文摘

痴呆是一种临床综合症,其特征是多种认知缺陷和原因进行性神经退化导致最终死亡。痴呆的发病率正在增加全球老龄化的增加。然而,还没有有效的治疗方法是行之有效的。,药物激活神经突生长已经猜测可能诱发神经重建,有助于脑功能的恢复。在这个假设,我们最近发现的氯仿提取罗莎damascena显著诱导神经突活动和抑制产物β(25 - 35)全身萎缩和细胞死亡。进一步检查领导的隔离很长多不饱和脂肪酸有分子式C37H64年O2作为活性组分。这种化合物的结构建立了广泛的分析观察到的破碎EI-MS模式。分离化合物的保护β(25 - 35)全身萎缩并显示强大的神经突的活动产物。长度的树突细胞治疗这种化合物是可比的神经生长因子治疗细胞(神经生长因子)。

1。介绍

痴呆是一种最繁重的全球健康状况。痴呆导致进行性神经退化导致最终死亡。痴呆的发病率将随着人口老龄化的增加而增加。根据国际阿尔茨海默氏症(ADI)德尔菲研究共识,每年估计有460万人患有老年痴呆症(一个新例每7 s),和世界上8110万的人可能会遭受到2040年(1]。尽管如此灾难性的增加痴呆病人在世界范围内,还没有有效的治疗方法是行之有效的。几个乙酰胆碱酯酶抑制剂如多奈哌齐、卡巴拉汀和加兰他敏是最常用的治疗痴呆病人(2]。然而,这些只是减缓老年痴呆症的恶化,而不是恢复大脑功能在实际临床情况3]。因此,迫切需要替代治疗策略。痴呆是由于神经元变性和萎缩。在中枢神经系统神经退化是一个不可逆过程;然而,形成新的突触可能通过保持健康的神经元的激活4]。因此,重建大脑突触的形成可能是一个强大的战略之一痴呆治疗(5]。神经网络和突触发生需要神经突的重建结果以及树突和轴突的成熟的步骤。因此,药物激活这些步骤可能启动大脑功能的恢复。

罗莎damascena俗称大马士革玫瑰,以其精细的香味。众所周知的放松效果;传统上,玫瑰油被用作治疗焦虑、抑郁和压力相关疾病治疗的在世界的许多地方6]。腹腔内注射的r . damascena精油老鼠(延迟发作的发展阶段7]。综上所述,我们怀疑玫瑰油可能对大脑功能的影响,但的效果r . damascena神经突的萎缩还从来没有被调查。

淀粉样蛋白β(一个β)被认为是阿尔茨海默病的主要病理原因。一个β(25 - 35)是一个部分的一个完整的肽片段β并且可以在老年痴呆症患者的大脑由天然酶乳沟β第1 - 40 ()(8]。一个β(25 - 35)类似的形式β表结构(9,诱发神经细胞死亡(9,10),神经突萎缩(11,12),突触损失(11- - - - - -13),和记忆障碍11,13- - - - - -15]。此外,还证明了我们之前的工作β(25 - 35)β(1-42)导致类似影响神经炎的萎缩和细胞死亡在10μ米(16]。此外,最近的一份报告显示,一个intracerebroventricular (i.c.v。,15μg)注入的β(25 - 35)可能诱发主要神经病理症状与早期阿尔茨海默病大鼠(17]。考虑到这些报告,我们已经使用了β(25 - 35)诱导神经炎的萎缩和细胞死亡的准备在体外和在活的有机体内阿尔茨海默病模型。

在这项研究中,我们发现氯仿提取的r . damascena(蔷薇科家族,从Kashan收集的市场在伊朗)显示强大的神经突下活动的产物β(25 - 35)全身的神经炎的萎缩状态,确定了活性组分的提取。

2。方法

2.1。一般的方法

核磁共振光谱被带到JEOL JNM-LA400光谱仪与四甲基硅烷(TMS)作为内标。HR-EI-MS测量进行JEOL jms - 700 t光谱仪使用直接进气系统的电离电压70 eV。中压液相色谱仪(MPLC)进行BUCHI MPLC系统使用正常bw - 820 - mh硅胶(富士Silysia、爱知、日本)(列大小:4.0×15厘米)。进行分析和制备薄层色谱预镀硅胶60 f254年或RP-18F254年盘子(默克公司0.25或0.50 mm-thickness)。Decosahexaenoic酸(DHA)和米德酸用于本研究从西格玛奥德里奇购买。

2.2。提取和分离

的萌芽r . damascena(500克)于2005年从商业供应商购买。萌芽状态(400克)与氯仿提取声波降解法(1 h L×1.5×3次)给氯仿提取(18 g)。氯仿提取(16 g)受到MPLC (BUCHI)硅胶填充柱(4.0×15厘米)筛选了与己烷methanol-chloroform溶剂系统给九个分数紧随其后。分数4(350毫克)受到制备薄层色谱在10%乙acetate-hexane负担四个小分支(4:1,60毫克;4 - 2,75毫克;4 - 3,80毫克;4 - 4、55毫克;4 - 5、40毫克)。小分支4 - 3被重复的正常阶段进一步纯化制备薄层色谱与2% methanol-chloroform acetone-benzene(1: 9)化合物1(17.0毫克)。

2.2.1。化合物1

无色无定形固体
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ:0.97 (3 h t 7.4赫兹,H-37), 1.22 - -1.37 (36 h, m, H-4-21), 1.62 (2 h, m, H-3), 2.05 (4 h, m, H-22, 36), 2.34 (2 h t 7.5赫兹,2),2.8 (6 h, m, H-25, 28岁,33),5.32 - -5.38 (10 h, m, H-24, 25日,27日28日30-33,35岁,36);EI-MS (rel int %)m / z:540(41),523(45),507年(42岁),492(37),479(21)470(59岁),458(31),457(96),438(28),421(28),419(100),402(26),382(30),362年(18),345(19)、327年(46),305(21)287(14),271(12),268(13)、249年(18),241 (23),217 (20)215 (30),212 (19),142 (27),137 (34),128 (30),125 (35),97 (45),68 (77),54 (82),40 (92),21 (78)。HR-EI-MSm / z:540.4898(米)+计算的C37H64年O2540.4906点。

2.3。小学文化

所有动物实验进行按照实验动物保健和使用指南的Sugitani校园富山大学和国家卫生研究院实验室动物保健和使用的指导方针。所有协议都是动物保健和使用委员会批准Sugitani富山大学的校园。所有的努力都是尽量减少实验用动物的数量。老鼠胚胎从怀孕Sprague-Dawley(日本SLC、静冈市、日本)在妊娠18天。皮质是解剖和硬脑膜被移除。组织被剁碎,分离,然后用Neurobasal生长在文化媒介(Gibco BRL,罗克维尔市,医学博士,美国),包括12%马血清,0.6%D葡萄糖和2毫米l谷氨酰胺在8-well室幻灯片(美国新泽西州猎鹰,富兰克林湖)涂上了50μg / mL保利-D赖氨酸在37°C湿润孵化器有限公司为10%2。化合物添加时,一半的介质在每个被新的取代中含有2% B-27补充(Gibco BRL)没有血清。实验的时间安排各图的底部。部分的片段β,一个β(25 - 35)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),溶解在无菌蒸馏水(在体外实验)或生理盐水(在活的有机体内实验)的浓度为5毫米,4天在37°C的环境允许原纤维形成。重组大鼠神经生长因子是购自研发系统(明尼阿波利斯,美国)被用作积极控制试剂。

2.4。免疫细胞化学

大鼠皮质神经元培养在8-well室幻灯片密度为1.45×105细胞/厘米2。测量长度的轴突和树突细胞治疗与每个提取、化合物或车辆(0.1% DMSO)。细胞与4%多聚甲醛固定,然后应用单克隆抗体对磷酸化neurofilament-H (pNF-H)(1: 500)轴突标记或多克隆抗体对MAP2树突标记(1:500)。Alexa萤石488 -共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 300)和Alexa萤石568 -共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白作为第二抗体。单克隆抗体单克隆抗体对pNF-H购买从斯特恩伯格(Lutherville,医学博士,美国)。多克隆抗体对microtubule-associated蛋白质2 A和2 b (MAP2)从Chemicon购买(泰梅库拉、钙、美国)。Alexa萤石488 -共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白和Alexa萤石568 -共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白分子探针买来(尤金,或者美国)。荧光图像被荧光显微镜(ax - 80年,奥林巴斯、东京、日本)在320×425μ米2每治疗,和四个图像被抓获。pNF-H阳性神经突的长度或MAP2用图像分析仪测量神经细胞(Kurabo,大阪,日本),自动跟踪和测量神经突的长度没有测量细胞体。轴突和树突的总长度除以细胞数量在一个相同的面积来计算每个单元的平均长度。

2.5。细胞生存能力评估

大鼠皮质神经元培养在8-well室幻灯片密度为1.45×105细胞/厘米2。细胞生存能力是由钙黄绿素染色。细胞8-well室幻灯片被磷酸盐缓冲剂盐水冲洗(PBS)和孵化了6μ米钙黄绿素是(Dojindo、熊本、日本)40分钟37°C。在PBS冲洗之后,细胞被4%多聚甲醛固定,安装。每治疗荧光图像捕获图像(6)由ax - 80显微镜。calcein-positive细胞每固定面积的面积(320×425μ米2)计算估计活细胞的百分比。

2.6。统计分析

统计与单向方差分析进行比较(方差分析)Dunnett的紧随其后事后测试(图1),或者学生的t以及(图2和5)使用SigmaStat 3.5(美国CA SYSTAT)。的值P< 0.05被认为是重要的。数据的手段提出了标准错误(SE)。

(一)
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(b)
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图1
玫瑰精华的保护作用β(25 - 35)全身的树突细胞萎缩和死亡。皮质神经元培养三天,然后被处理(阿明费)或没有10μ米一个β(25 - 35)(续)。氯仿提取的细胞同时治疗罗莎damascena(0.5,5μg / mL, RE)或车辆(0.1% DMSO,阿明费)。(一)5天治疗后,这些细胞被固定和应用MAP2a&2b。神经突的长度MAP2a&2b-positive测量。值意味着±SE的四个领域的数据。(b)培养三天后,皮质神经元接受(阿明费)或没有(续)10μ米一个β(25 - 35)。氯仿提取的细胞同时处理罗莎damascena(5μg / mL, RE), (g14)-Humanin (100 nM, HN)或车辆(阿明费)。治疗四天后,细胞生存能力测量。值意味着±SE的数据从性区域。*P< 0.05和β(25 - 35)/ Veh(单向方差分析Dunnett的紧随其后事后测试)。典型的照片所示。
(一)
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(c)
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图2
保护作用不同分数的氯仿提取物在上升β(25 - 35)全身的树突和轴突萎缩。皮质神经元培养三天,然后被处理(阿明费)或没有10μ米一个β(25 - 35)(续)。氯仿提取的细胞同时治疗罗莎damascena(5μg / mL, RE),小分支的氯仿提取(5μg / mL),神经生长因子(100 ng / mL)或车辆(0.1% DMSO,阿明费)。5天治疗后,这些细胞被固定,应用MAP2a&2b (a)或磷酸化NF-H (b)。神经突MAP2a&2b-positive或磷酸化NF-H-positive的长度测量。值意味着±SE从4到6个地区的数据。*P< 0.05和β(25 - 35)/ Veh(学生的t以及)。典型的照片所示。

3所示。结果

3.1。玫瑰精华和它的分数的影响β(25 - 35)诱导萎缩

氯仿提取的r .波纹(重新)添加到培养基的浓度0.5和5μg / mL或车辆(控制,0.1% DMSO)。5天治疗后,树突长度的测量(图1(一))。树突长度明显下降了β(25 - 35)诱导神经突萎缩,同时,治疗显著抑制了β(25 - 35)全身萎缩以浓度依赖方式。此外,细胞生存的汽车集团被发现显著降低。虽然治疗(5μg / mL)领导的大幅度增加,细胞生存能力(图1 (b))。(通用电气14)-Humanin(100海里)作为一个积极的控制(18)在本研究中也表现出显著提高细胞生存。

为了查明,诱导神经突生长活性组分的氯仿提取的玫瑰提取的活动,它受到在硅胶柱层析法使用梯度methanol-chloroform溶剂系统获得9个分数。这些分数被再次测试β(25 - 35)全身萎缩。如图2汽车组显示,树突和轴突长度的减少。这些测试的分数,fraction-4显示明显效果显著增加树突和轴突的长度;因此,fraction-4进一步纯化乙acetate-hexane重复制备薄层色谱,2% methanol-chloroform acetone-benzene(1: 9)获得化合物1(图3)。


图3
化合物1的结构。
3.2。鉴定化合物1和神经突的活动产物

化合物1是孤立的无色无定形固体。它显示HR-EI-MS 540.4898(计算C37H64年O2540.4906)。的1显示H NMR信号特点的不饱和脂肪酸和显示信号由于烯质子δH5.30 - -5.43 ppm,烯丙基的质子δH2.34 ppm,亚甲基δH1.20 - -1.37 ppm和甲基δH0.97 ppm。的13C NMR光谱另一方面显示信号对应于酸羰基δC179.6 ppm, 10 olifenic碳碳(δC132.0,130.3,130.2,128.28,128.26,128.1,127.9,127.8和127.1 ppm)。这部分信息加上EI-MS数据,并受广泛分析的女士分化研究。自然产品派生欧methylene-interrupted双键独联体几何和属于n−3或n−6家(19]。的classifiationn−3或n−6脂肪酸是基于第一个双键发生三个或六个碳原子的甲基终点站脂肪酸分子,分别。这些信息在手,EI-MS碎片分析(图4)做了如下。

(一)
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(b)
(b)
图4
EI-MS光谱和产品特征离子化合物1。
(一)
(一)
(b)
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图5
化合物1的保护作用β(25 - 35)全身的树突萎缩。皮质神经元培养三天,然后被处理(阿明费)或没有10μ米一个β(25 - 35)(续)。同时细胞治疗化合物1 (1μ米),小分支f - 4 (5μDHA (1 g / mL)μ米),神经生长因子(100 ng / mL)或车辆(0.1% DMSO,阿明费)。5天治疗后,这些细胞被固定和MAP2a&2b应用。神经突的长度MAP2a&2b-positive测量。值意味着±SE的四个领域的数据。*P< 0.05和β(25 - 35)/ Veh(学生的t以及)。典型的照片所示。

显示的化合物1的分子离子峰m / z540年。的峰值m / z523年和507年都表明[M−哦)+和[(M−哦)−16]+。商用mead酸也研究了其分散模式,也给类似的碎片峰对应于[M]+[M−哦)+和[(M−哦)−16]+化合物1中。激烈的碎片在478年代表(507等)+表明化合物1属于n−3多不饱和脂肪酸。锋利的强烈的高峰m / z419对应(121−)+将烯丙基的乳沟吗α碎片离子,而另一个顶点m / z457年因(83−)+。为了解决这两个主要的强烈的山峰,五个双键应该位于Δ23,26日,29日,31岁和34岁。峰值对应于215年和325年是指示性的乳沟[M]+峰值对应于α和ω碎片在烯丙基的c - 21位置。类似的山峰m / z212、327、271和268年,对应α和ω的碎片(M−H)+分别的山峰。因此,深入分析EI-MS碎片的识别化合物作为C37:5(Δ23日,26日,29日,31日,34)脂肪酸。

化合物1的测试β(25 - 35)全身萎缩。如图5的剂量,化合物1显示活动1μm .化合物1的疗效与神经生长因子(神经生长因子)和二十二碳六烯酸(DHA)。DHA是必需脂肪酸称赞内存增强[20.]。有趣的是,化合物1比DHA呈现出更强的活动。此外,长度的树突细胞治疗化合物1与神经生长因子的细胞治疗。这表明,化合物1的一个活性组分存在于神经突的增强结果负责。

4所示。讨论

痴呆是一种临床综合症,其特征是多种认知缺陷包括重大损害记忆力和至少一个其他的心理活动范围21]。两种最常见的痴呆症是阿尔茨海默病和血管性痴呆的病因。估计显示,2007年全世界的痴呆症患者数量约为3300万,增加了可能在未来几天1]。尽管如此灾难性的增加痴呆病人在世界范围内,还没有有效的治疗方法是可用的(22]。当前治疗包括使用拟胆碱的代理形式的乙酰胆碱酯酶抑制剂,如多奈哌齐(疼痛),卡巴拉汀和加兰他敏;然而,这些药物的临床疗效仍有争议(3]。在这方面,这些天吸引相当大的替代药物的潜在的新治疗痴呆(5,23,24]。天然药物等Withania somnifera已发现和人参皂甙诱导轴突和树突的扩展4,25];在目前的研究中,我们发现氯仿提取的r . damascena显著诱导神经突,抑制了产物β(25 - 35)全身萎缩。此外,阻止诱导的神经细胞死亡β(25 - 35)。的石油r . damascena人类已被证明,以减轻抑郁和压力(6),对豚鼠气管链松弛剂影响(26];然而,这是第一个报告神经突的玫瑰提取产物。进一步的工作进行了隔离的长链多不饱和脂肪酸(VLFA)化合物1属于n−3系列的有效成分的提取。大多数组织的VLFAs是正常的组件,特别是脑部、视网膜和男性生殖组织。与10 - 12 VLFAs双键和58个碳原子从牛视网膜已报告27]。甲壳纲动物Bathynella baicalensis已被证明含有VLFAs三到六双键和40碳原子(28),而他们已经观察到很少的植物王国。目前报告的第一个例子是关于此类VLFAs的发生r . damascena。

人类发展和健康在许多方面依赖于可用性的长链多不饱和脂肪酸20到22个碳包含六methylene-flanked长度独联体总价值债券(29日]。VLFAs包括营养很重要n−6花生四烯酸等脂肪酸,n−3脂肪酸如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。特别是,n−3 VLFAs一直追究其重要性在人类胎儿发育和中枢神经系统的形成和功能,大脑和视网膜。DHA的老年痴呆症患者的大脑中伴随着减少在记忆和学习30.]。DHA政府防止氧化应激造成的逃避学习能力和损失的注入β进入大脑心室(31日]。虽然,DHA刺激神经突生长据报道在正常神经元主要如鼠海马神经元(32)和PC12细胞(33),没有人报道DHA在的效果β全身的神经炎的萎缩。在本研究中,化合物1显示更明显的保护β比DHA(25 - 35)全身的神经炎的萎缩,建议对老年痴呆症的有益作用。

先前的研究表明,饱和长链脂肪酸没有影响神经突扩展(34,35)和哺乳动物细胞缺乏desaturase引入双键的酶n−3和n−6位置(36]。因此,饮食富含这些多不饱和脂肪酸可能直接对人类的大脑功能。虽然需要进一步的研究,目前的研究表明存在VLFAs玫瑰提取可能患有痴呆可能的健康益处。其他有效成分的分离和鉴定以及相关化合物的合成和半合成的结构活性关系研究和强有力的先导化合物的发现。

资金

科学研究补助金(16406002)从教育部,文化、体育、科技、日本。