瘤坏死因子的治疗-αng(10毫升^−1.).然后用冰冷的甲醇将电池固定5分钟 闵−空气干燥10分钟后，温度为20℃ 用3%牛血清白蛋白（BSA）封闭载玻片1分钟 h，并与ICAM-1或VCAM-1单克隆抗体（1:20稀释200 G 毫升^−1.在4°C的加湿器中过夜。用TBS- t (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% Tween 20)洗涤3次5 min，然后用Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG(1:20 0)在含3% BSA的TBS中室温孵育1 h。用TBS-T洗涤30分钟后，用600 nM 4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色2分钟。经过几次简短的清洗，细胞被安装与延长金抗褪色试剂和覆盖一个盖页。最后，使用尼康显微镜(TE-2000U)和适当的激发/发射过滤器对观察细胞。

2.8.细胞内活性氧的测量

使用荧光染料2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA；Sigma）测定细胞内活性氧（ROS）的产生。将融合细胞进行血清饥饿（0.5%FBS）24小时 然后用于实验。饥饿的细胞在TNF存在下用HMC05或小檗碱处理-αng(10毫升^−1.)一 h、 细胞负载DCF-DA（5 μM） 五 在37°C温度下，最小温度，然后通过倒置荧光显微镜（TE2000-U；尼康，日本）成像，并使用图像分析系统（ImageInside Ver 2.32）进行分析。

2.9.蛋白质提取和蛋白质印迹分析

细胞与TNF一起孵育-α无论HMC05是否存在。用于检测NF-κB在HUVECs中，按照制造商说明使用NE-PER试剂盒进行核蛋白提取(Pierce, Rockford, IL, USA)。在CCR2检测中，使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液(Sigma)从U937细胞中提取总蛋白。用BCA蛋白测定试剂(Pierce)测定蛋白含量。等量的蛋白质(20μg核或70 μg总蛋白）在10%SDS–PAGE上分离并转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂牛奶在TBS-T中封闭膜2小时 h、 并在含有1%脱脂乳的TBS中，在4°C下与特异性抗体孵育过夜。用TBS-T洗涤三次后，将膜与脱脂乳TBS中的辣根过氧化物酶结合二级抗体杂交1小时 h在室温下。使用ECL试剂盒观察免疫反应蛋白。

2.10。核因子-κB报告基因双荧光素酶分析

核因子-κ用NF研究B的反式激活-κ荧光素酶报告基因构建（萤火虫荧光素酶）与0.05 μ根据制造商的说明，使用lipofectamine转染试剂（美国加利福尼亚州Invitrogen）制备g/ml pRL-TK（作为转染对照的renilla荧光素酶）。HUVECs（1×10^5.细胞良好^−1.)与转染混合物在37℃下孵育5天 h、 与相同体积的生长培养基混合，并在37°C的培养箱中过夜。然后在10%的浓度下用HMC05或BER处理这些细胞 ng 毫升^−1.肿瘤坏死因子-α．3 h后，用PBS洗涤细胞，反复冻融裂解。然后轻轻刮取细胞，裂解液10 000 rpm离心5分钟。使用双荧光素酶报告基因试剂盒(Promega Corporation, Madison, WI, USA)在Turner TD20/20发光仪(Turner Biosystems, CA, USA)上测定萤火虫和肾细胞荧光素酶活性。

2.11.统计分析

数据以三个以上独立实验的平均值±平均标准误差（SEM）表示，并使用单向方差分析（ANOVA）和学生纽曼-基尔检验进行个体比较。P小于0.05的值被认为具有统计学意义。

3.后果

3.1.HMC05抑制oxLDL和TNF诱导的单核细胞与内皮细胞的粘附-α

我们首先通过测量炎症白细胞与内皮细胞的粘附，检测HMC05对氧化低密度脂蛋白（oxLDL）诱导的血管炎症的影响，这是炎症过程中的一个关键步骤1（a）HMC05可抑制oxLDL诱导的白细胞与HUVEC的粘附。因为在包括动脉粥样硬化在内的多种血管疾病中，TNF-α病变部位的水平升高，并促进血管炎症过程[19,20.]之后，我们检测了HMC05对TNF的影响-α治疗内皮反应。用TNF-刺激HUVECsαng(10毫升^−1.)处理3 h后，与未处理(对照)细胞相比，白细胞与内皮细胞的黏附明显增加(图)1（b）和1（c）).肿瘤坏死因子-α-HMC05（1和10）显著抑制诱导的粘附 μG 毫升^−1.)的浓度依赖性。HMC05 (1-10μG 毫升^−1.)关于肿瘤坏死因子-α-单核细胞对HUVECs的诱导粘附与小檗碱相似（1-10） μM)， HMC05的主要成分，或辛伐他汀(5μM） ，一种降低血脂和心血管风险的药物。

3.2.HMC05对TNF的抑制作用-α-诱导趋化因子，MCP-1和粘附分子，VCAM-1和ICAM-1在HUVECs中的表达

内皮细胞上趋化因子和细胞粘附分子表达的增加促进了白细胞的粘附，这被认为是在各种疾病中观察到的炎症反应的分子基础[20.–22]实时逆转录聚合酶链反应（RT–PCR）检测HMC05对MCP-1 mRNA表达的影响，MCP-1是引发血管炎症过程的关键因素之一，粘附分子VCAM-1和ICAM-1。TNF治疗HUVEC-α增加MCP-1(图2（a）)和VCAM-1（图2（b）) mRNA水平与时间相关。HMC05浓度依赖性地抑制TNF-α-诱导的MCP-1 mRNA表达(图2（c）)，VCAM-1（图2（d）)和ICAM-1（图1）2（e）)同样，小檗碱治疗也抑制TNF-α-诱导MCP-1、VCAM-1和ICAM-1mRNA表达。HMC05降低VCAM-1表达的程度（10 μG 毫升^−1.)与小檗碱的作用相似（10 μ而HMC05对MCP-1和ICAM-1表达的抑制作用强于黄连素。为了进一步评估HMC05对粘附分子蛋白表达的影响，我们进行了免疫细胞化学。如图所示3（a）和3（b）在TNF中，VCAM-1和ICAM-1蛋白表达水平较高-α-刺激HUVEC，HMC05和小檗碱处理抑制HUVEC。

3.3.肿瘤坏死因子中CCR2的表达-α-HMC05可抑制经处理的人单核细胞U937细胞

因为MCP-1只与CCR2结合[23]CCR2的表达在单核细胞募集和许多血管炎症状态中起着重要作用，TNF可增加CCR2 mRNA的表达-α在U937细胞中作用3 h，但与HMC05共同作用可显著抑制这种作用(10μG 毫升^−1.)（图4（a））.小檗碱(10μM） 关于肿瘤坏死因子-α-诱导的CCR2表达与HMC05相似。同样，我们也注意到肿瘤坏死因子增加了U937细胞中CCR2的蛋白表达-α在western blot分析中，在HMC05处理后，该蛋白以浓度依赖的方式显著下调(图4（b））.

3.4.香叶基香叶基焦磷酸逆转HMC05对TNF的抑制活性-α-诱导活性氧增加

因为TNF-α增加ROS的产生，这是血管炎症的主要原因，我们检测了HMC05对TNF的影响-α-诱导的ROS增加，通过使用微荧光法测量DCF荧光。用HMC05和TNF-联合处理细胞α显著抑制肿瘤坏死因子-α-诱导活性氧产生（图5.)同样，用小檗碱治疗也能抑制TNF-α-诱导ROS增加。众所周知，TNF-α通过香叶酰香叶酰焦磷酸盐(GGPP)对Rac1的前酰化，内皮细胞中ROS的增加与NADPH氧化酶的激活有关[24–26].评估NADPH氧化酶通过Rac prenylation参与TNF-α-通过诱导ROS产生，我们检测了外源性应用GGPP的效果。外源性应用GGPP与HMC05联合预处理完全逆转了HMC05对TNF的抑制作用-α-诱导的ROS生成(图5.）.

3.5.抑制NF-κ肿瘤坏死因子处理的人脐静脉内皮细胞中HMC05的B转录活性-α

核因子-κB是包括细胞粘附分子在内的多种促炎症基因的氧化还原敏感转录因子[22].TNF-α-诱导核因子-κB p65累积（图6（a）HMC05和小檗碱显著抑制(图6 (b)）.此外，在转染NF-的细胞中κB-Luc质粒（图6 (c))，肿瘤坏死因子-α-刺激性NF增加-κHMC05以浓度依赖的方式抑制B转录活性 μG 毫升^−1.)与小檗碱相似（10 μ米)。

3.6.HMC05和小檗碱对HUVEC活力的差异效应

为了检测HMC05处理的细胞是否影响内皮细胞的活力，在不同的时间和浓度范围内用HMC05或小檗碱处理HUVEC。如图所示7.HMC05处理对HUVECs的存活率没有不良影响（>95%细胞存活率）。相反，小檗碱以时间和浓度依赖性方式显著降低HUVECs的存活率。

4.讨论

促炎性细胞因子被认为是血管炎症发展的中心角色，血管炎症导致心血管并发症的发展[27,28].TNF-α，一种在动脉粥样硬化病变中常见的细胞因子，诱导细胞粘附分子，促进炎症过程[20.]此外，细胞因子激活的内皮细胞分泌单核细胞特异性趋化分子，在血管损伤和炎症部位募集单核细胞[29]．

本研究清楚地表明HMC05显著抑制oxLDL和TNF-α诱导单核细胞粘附内皮细胞，并降低MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表达。此外，HMC05还能阻断TNF-α-MCP-1受体CCR2在单核细胞中的表达增加。由于MCP-1/CCR2结合是单核细胞募集的主要调节因子，似乎在许多血管炎症状态中起主要作用，我们的结果表明HMC05是一种有效的血管炎症配方，通过抑制内皮细胞化学物质的表达激酶和单核细胞趋化因子受体。

氧化应激是血管炎症反应和动脉粥样硬化发病机制中的一个特征[30.]主要炎症反应期间内皮细胞表面粘附分子的表达依赖于ROS敏感的核转录因子NF-κB和AP-1激活[2.,31–33]我们的结果显示HMC05抑制TNF-α-诱导活性氧和核因子-κB易位表明HMC05对TNF有抑制作用-α-诱导单核细胞与内皮细胞的粘附可能是通过抑制ROS和随后的NF-介导的κB激活。

最重要的是，我们的结果清楚地显示了HMC05和小檗碱（HMC05的主要成分）之间的差异。HMC05对单核细胞-内皮细胞粘附的抑制作用与小檗碱相似，而HMC05与小檗碱相比不影响细胞活力。虽然小檗碱具有降脂、舒张血管的作用，并且可以改善心血管疾病，如高血压和动脉粥样硬化[34–36]最近的研究表明，小檗碱对内皮细胞具有促血栓形成作用，表明小檗碱作为单一疗法的治疗应用受到限制[37]此外，小檗碱的细胞毒性是最重要和最常用的生物活性[38]与之前的报道类似，在本研究中，小檗碱在HUVEC中显示出显著的细胞毒性。然而，HMC05对HUVEC没有显示任何细胞毒性作用，这表明含有HMC05的小檗碱在治疗血管炎症方面可能比单用小檗碱更安全。尽管我们尚未确定其用量和作用就确切成分而言，HMC05含有高水平的酚类化合物，具有广泛的生物活性，包括抗氧化作用。最近，通过同时测定法筛选并鉴定HMC05的主要成分为一种黄酮类化合物、橙皮苷和三种生物碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱[39]例如，据报道，橙皮苷是HMC05的主要成分之一，具有多种生物学效应，包括抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化和辐射防护作用[40,41]根据这些报告，HMC05的细胞毒性比单独使用小檗碱降低可能是由于类黄酮橙皮苷对小檗碱的细胞毒性性质的补偿作用。

总之，我们的结果表明HMC05可能通过抑制ROS的产生和调节NF的表达来保护血管炎症-κ内皮细胞中的B相关粘附分子（图8.）.

基金

韩国卫生福利部韩国健康21研发项目（批准号B080031）和商业、工业和能源部区域技术创新计划（批准号RTI04-01-04）。

工具书类

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