一种含丹参、三七、冰片合成的中药制剂，减少循环粘附分子

摘要

循环粘附分子(Circulating adhesion molecules, CAMs)是表达于血管内皮的表面蛋白，已成为心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的危险因素。CAMs参与细胞间通讯，被认为在动脉粥样硬化中发挥作用。中药“丹东丸”(DP)(又称“补心丸”)由丹参、三七和冰片三种中草药组成，在中国用于预防和管理心血管疾病。此前的实验室和动物研究表明，该制剂可以减少动脉粥样硬化发生和粘附分子表达。一项平行双盲随机安慰剂对照研究评估DP对轻度-中度高胆固醇血症患者三种CAM(细胞间细胞粘附分子-1 (ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1和内皮细胞选择素(e-选择素))的影响。次要终点包括生化和血液学变量和临床效果。40名参与者被随机分为治疗组和对照组，为期12周。DP治疗与ICAM-1下降有统计学意义(9%下降，P= .03）和e-Selectin（15％减少，P= 04)。在肾功能试验、肝功能试验、葡萄糖、脂质或c反应蛋白水平没有显著变化，临床不良反应在活动组和对照组之间没有差异。在接受安慰剂的参与者中没有相关的变化。这些结果表明，这种草药可能有助于发展一种新的方法，以降低心血管风险。

1.介绍

循环粘附分子(CAMs)是由血管内皮表达的蛋白，参与细胞间通讯，被认为在动脉粥样硬化过程的开始中发挥作用。CAMs有几个家族，包括整合素、钙粘蛋白、选择素和免疫球蛋白超家族成员[1］．在动脉粥样硬化中最重要的粘附分子是细胞间细胞粘附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、内皮细胞选择素(endothelial cell selectin, E-selectin)和血管细胞粘附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)。ICAM-1水平的升高被发现预示着心血管事件风险的增加[2，3.]，包括健康个体[4］．p -选择素和e -选择素水平已被发现可以预测健康女性的心血管疾病风险[5]，而在稳定的冠状动脉疾病患者中，e -选择素的血浆水平似乎反映了系统性动脉粥样硬化的严重程度[6］．VCAM-1可能是晚期动脉粥样硬化更特异的标志物，因为它通常在动脉粥样硬化斑块中表达[7]更高的水平与现有CVD的人类冠状动脉事件的风险增加有关[2］．有一些证据表明，降低粘附分子循环水平的措施也能降低心血管风险[8，9］．

在西方社会，草药和草药疗法的使用是广泛和日益增加的，特别是在疾病预防和慢性病管理方面。丹参和三七是中国传统医学中常用的预防或治疗心脏和血管疾病的中药材。天津天士力制药有限公司将这两种草药和第三种药物冰片混合在一起生产，命名为“丹通丸”(DP)(也称为“心脏强直丸”)，在中国、澳大利亚和美国政府机构认证的“GMP”和“GLP”条件下。该产品已在中国销售8年，主要用于预防和治疗心血管疾病[10］．实验室研究表明，该产品显示了心血管系统的一系列活动，包括减少静脉血栓形成[11]血液粘度[12］．

我们之前的研究表明，在培养的人血管内皮细胞中，DP能显著降低肿瘤坏死因子α在培养的人血管平滑肌细胞中，粘附分子ICAM-1和VCAM-1以剂量依赖的方式表达，并抑制血小板来源的生长因子bb诱导的DNA合成和细胞增殖[13，14］．此外,我们发现,在一个小鼠模型atherosclerosis-apolipoprotein E缺乏老鼠的硬化的diet-administration DP防止增加VCAM-1表达和抑制脂肪条纹的发展和胸主动脉粥样硬化斑块的不改变流通的脂质水平的(15］．

这里报道的研究旨在研究DP对人类受试者中粘附分子表达的影响，以获得温和至中度高胆固醇血症，并获得西方人群中该产品的耐受性和安全性的数据。

2.方法

2．1.研究设计与参与者

该研究采用了一个平行双盲，随机的安慰剂控制设计。随机分配40个含有轻度至中等升高的胆固醇的受试者，以接收DP或匹配的安慰剂12周。该研究是对中药草药对心血管风险影响的更大调查的一部分，其它方面将在其他地方报告。该研究按照世界医学协会的赫尔辛基（2000）宣言进行。

研究对象为18岁及以上健康人群，血浆总胆固醇5.0 mmol/l及以上，甘油三酯水平为2 mmol/l或HDL水平1.0更易/ l。排除标准包括血浆甘油三酯水平超过10 mmol/l、已确诊的心脏病、其他严重的医疗或心理疾病、怀孕、目前使用的血管活性药物、华法林和绝经后激素治疗。研究人员要求服用omega-3鱼油补充剂的参与者至少在进入研究前3周停止服用这些补充剂。参与者是通过澳大利亚墨尔本阿尔弗雷德医院的报纸广告和海报招募的。阿尔弗莱德医院伦理委员会和莫纳什大学获得了伦理批准，所有参与者均表示完全同意。

在基线评估(来访1)后，参与者被随机分为胶囊型DP或安慰剂组，每天3次，每次3粒，持续12周，之后再次进行评估(来访2)。参与者被要求在研究期间保持他们目前的饮食和运动方案。他们每三周就会通过电话联系他们，以确定副作用并鼓励他们遵守，这是通过检查未使用的退回包来评估的。在研究的第一周和最后一周，他们还被要求完成一份为期4天的饮食日记和锻炼问卷。

2.2。结果变量

主要结果变量为ICAM-1、VCAM-1和e -选择素的循环水平。次要结果包括血清尿素、电解质、肌酐、葡萄糖、肝功能、血脂、全血检查和高敏c反应蛋白。

2．3.中国的草药混合物

DP是由天津天士力制药有限公司生产的草药产品，由丹参、三七和冰片合成三种中药混合而成。该制剂和单个草药已被澳大利亚治疗用品管理局批准在澳大利亚使用，并广泛可用。

天津天士力制药公司在中国进行的动物毒性研究表明，在长达6个月的研究中，DP对小鼠没有毒性作用。采用小鼠单胃管法测定DP提取物的致死剂量(LD50)，并采用中国政府推荐的“Bliss法”计算LD50新药(中药)临床前研究指南［16］．LD50为25.807 g/kg，相当于临床人体口服剂量6.56 mg/kg的3934倍。

２.４.实验室技术

采用荧光激活细胞分选法(FACS)检测循环白细胞中ICAM-1、VCAM-1和e-选择素的表达。分离血浆后收集全血细胞，置于裂解缓冲液(BD Pharm Lyse (Cat。No. 555899)， BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA)C并在PBS中洗涤以除去红细胞，并将白细胞重新悬浮在0.5ml Hanks的平衡盐溶液（HBSS）中。将细胞与针对ICAM-1，VCAM-1或E-SELETIN（BD Biosciences，San Diego，Ca，USA，USA）的特异性荧光连接的抗体一起孵育1小时，然后在0.5mL HBS中洗涤以除去残余物使用FACS扫描流动含细胞仪和CellQuest软件（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA）进行抗体分析。

使用已建立的技术在阿尔弗雷德医院的病理系中进行其他血清标记的测定。这些包括总血清胆固醇，甘油三酯，HDL-胆固醇和C-反应蛋白（首次3个月的Roche方法，然后是Abbott方法，用于剩余的研究，交叉校准值的值），LDL胆固醇（Abbott，伊利诺伊州，美国），同型半胱氨酸（雅培AXSYM），纤维蛋白原（诊断型Astago Star上的von Claus方法），Von Willebrand因子（ELISA手动方法）。

2.5。统计分析

该研究旨在能够识别总血清胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的10%变化，1型误差为0.05，乘数为0.8。对所有确定的结果变量进行组内分析。数据是正常的，配对的学生t以及使用。如果数据的正态性检验被违反，则使用Wilcoxon符号秩检验。一个双边P- 0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

共40例受试者完成研究方案，每组20例。表中列出了各组参与者的特征1．在参与者的平均年龄、饮酒量、体育活动、饮食内容或身体质量指数方面，两组之间没有显著差异。根据贝克身体活动问卷，在研究期间，两组的身体活动都没有显著变化[17］．

３．１．凸轮

在DP组中，循环中ICAM-1和e -选择素水平显著下降(分别下降9和15%)。在安慰剂组中，任何CAMs测试都没有显著变化。两组中VCAM-1水平均无显著变化(见表)2）。

３.２．的不利影响

两组间报道的不良反应没有差异。安慰剂组的5名参与者和DP组的3名参与者报告了各种症状，主要是胃肠道症状，如腹胀、大便改变、轻度恶心、嗳气和胃反流。安慰剂组的一名参与者在随机化6周后因消化不良停止了研究。

3.3。生物化学和血液学分析

两组的尿素和电解质、血糖、血脂、血红蛋白、血小板计数、白细胞计数或c反应蛋白均无临床或统计学意义的变化(数据未显示)。在正常成人参考值范围内，两组衍生血液学参数和胆红素均有轻微变化，两组间无差异。DP组肝酶丙氨酸转移酶在参考值范围内显著下降(）但没有改变安慰剂集团。

4.讨论

本研究表明，12周给予中草药DP给男性和女性，在脂质水平中具有轻微至中等的升高，与凸轮ICAM-1和E-SELETIN的表达减少相关。该研究还表明，在该设定中，制剂是良好的耐受性，没有显着的生化不良反应。

CAMs已经成为心血管疾病的一个危险因素。它们被认为通过介导白细胞募集的各个步骤，在动脉粥样硬化过程的启动中发挥重要作用。在动脉粥样硬化发生发展过程中，粘附分子表达上调已在动物模型和人类中观察到[18，19］．动脉粥样硬化部位的白细胞募集是由内皮细胞表面表达的CAM介导的，在动脉粥样硬化早期，内皮细胞结合循环白细胞到血管内皮[6］．CAM基因表达在炎症状态下通过内皮细胞、平滑肌细胞和白细胞等多种细胞释放细胞因子上调[1］．除了细胞因子刺激外，血流动力学剪切应力也能增加ICAM-1的表达[20.］．ICAM-1和VCAM-1介导了白细胞对内皮细胞更强的附着，而选择素(e -选择素，p -选择素)介导了短暂的白细胞在内皮表面滚动[7，20.］．

ICAM-1水平的升高被发现预示着心血管事件风险的增加[2- - - - - -4］．在稳定的冠状动脉疾病患者中，炎症情况下，e -选择素在内皮细胞表面合成并输出血浆水平[21]，似乎反映了系统性动脉粥样硬化的严重程度[6］．p -选择素水平预测健康女性心血管疾病风险[5］．VCAM-1可能是晚期动脉粥样硬化的特异性标志物，因为它通常在动脉粥样硬化斑块上表达[7]， VCAM-1水平与动脉粥样硬化程度相关[22］．鉴于这些事实，已经认为粘附分子及其相互作用可能是有用的治疗靶标，用于减少心血管风险和CVD的管理[23，24］．

这些CAMs主要由内皮细胞产生，尽管骨髓基质细胞和一些其他细胞在特定条件下也有适度表达ICAM-1和VCAM-1 [25］．循环水平的CAMs增加白细胞结合，可以被FACScan分析准确量化[1，2］．我们的结果清楚地表明，在白细胞表面可以检测到ICAM-1、VCAM-1和e -选择素，DP治疗12周可降低e -选择素和ICAM-1的表达。

丹参对心血管系统的一些作用已经被证实，包括降低胆固醇和甘油三酯水平，促进心肌缺血后的恢复[26，27和减少粘附分子表达[28，29］．Radix Salviae Miltiorrhizae含有多种活性化学成分，其中近100个已经确定。其中最重要的是丹参类蛋白质和亲水性酚醛酸等亲脂性蛋白质，特别是Danshensu，Protocatechuic醛和Salvianolic acid [30.］．

三七传统上用于内出血和外出血的止血作用[31，据说能增加冠状动脉血流量，减少心肌耗氧量[32及扩张冠状动脉[26］．三七的有效成分有胡麻皂苷A、胡麻皂苷B、胆碱、三叶油[31］．已发现皂苷对降低血脂[33]，通过抑制主动脉平滑肌细胞的增殖来限制动脉粥样硬化[34，35]及减少炎症[36］．在大鼠模型中，三叶油具有抗氧化作用，减少血栓形成并抑制缺氧缺血期间的心律失常[37］．合成冰片的主要化学成分为倍半萜:外消旋冰片、异冰片和樟脑[38］．

在目前的研究中，DP中包含的草药混合物的作用似乎是专门降低粘附分子ICAM-1和e -选择素的循环水平。结合之前在减少动脉粥样硬化发生的动物模型中证实的效果，这表明该产品可能为进一步研究CVD的潜在机制提供了一个有用的模型。它也可能有助于发展新的策略来预防CVD和限制现有动脉粥样硬化病变的发展。进一步的研究是必要的，以确定该草药制剂的成分，负责这些作用。

然而，重要的是要注意到这项研究的局限性，该研究的人数较少，主要针对的是基本健康的个体，不服用传统药物，依赖替代药物而不是临床终点。草药产品的效果可能在其他临床环境中有所不同，特别是在活跃的CVD受试者中。这种大小的循环黏附分子变化的意义尚不确定。众所周知，体育锻炼可以减少粘附分子的表达，而心理压力会增加粘附分子的表达[39］．在我们的研究中，体育锻炼没有改变。虽然没有理由相信，在研究期间，两组之间的心理压力水平存在差异或压力水平的变化，但我们没有直接测量这些，因此压力应该被视为一个潜在的混杂因素。

综上所述，在血脂水平轻微至中度升高的人类受试者中，DP中包含的混合草药似乎对降低CAMs ICAM-1和e -选择素有特定的作用。该产品可能有助于进一步研究CVD的机制，并开发新的预防和管理策略。

资金

澳大利亚联邦教育科技部、中国科技部(澳中基金资助);天津天士力制药股份有限公司(科研经费)。Ling博士得到了澳大利亚国家健康和医学研究委员会的一个行业协会的支持。

致谢

作者要感谢杰奎琳·怀特黑德女士的饮食分析。K. A. O 'Brien博士和P. A. Komesaroff教授是莫纳什大学的员工，并从天津天士力制药公司获得了时间补偿。Z.-X博士。Guo和R. Luo女士是天士力制药公司的员工。

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