密集的陆基鱼文化的影响在青岛,中国,在细菌社区周围的海洋水和沉积物

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密集的陆基鱼文化的影响在青岛,中国,在细菌社区周围的海洋环境进行了分析。培养的研究表明,异养的最高数量,ammonium-oxidizing,硝化,和硝酸盐还原细菌被发现在鱼塘和污水通道,毗邻海洋地区较低的数量和最低数量的样本500 m污水通道。变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析被用来评估总细菌的多样性。少带观察从污水通道附近的样本和更遥远的沉积物样品相比,表明营养过剩的水产养殖设施可能会减少细菌的多样性社区附近的沉积物。系统发育分析测序DGGE乐队表明fish-culture-associated环境的细菌群落主要由Flavobacteriaceae,γ-和deltaproteobacteria,包括属Gelidibacter、Psychroserpen Lacinutrix,和Croceimarina。

1。介绍

陆基密集的鱼文化在中国高速发展,带来了近年来第四海水养殖的热情。而值得注意的是,排放大量未经处理的污水,La Rosa和同事(1)报道,在贫瘠的海洋环境中,通过饲料添加各种营养,碎石,和粪便物质能引起宏观的变化,小的,micro-fauna群落结构在水体和沉积物。此外,事实证明,密集的鱼饲养往往会导致环境富营养化,外国物种,和疾病的介绍(2,3]。2006年,集约化养鱼在菲律宾被证明是有害的造礁珊瑚Pocillopora damicornis生物方面的,因为许多珊瑚被暴露在受损的废水从养鱼场4]。

细菌社区扮演重要角色在养分循环和环境的变化很敏感。例如,积累大量的有机物能引起持久改变细菌组合(5]。综合表征微生物种群毗邻地区水产养殖操作是预防和治疗各种疾病的重要养殖鱼类和水质的维护6]。然而,传统文化相关的方法是费时和昂贵的,并不能代表实际情况的数据,作为微生物的~ 99.99%在自然环境中目前uncultivable [7]。因此,细菌在水产养殖生态系统的组成是非常了解甚少8]。我们最好的知识,到目前为止,很少有报告细菌群落的组成和结构与陆基密集的鱼文化和渔业等性能的影响到附近的环境。

近年来,许多分子生物学方法已经成功地应用于微生物生态学分析,例如,变性梯度凝胶电泳(DGGE),它最初开发用于分析基因突变序列差异的基础上PCR电泳产品的医学研究领域。首次采用Muyzer et al。91993年)来研究微生物的多样性。从那时起,DGGE已广泛应用于微生物多样性分析不同的生态环境,如explosive-polluted土壤(10],河口[11[],扇贝早期环境12],虾勇气[13),和离岸笼渔场6]。然而,它从未被用来检查陆基fish-culture-associated环境中的微生物。在这项研究中,环境的细菌群落组成与密集的陆地海洋鱼文化是通过文化相关的调查和文化无关的方法,目的是描述环境和评估相关的细菌组成的密集的鱼文化的影响在细菌社区附近的海域。

2。材料和方法

2.1。描述的网站和抽样

密集的陆基fish-culturing农场位于郊区的青岛,中国。这是一个新开发的行业,主要提出了大菱(Scophthalmus马克西姆斯)和日本比目鱼(Paralichthys olivaceus)与自然和地下海水。大部分的未经处理的污水被直接排入附近的凹湾。样本收集的鱼类养殖池塘、污水通道,污染海域10米的污水通道,和未受污染的海域500频道。一式三份样本收集与消毒容器从每个网站,每个包括2 L的海水和沉积物50克,并被转移到实验室在冰上。次级样本然后治疗细菌培养。剩余的样本存储在−20°C分子分析。

2.2。检测细菌群体具有不同的生理功能

沉积物和水和消毒海水样本连续稀释10倍,和0.1毫升稀释被传播到Zobell整除的2216 e中异养细菌和其他适当的媒体对氨氧化细菌和硝化细菌(8]。殖民地的盘子被数2 - 3天后孵化28°C。

硫酸盐和硝酸盐还原菌检测到“最可能数”方法如前所述[6,14]。短暂,整除1 mL系列稀释被添加进系列10毫升的媒体。一式三份管准备每个稀释。文化被发现后7天的孵化28°C的硝酸盐还原菌和硫酸盐还原菌的14天。细菌的人口规模是指计算表,根据每个稀释管与积极成果。三个计算每个采样点的平均结果,和标准偏差(方差)。

2.3。细菌基因组DNA的提取

基因组DNA提取使用chemical-enzymatic溶解协议(15有一些修改。简单,膜对水的样本或10 g的每一个沉积物样品5毫升无菌蒸馏水涡在最大速度为5分钟,然后1毫升溶菌酶(100毫克/毫升)和4毫升DNA提取缓冲(Tris-HCl 100毫米,100毫米EDTA, 100毫米Na₃阿宝₄1.5米,氯化钠,pH值8.0)被添加到管。颤抖的接种者的样本孵化1 h在30°C,和另一个20后1 h在37°CμL蛋白酶K(100毫克/毫升)补充说,其次是5 ~ 15分钟与100年在85°CμL 20% SDS。随后,样本然后离心机在4100克,持续15分钟。一秒钟7.5醋酸铵量添加到上层清液,其次是孵化在冰上,持续15分钟。此后,管离心机在4°C和9,400克15分钟,一夜之间,浮在表面的被对待冷丙胺−20°C。丸分别提高了70%和95%的乙醇。DNA终于resuspended灭菌蒸馏水。原油的DNA提取纯化了polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)和sephacryl s - 400旋列如艾略特所述2)去除PCR抑制剂,如潮湿的酸。治疗和治疗DNA电泳比较0.7%琼脂糖凝胶在60 V 2 h和可视化多重图象光内阁(αInnotech公司、法国)。

2.4。16 s rDNA放大

细菌通用引物,U341 U758,被用来放大418个基点片段对应位置341至758个基点大肠杆菌16 s rDNA序列(9]。稳定DGGE的扩增片段的融化行为反应,正向引物包含GC-clamp [10]。U341和U758序列如下:U341: 5 -GCGGGCGGGGCGGGGGGCACGGGGGGCGCCGGC- - - - - -GGGCGGGGCGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;U758: 5′-CTACCAGG GTATCTAATCC-3′。为最佳DGGE的结果,不同的PCR条件测试。优化PCR反应进行了50μL卷,包括5μL的基因组DNA为模板,5μL 10×PCR缓冲,25 pmol每个引物,200年μ每个核苷酸的M, 1毫米MgCl₂和2.5单位的聚合酶(美国皮斯卡塔韦Amersham生物科学)。添加Taq之前,样品在96°C变性5分钟,其次是降落PCR协议(15)的退火温度设置为65°C和下降了1°C每一辆自行车,直到它达到55°C。每个周期包括变性在94°C 1分钟,1分钟的退火,在72°C扩展为3分钟。20个额外的周期进行了退火55°C。最后,5μL的PCR产品是装上1.4%的琼脂糖凝胶100 bp DNA梯(MBI Fermentas,阿默斯特,美国)。乐队在多重图象可视化SYBR安全染料光内阁。

2.5。DGGE分析放大DNA

DGGE进行解码普遍突变检测系统(Bio-Rad Inc .、米西索加、加拿大)所描述的制造商。进行分离的8% (W / V)丙烯酰胺凝胶1 x TAE(40毫米Tris-acetate, pH值8.0;1毫米Na₂DETA)包含一个线性梯度从25%到65%变性剂(100%变性剂由7 M尿素和甲酰胺40%)所描述的Muyzer et al。9]。在梳插入,避免干扰梯度acrylamide-N 6%, N-methylene: bisacrylamide(37.5: 1)叠加凝胶不变性剂添加(15]。每个纯化PCR产品(约600 ng) 15μL 2 x加载缓冲区是应用于一个车道的变性梯度凝胶。电泳运行16 h在80 V,然后染色1:10000稀释Vistra绿色染色溶液(Amersham法玛西亚生物科学公司Baie-d 'Urfe,加拿大)30分钟,和可视化FluorImager系统(型号595,Amersham) 488海里激发过滤器和530海里排放过滤器。

分析细菌多样性,每个样本的香农指数是根据强度计算(吸光度)和位置DGGE乐队的每一个车道,(1使用),

在(1),意味着每个波段的吸收峰面积和意味着吸收峰的面积的乐队在车道上。

系统树图DGGE分析带模式进行使用树枝石2.2软件包(美国代尔Soll-tech Inc .)。未加权的两组方法,基于相似度矩阵的计算存在/缺乏DGGE乐队,被用来分析样本之间的相似性。

2.6。Reamplification和DGGE乐队的测序

从凝胶,32特定DGGE乐队与无菌外科手术刀切除。从这些乐队在一夜之间被孵化筛选了DNA在37°C消毒去离子水(16),然后用卡塔尔投资局快速纯化PCR净化设备(试剂盒、米西索加、加拿大)。为reamplification获得的DNA作为模板。标准的PCR进行50μL反应体积,包含1μL DNA, 1μL U341底漆(25 pmoL) 1μL U758底漆(25 pmoL), 0.625μL BSA(10毫克/毫升),5μ8.0 L 10 x PCR缓冲μL MgCl₂8.0(100毫克)μ24.9 L核苷酸(1.25毫米)μL无菌去离子水,0.5μL Taq酶分别添加当温度达到80°C初始变性5分钟后95°C。1分钟的PCR包括25周期在94°C,在64°C 1分钟,1分钟在72°C。为了得到单一乐队清洁测序结果,模板的数量,退火温度和循环数是根据标准PCR的结果调整协议对个人样本。Amplicants显示单一乐队在1.4%琼脂糖凝胶纯化GFX净化设备(美国皮斯卡塔韦Amersham)和量化通过加载1μL与稀释到1.4%的琼脂糖凝胶比较一系列DNA梯100个基点。样品(20μng / L, 2μ拉瓦尔大学L)被送到测序。

2.7。系统发育分析细菌社区

获得的序列是手动更正通过比较正向和反向的共识序列与软件Macvector 8.1(美国卡里Macvector Inc .)。修正序列的长度变化范围从352到387个基点。序列使用Clustal W项目最初对齐,然后分析指的是密切相关的序列从NCBI检索网站:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn。相同的序列相同的移民对DGGE被视为一个。进一步手动修改对齐进行使用multicluster函数。

3所示。结果

3.1。与文化相关的细菌检测方法的数量

细菌从5重要生理上定义组是所有沉积物和水样品中发现的。如表所示1总异养细菌的数量在鱼池和污水通道是最高(1.25 - 1.29×10⁵CFU / g),其次是污染海域接受鱼文化废水(1.23 - 4.7×10⁴CFU / g),未受污染的海域500 m污水通道是最低(1.6到4.3×10³CFU / g)。沉积物中细菌数量均高于相关的水环境。ammonium-oxidizing的数量细菌、硝化细菌、异养细菌,硝酸盐还原菌也有相似的分布趋势,变化从4.0×10¹细胞/ g 1.5×10⁵细胞/ g,表明活性氮污染地区的发行量。然而,硫酸盐还原细菌的数量只有2.3×10¹细胞/ g 4.6×10²沉积物中细胞/ g和3~7.5×10¹细胞/ g的水域,明显低于其他细菌。

3.2。基因组DNA的细菌隔绝Fish-Culture-Associated环境

获得基因组细菌的DNA片段的大小约为23 kb。从布朗提取成为无色,电泳乐队变得清晰和PVPP净化后,Sephacryl (s - 400)列(数字1(一)和1(B)),这表明PVPP Sephacryl净化和有效地去除粗提取物的抑制因素。

3.3。16 s rDNA放大

417年英国石油公司16 s rRNA基因的片段与引物GC U341和U758放大。保险single-specific乐队的代表协议。收益率是相当高的,明亮的乐队如图2。

3.4。DGGE带概要文件的样本来自不同的环境

PCR DGGE分析产品相同的模式,与20多个乐队为每个示例,表明高细菌群落的多样性。如图3带沉积物的模式显示,更高的多样性和更多的均相分布的水域。在水中的细菌多样性的增加减少了鱼塘的距离。这可以证明他们的香农指数,如表所示2。主导乐队这些样本的重要性也大大不同,水从鱼塘>水从污水频道>从未受污染的海域污染海域>水>沉积物的污染海域>未受污染的海域的沉积物,表明鱼文化可能导致减少细菌多样性和一些物种可能成为绝对优势。

系统树图的DGGE乐队模式反映了相关相似/不同的DGGE车道。如图4,这两个沉积物样品污染和未受污染的海域被聚集到一组(S_AB0.67)和聚集成一个大群和两个水样来自同一海域(S_AB0.52)。然而,这两个从鱼塘水样和污水通道被聚集到另一组(S_AB0.65)。与此同时,相似系数(S_AB)的海域的鱼文化池塘和样本的样本仅为0.34,表明细菌群落组成在同一生境更相似。

3.5。系统发育分析测序DGGE乐队

总共32波段选择DGGE凝胶和reamplified引物U341 U758。其中,19个生产清洁的测序结果。最接近的匹配这些序列被确定通过NCBI BLAST分析。研究结果总结在表3。这些序列的相似性而引用数据库从93%到100%不等。

系统发育分析序列揭示了细菌群落结构的陆基fish-culture-associated环境。一般而言,社区是由Flavobacteria, Gammaproteobacteria Deltaproteobacteria。其中,Flavobacteria显示强大的主导地位,它属覆盖Gelidibacter、Psychroserpen Lacinutrix、Croceimarina Actibacter, Maribacter, Winogradskyella, Zobellia,福尔摩沙,和Polaribacter。两个组变形菌门咆哮总人口的一小部分。这些物种没有独立培养,如预告和K7。对个人的环境,Polaribactersp。(K3, K4),Marinobactersp。(K5) thiotrophic内共生体艾达sp。(j - 1)Pseudoalteromonassp.像细菌(美丽)鱼文化中占主导地位的废水和污染海水样本。此外,福尔摩沙sp。(K1)也发现显著优势被污染的海水。另一方面,占主导地位的细菌污染海域的沉积物样品不一样重要,在水样。这些占主导地位的细菌在沉积物组成的Gelidibactersp。(H1),Lacinutrix copepodicola(H3),Croceimarina litoralis(H4),Maribacter polysiphoniae(编辑)。未受污染的海域中几乎所有的细菌物种比他们在上述环境中且分布均匀。与此同时,一些独特的物种,如Winogradskyella thalassocola(I2),Desulfuromonassp。(I3)和无教养的三角洲proteobacterium(预告),在未受污染的海域。上述细菌的系统发育关系图所示5。

4所示。讨论

报道集中养殖鱼类的饲料保护比率71.2 - -74.9%,和粪便生产比率为9.6 -3.1%。这些暗示,133公斤的氮和磷的28.8公斤排入环境1吨的鱼(17]。放电产生的碎屑和粪便问题由于添加饲料,贫瘠海洋环境可以促使宏观的社会结构的变化,小的和在水中微动物区系列和沉积物1),以及营养水平,物理和化学条件。定义的五个生理细菌群体选择在这个研究与有机质的含量有密切关系,溶氧水平、氮和硫循环活动在其环境。我们的研究结果表明,异养细菌的数量逐渐减少与鱼塘的距离的增加,表明鱼文化废水可以引入丰富的有机物和异养细菌的海域接受它。ammonium-oxidizing大量的细菌、硝化细菌、硝酸盐还原菌在污水污染水和海域表示活性氮循环在这些领域。这可能是由于丰富的渔业废水氮带来的鱼类代谢排泄物(粪便等)和浪费饲料。

Yoza et al。6)观察到类似的DGGE梯度概要文件为新开发的笼子渔业沉积物样本和300米上升气流控制样本。然而,他们仍然预计,足够的营养素添加会影响沉积物环境。在我们的实验中,观察更少的多样性和物种分布的均匀度污染海域沉积物样品的比未受污染的海域,香农指数分别为1.37和1.46。这些观察建议强化陆基渔业废水对细菌社区产生了重大的影响,导致细菌多样性的减少。此外,这两个研究进行了后不久鱼文化的发展。随着时间延长培养,有理由相信,将会更加显著的影响。Asami et al。18)也报道,密集的贝类养殖加速在沿海海洋沉积物中硫循环(17]。此外,细菌群落生境而不是由其地理位置决定的(19]。即渔业的影响废水的细菌群落可能发生改变它们的栖息地的化学和物理条件,除了从污水进口细菌。

的一个主导phylotype(美丽)中发现的鱼文化废水和污染海水面积属于属,Pseudoalteromonas细菌中。这属广泛分布在海洋环境20.]。据报道,Pseudoalteromonas对海洋真核生物(有害和有益的影响21- - - - - -23]。主导phylotype (I3)在未受污染的海域的沉积物是类似的Desulfuromonas sp。硫酸盐还原细菌δ-变形菌门的家庭。并不让人觉得惊讶找到海洋沉积物中硫酸盐还原,由于硫酸是一个支持终端电子受体在这种环境下(24),但细菌的数量通过文化相关的方法检测到很低。属福尔摩沙(K1)被发现在污水通道水和原生海水,和异养,革兰氏阴性,运动型,有氧,布朗alga-degrading细菌组(25,26),表明其对海洋环境的承诺。

许多主要的细菌群体,如Aeromonadaceae、假单胞菌科和弧菌科检测病原体的养殖鱼类与传统culture-depended方法,并非本文通过分子生物学方法检测,表明病原菌可能不是主导整个社区。因此,细菌成分仍远比我们想象的更复杂。进一步的研究是必要的,以确定是否和水产养殖多长时间可以改变细菌群落的组成和破坏平衡在其附近的海域。

5。结论

在本文,密集的陆基鱼文化的影响在青岛,中国,在周围的海洋环境细菌社区通过培养和分子方法进行了分析。结果异养培养的研究表明,计数,ammonium-oxidizing,硝化,硝酸盐还原菌减少距离增加从鱼塘到未受污染的海域。DGGE概要文件显示更少的乐队在污水通道附近的样本相比更遥远的沉积物样品。上述建议,过剩的营养密集的陆基鱼文化设施可能导入细菌和改变的化学和物理条件附近海域也减少细菌的多样性社区在附近水域和沉积物。

确认

提供的金融支持本文的山东省博士后研究基金(200601011)、中国国家高技术发展项目(2006 aa10z414 2006 aa10z415)和国家海洋公益性研究项目(没有。200805069)。作者感谢教授瞿崔克明协助样本集合。

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