人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人类premonocytic细胞系U937买来Clonetics(美国圣地亚哥,CA),美国类型文化集合(美国弗吉尼亚州写明ATCC),分别。内皮生长介质(临时)2颗子弹工具包包含一个内皮细胞基底介质(实证)2和EGM-2 SingleQuots(补充和生长因子)从Cambrex购买(圣地亚哥)。胎牛血清(的边后卫)获得Hyclone(美国UT Logan)和青霉素和链霉素Gibco BRL(罗克维尔市,医学博士,美国)。3 - ( 45-dimethylthiazol-2-yl] 2 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT),丙酮酸钠,小檗碱,和2′,7′-dichlorodihydrofluorescein二乙酸,乙酰酯(DCF-DA)来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。抗体NF - κ(p65)和核纤层蛋白B是购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。鼠单克隆抗体(mab)对人类ICAM-1和VCAM-1购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国),和兔多克隆anti-CCR2是从Abcam(英国剑桥)。

所有的草药用于HMC05, Pinelliae三个的十。Breitenb交货。 白术macrocephalaKoidz。 天麻布鲁姆, 柑橘unshiuMarcow。 茯苓狼, 山楂Bunge var。 迪比卡c·k·施耐德 Siegesbeckia下毛竹Makio。和 Coptidis粳稻牧野,从东方药店购买(Kyungdong草药市场、首尔、韩国)。草药被确定在东方医学院,东国大学(Gyoungju、韩国),代金券标本保存的地方。草本植物的含水量< 10%的体重。HMC05与500毫升蒸馏水提取沸腾回流3 h的公式,过滤和10 μ米厚纸和集中50毫升左右旋转蒸发器在50°C下真空冷冻干燥。这是标准化的基础上黄连素和橙皮甙,用高效液相色谱法在乙腈:0.1%甲酸梯度在一段25分钟:乙腈0 - 10%,清廉最小;10 - 40%,10 - 20分钟;40 - 90%,20 - 25分钟 15]。小檗碱的含量和橙皮甙HMC05为1.93±0.11%和1.02±0.11%,分别。

HUVECs增长在0.2% gelatin-coated瓶EBM-2中补充2%的边后卫,抗坏血酸,氢化可的松,人类成纤维细胞生长因子,血管内皮生长因子,人类表皮生长因子,长R胰岛素样生长因子- 1,硫酸庆大霉素(ga - 1000)和肝素。HUVECs通道2和6之间用于实验。

U937细胞保持RPMI 1640中补充10%的边后卫,丙酮酸钠1毫米,100 IU毫升⁻¹青霉素和100 μ克毫升⁻¹链霉素。实现融合后,细胞被分裂亚文化1:5比例。

细胞生存能力评估使用MTT染色法。从4 -细胞5-day-old文化被播种在96 -孔板的密度1×10⁴细胞也⁻¹。介质的体积在井是100年 μl。在控制实验,细胞生长在同一媒体包含无毒。药物的细胞培养48 h,然后10 μl MTT (5 g l⁻¹)为4 h。二百毫升的二甲亚砜被移液添加到每个文化和混合溶解减少肝癌和晶体。相对细胞生存能力是决定通过测量光密度标(分子器件、Versa马克斯桑尼维尔,美国)在540海里。

人类premonocytic U937细胞被用来调查leukocyte-endothelial细胞相互作用[ 17),这些细胞表达CCR2, MCP-1受体( 18]。U937细胞被标记为2′,7′- 国际清算银行(2-carboxyethyl) 5 (6) -carboxyfluorescein acethoxymethyl酯(BCECF /点,10 μ克毫升⁻¹)1 h 37°C。HUVECs培养在24-well板使用HMC05水提取物或黄连素与TNF - 30分钟,然后孵化 α一个额外的3 h。然后,HUVECs co-incubated BCECF / AM-prelabeled U937细胞(1×10⁶细胞也⁻¹在37°C) 30分钟。Non-adhering U937细胞中,细胞与PBS洗两次。一组细胞被倒置显微镜和成像与数码相机(经颅磁刺激;尼康、日本)和在其他组,细胞细胞溶解在0.1% Triton x - 100 0.1摩尔l⁻¹三。荧光测量使用Fluostar最适条件标(BMG LABTECH GmbH德国)使用激励在485 nm和发射在520 nm)。

收集细胞总RNA提取旋转列使用RNeasy工具包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。孤立的信使rna是反向转录利用逆转录工具包(试剂盒)。基因表达水平进行了分析,定量实时PCR系统(Rotor-Gene 6000;澳大利亚悉尼,Corbett)。实时PCR进行使用SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒)。的引物序列MCP-1、CCR2 VCAM-1 ICAM-1如下:MCP-1,感觉5′-TCGCGAGCTATAGAAGAATC-3′和反义5′-AATCCTGAACCCACTTCT-3′;CCR2,感觉5′-CTGGTGTTCATCTTTGGTTT-3′和反义5′-CCCACAATGGGAGAGTAATA-3′;VCAM-1,感觉5′-GGGAGCTCTGTCACTGTAAG-3′和反义5′-ATCCGTATCCTCCAAAAACT-3′;ICAM-1,感觉5′-CCTTCCTCACCGTGTACTGG-3′和反义5′-AGCGTAGGGTAAGGTTCTTGC-3′。反应混合物由2 μl (cDNA模板,10 μl SYBR绿色的引物PCR反应混合液和5 pmol总量的20倍 μl。互补脱氧核糖核酸变性在95°C的15分钟紧随其后40周期的PCR (95°C 5 s, 55°C 10年代,20年代72°C)。所有基因的mRNA水平正常化使用glyseraldehyde-3-phosphate脱氢酶GAPDH(试剂盒)作为内部控制。

粘附分子的细胞定位,ICAM-1 VCAM-1,采用免疫检测的方法。HUVECs在无菌培养eight-well有房间的幻灯片(Nalge Nunc国际内伯威尔市,,美国)与介质单独或介质包含HMC05或车辆1 h额外3 h治疗前肿瘤坏死因子- αng(10毫升⁻¹)。细胞被固定在冰冷的甲醇在−5分钟20°C。风干后10分钟,幻灯片被封锁3%牛血清白蛋白(BSA)为1 h和孵化与ICAM-1或VCAM-1单克隆抗体(1:200稀释的 μ 克毫升⁻¹一夜之间解决方案)在4°C调湿室。的细胞被洗了三次TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH值7.5,500毫米氯化钠,0.1%渐变20)5分钟,然后用Alexa萤石孵化488驴anti-mouse免疫球蛋白g(1: 200)在TBS 3% BSA在室温下1 h。在TBS-T洗了30分钟后,细胞被沾染了600 nM 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 2分钟。经过几个简短的泥沙,这些细胞被安装和延长黄金不变色试剂和盖玻片覆盖。最后,使用尼康显微镜观察细胞(te - 2000 u)以适当的激发/发射滤波器对。

细胞内活性氧(ROS)生成测量使用2′,7′二氯荧光素二乙酸(DCF-DA;σ),荧光染料。融合性的细胞受到血清饥饿(0.5%的边后卫)24 h,然后用于实验。饥饿的细胞治疗HMC05或在TNF -小檗碱 αng(10毫升⁻¹)1 h。这些细胞被装满DCF-DA (5 μ米)为5分钟37°C,然后,通过倒置荧光显微镜成像(TE2000-U;尼康,日本),并分析了图像分析系统(ImageInside版本2.32)。

细胞与肿瘤坏死因子-孵化 α在HMC05的存在与否。检测的NF - κB在HUVECs,核蛋白质提取是由使用一个NE-PER装备按照制造商的指示(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。在CCR2检测的情况下,从U937细胞总蛋白提取使用含有蛋白酶抑制剂的缓冲区里帕鸡尾酒(σ)。蛋白质含量测定用BCA蛋白质测定试剂(皮尔斯)。相等数量的蛋白质(20 μg核或70 μg总蛋白质)10% sds - page分离和转移到硝化纤维膜。5%脱脂牛奶的膜被封锁TBS-T 2 h,并孵化与特定的抗体在TBS含有1%脱脂牛奶在一夜之间在4°C。与TBS-T洗涤三次后,膜的杂化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体skim-milk-TBS 1 h在室温下。免疫反应性的蛋白质是可视化使用ECL工具包。

NF - κ利用NF - B transactivation研究 κ荧光素酶B记者构造(萤火虫荧光素酶)与0.05 μpRL-TK g / ml (renilla荧光素酶作为转染控制)使用lipofectamine转染试剂(美国CA英杰公司)根据制造商的指示。HUVECs (1×10⁵细胞也⁻¹)孵化与转染混合物在37°C 5 h,与同样体积的生长介质混合,并保持在一个孵化器在一夜之间37°C。这些细胞被对待HMC05 ng或误码率在10毫升⁻¹肿瘤坏死因子- α。3 h后,细胞用PBS洗净,然后反复冻融的细胞溶解。细胞被轻轻刮和溶菌产物离心10 000 rpm为5分钟。renilla和萤火虫荧光素酶活动测量使用Dual-Luciferase记者分析工具包(美国WI Promega公司(麦迪逊)在特纳TD20/20光度计(特纳生物系统、钙、美国)。

数据表示为均值的平均值±标准误差(SEM)超过三个独立的实验,分析了使用单向方差分析(方差分析)和Student-Newman-Keul个人的测试比较。 P值< 0。被认为是具有统计学意义。

我们首先检查HMC05在氧化低密度脂蛋白的影响(oxLDL)全身的血管炎症通过测量炎症白细胞与内皮细胞的粘附,炎症过程的一个至关重要的一步。如图 1(一),HMC05抑制oxLDL-induced HUVECs白细胞的粘附。因为在各种血管疾病包括动脉粥样硬化、TNF - α水平增加的病变部位,导致血管炎症过程 19, 20.),然后检查HMC05 TNF -的影响 α治疗内皮反应。与肿瘤坏死因子- HUVECs刺激 αng(10毫升⁻¹)对3 h显著增加白细胞与内皮细胞的粘附与未经处理的(控制)细胞(数字 1 (b)和 1 (c))。肿瘤坏死因子- α全身的附着力显著地抑制了HMC05(1和10 μ克毫升⁻¹)浓度的方式。的抑制活动HMC05 (1 - 10 μ克毫升⁻¹)对肿瘤坏死因子- αHUVECs全身单核细胞的粘附是类似于小檗碱(1 - 10 μHMC05 M),一个主要组成部分,或辛伐他汀(5 μ米),降血脂药和心血管风险降低药物。

趋化因子和细胞粘附分子的表达增加内皮细胞促进白细胞的粘附,这被认为是炎症反应的分子基础在各种疾病( 20.- - - - - - 22]。实时逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)进行检查的影响HMC05 MCP-1 mRNA表达,启动的关键因素之一在血管炎症,炎症过程和粘附分子,VCAM-1 ICAM-1。治疗与肿瘤坏死因子- HUVECs α增加MCP-1(图 2(一个))和VCAM-1(图 2 (b)时间的方式)mRNA水平。治疗HMC05 concentration-dependently抑制TNF - α全身的mRNA的表达MCP-1(图 2 (c)),VCAM-1(图 2 (d))和ICAM-1(图 2 (e))。同样,也抑制TNF -小檗碱治疗 α全身MCP-1, VCAM-1 ICAM-1 mRNA表达。减少的程度由HMC05 VCAM-1表达式(10 μ克毫升⁻¹)是类似于(10小檗碱的影响 μ米),而抑制HMC05 MCP-1和ICAM-1表达的是小檗碱比的。进一步评估HMC05对粘附分子的蛋白质表达的影响,进行了免疫细胞化学。如数据所示 3(一个)和 3 (b),VCAM-1 ICAM-1 TNF -蛋白表达水平高 α刺激HUVECs,抑制HMC05和小檗碱治疗。

因为MCP-1绑定只CCR2 ( 23],CCR2的表达起着重要的作用在单核细胞招聘和许多炎症状态的血管。CCR2 mRNA表达与肿瘤坏死因子-增加了治疗 α3 h U937细胞,但这种效应是显著地抑制通过co-treatment HMC05 (10 μ克毫升⁻¹)(图 4(一))。小檗碱(10的效果 μ肿瘤坏死因子- M) α全身CCR2表达式是HMC05相似。同样的,我们也指出CCR2在U937细胞的蛋白表达增加了TNF - α免疫印迹分析,在HMC05治疗,显著下调浓度的方式(图 4 (b))。

自TNF - αROS增加生产的一个主要原因是血管炎症,我们检查了HMC05 TNF -的影响 α全身的ROS增加测量使用microfluorometry DCF荧光。Co-treatment细胞HMC05和TNF - α显著抑制肿瘤坏死因子- α全身的ROS生产(图 5)。同样,治疗也小檗碱抑制TNF - α全身的ROS增加。众所周知,肿瘤坏死因子- α全身的ROS增加内皮细胞与活化的NADPH氧化酶的Rac1 prenylation geranylgeranyl焦磷酸(GGPP) [ 24- - - - - - 26]。评估的参与NADPH氧化酶在Rac prenylation TNF - α全身的活性氧产量,我们检查了外生GGPP应用的影响。体内应用的预处理GGPP结合HMC05完全逆转的抑制性影响HMC05 TNF - α全身的ROS生成(图 5)。

NF - κB是一个著名的redox-sensitive各种促炎基因的转录因子包括细胞粘附分子( 22]。肿瘤坏死因子- α全身核NF - κB p65积累(图 6(一))被HMC05和小檗碱(图明显抑制 6 (b))。此外,细胞转染和NF - κB-Luc质粒(图 6 (c))、肿瘤坏死因子- αNF -刺激增长 κB浓度的方式被HMC05抑制转录活动。HMC05效应(1 μ克毫升⁻¹)是类似于小檗碱(10 μ米)。

检查是否治疗的细胞HMC05影响内皮细胞的生存能力,HUVECs HMC05处理或小檗碱在不同的时间-浓度标准。如图 7HMC05治疗没有任何负面影响的可行性HUVECs细胞生存能力(> 95%)。相比之下,小檗碱显著降低HUVECs在时间和浓度的可行性。