e2f1诱导的lncRNA BAIAP2-AS1过表达通过mir - 3161 -3p/SOX4轴参与肝癌的恶性进展

摘要

目前，大量研究表明，长链非编码rna (long noncoding RNAs, lncRNAs)在包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)在内的各种肿瘤的进展过程中发挥着重要作用。在这里，我们测量了lncRNA BAIAP2反义RNA 1(BAIAP2- as1)的表达及其在HCC发展中的作用。在本研究中，baap2 - as1和SOX4在HCC细胞和组织中的表达明显上调，高baap2 - as1可能是一种新的HCC生物标志物。E2F1激活了BAIAP2-AS1的表达。baap2 - as1沉默抑制HepG2和PLC5细胞的增殖和转移。关系验证实验表明，BAIAP2-AS1调控SOX4和miR-361-3p的表达。救援实验进一步证实miR-361-3p与BAIAP2-AS1、miR-361-3p与SOX4呈正相关。总之，BAIAP2-AS1通过调节miR-361-3p/SOX4轴促进HCC的发生发展。因此，我们的研究为肝癌的治疗提供了一个潜在的治疗靶点。

1.介绍

肝细胞癌(HCC)是一种原发性肝脏恶性肿瘤，目前在最常见的恶性肿瘤中排名第六，每年造成估计超过50万人死亡[1.,2.］.它在亚洲和中非的部分地区更为突出，大约50%的新病例是在中国确诊的[3.］.尽管在诊断策略、化疗、放疗和手术方面取得了一些进展，但由于耐药、肿瘤复发和晚期诊断，许多HCC患者的生存时间仍然很差[4.,5.］.因此，肝癌的发生和发展的分子机制值得进一步探讨。

基于高通量RNA测序技术的进步，绝大多数人类转录组可以归类为非编码RNA [6.］.长链非编码rna (long noncoding rna, lncrna)作为非编码rna的一类，长度为>200核苷酸(nt) [7.］.多个模型生物被用于lncrna的注释，结果表明，它们通常以一种空间和时间特异性的模式表达[8.,9］.近年来，新兴的研究表明lncRNA参与多种生理和病理过程，如程序性细胞死亡、细胞生长、核孔运输、干细胞多能性和发育，通过在转录、转录后或表观遗传水平作为表观遗传调控因子[10,11]越来越多的证据也证实lncRNAs通过一系列复杂的机制在各种肿瘤的进展中显示出重要的调节作用[12,13]然而，许多lncRNAs在肝癌发生和转移中的潜在功能尚未阐明。

在本研究中，lncRNA BAIAP2反义RNA 1 (BAIAP2- as1)被鉴定为一种新的hcc相关lncRNA。它在HCC中高表达。然后，首次研究了BAIAP2-AS1在HCC中的临床意义和肿瘤相关功能。本研究为肝癌的转移机制提供了新的认识，为肝癌的治疗提供了一个有前景的治疗靶点。

2.材料和方法

2．1．临床样本

选取2019年7月至2020年8月在潍坊市人民医院手术的10例患者，获取10对HCC及相应的相邻正常标本。在样本采集前，并不是所有患者都接受局部或全身治疗。所有标本均进行快速冷冻，保存于-80℃，用于提取总rna。两位经验丰富的病理学家鉴定标本类型。术前征得所有患者的知情同意，并获得潍坊市人民医院伦理委员会的批准。

2．2.细胞系和细胞转染

HCC细胞系HCCLM3、Huh7、HepG2和PLC5以及正常肝细胞系LO2购自上海细胞银行（中国上海）。所有细胞均在含有10%FBS（中国江苏太仓Cyagen Technology）和100%FBS的DMEM（中国湖北武汉Procell）中生长 μG /ml链霉素和青霉素。

将针对BAIAP2-AS1的短发夹rna (shrna)连接到pGPU6/GFP/Neo1载体(sh-BAIAP2-AS1: ccggcagtaaccagaaagttccagactcgagtctggaactttctggttactgttttg;sh-BAIAP2-AS1-2: ccggcacttgtaatcagtaaccagactcgagtctggttactgattacaagtgttttg)(云州科技，广州，广东，中国)，非靶向序列质粒作为阴性对照(sh-NC)。E2F1小干扰rna (si-E2F1-1: 5 -CCACTCCACCTAACCATAGTCCACT-3 ;si-E2F1-2:ACCCTATTCATCACGTCCACT）和阴性对照（NC）siRNA购自Origene（中国北京海淀）。miRNA-361-3p模拟物（5 -TCCCCAGGTGATTCTGATTT-3 ），miRNA-361-3p抑制剂（5 -ACTTCGTCTCATGCACTATTTACA-3 ），NC模拟（5 -TAACACGCATTATCACAGCAGCACA-3 ），(5 -TCAACAACTGTGTCTCACCTGTCA-3 )均为山东济南维珍生物科技有限公司获得。Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)根据厂家说明书进行细胞转染。

2．3.生物信息学分析

通过StarBase预测BAIAP2-AS1、miR-361-3p和SOX4之间的结合位点(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）.应用jasper预测BAIAP2-AS1启动子区域E2F1结合位点(http://jaspar.genereg.net/）.启动子数量由Promoter 2.0等软件预测[14], FPROM [15]及NNPP [16］.相对轮廓评分阈值为80%。“GEPIA”分析了BAIAP2-AS1和SOX4的表达及其临床意义(http://gepia.cancer-pku.cn/）.

２.４.RNA提取与实时荧光定量PCR (RT-qPCR)

标本和细胞总RNA的采集使用TRIzol试剂，该试剂购于中国北京海淀Life Technologies公司。采用逆向EasyScript一步gDNA去除和cDNA合成SuperMix (TAKALA, Zhejiang, Hangzhou, China)技术合成第一链cDNA。采用ABI 7300序列检测系统(中国江苏南京)进行RT-qPCR检测。内源控制采用GAPDH或U6 snRNA。此外,2^{−ΔΔ计算机断层扫描}方法计算基因表达的倍数变化。引物采用Primer Express 3.0设计。表格1.列出了序列。

2．5．细胞计数试剂盒8 (CCK-8)

CCK-8溶液(Dojindo, Gaithersburg, MD)用于细胞增殖试验。首先，细胞以相同的浓度三次播种到96孔板中 细胞/。然后,15μ在最终的4周内，用1/孔CCK-8溶液处理收集的细胞 用微孔板读取器测量光密度。

2.6。集落形成试验

细胞以每孔600个细胞的密度接种在六孔板中，并与RPMI 1640（中国广东深圳Sigma-Aldrich）和10%FBS（中国江苏太仓Cyagen Technology）一起培养培养10天。培养期结束后，用PBS清洗细胞，然后将细胞固定在甲醇中，并用结晶紫（中国上海静安Tsbiochem）染色。进行三个独立实验。

2.7.EdU染色

用EdU试剂盒加入细胞培养液3h。然后是Cell-Light™EdU Apollo®⁴⁸⁹采用体外成像试剂盒对细胞进行染色。细胞核无光DAPI染色。采用倒置荧光显微镜观察。

2.8。入侵检测

用transwell法测定细胞的侵袭电位。手术过程如前所述[17］.

2.9。亚细胞分离

根据制造商的说明，使用PARIS试剂盒(Life Technologies, Shenzhen, Guangdong, China)进行核和胞质馏分分离[18］.

2.10.生物素RNA下拉分析

生物素标记的义或反义寡聚体BAIAP2-AS1与HepG2和PLC5细胞裂解液共孵育1小时。应用链霉亲和素偶联琼脂糖珠(Invitrogen公司，美国卡尔斯贝德公司)进行络合物的下拉。感觉探针包括5个 -（生物素-）ACTTGCATGGCTGCACGCATCCTCATAAGACG-3 ,5. -(生物素)CATCCAACCTCCAGAGACACCTGCGCCACA-3 ,和5 -（生物素-）AACCTCACGCGTCGATCGTCACCC-3 .反义探针包括5个 -(生物素)CCACTACTGACCTACGTATCCTTCAGCCACCC-3 ,5. -(生物素)ACCACTCCCTCAGTCAGTCCACGTCACAG-3 ,和5 -（生物素-）ACTCGTCACTGGTCACACATGTCAT3 .将分离的rna转录为cDNA, RT-qPCR检测BAIAP2-AS1和miR-361-3p水平。

2.11。染色质免疫沉淀(ChIP)试验

采用Magna ChIP试剂盒(Millipore公司，浙江杭州)进行芯片分析。将甲醛应用于HepG2和PLC5细胞，产生dna -蛋白交联。细胞裂解液经超声处理可产生200 ~ 300 bp的染色质片段。随后用特异性抗体对裂解物进行免疫沉淀。此外，以IgG作为对照。采用RT-qPCR检测沉淀染色质DNA。

2.12。荧光素酶报告分析

为了预测BAIAP2-AS1启动子中e2f1结合位点，我们搜索了jasper数据库[19］.然后，我们合成了BAIAP2-AS1启动子的不同片段序列。将上述序列插入pGL3-basic载体生成的载体与E2F1表达质粒共转染HepG2和PLC5细胞。

我们用mir- gl - baiap2 - as1 - wt、pmirgl - baiap2 - as1 - mut、pmirgl - sox4 -3共转染HepG2和PLC5细胞UTR-WT, pmirGLO-SOX4-3ut - mut报告质粒、NC模拟物和miR-361-3p模拟物。采用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega，浙江杭州)，测定荧光素酶的相对活性。然后，我们将收集到的数据归一化为Renilla荧光素酶活性。

2.13。免疫印迹分析

用1×十二烷基硫酸钠缓冲液制备细胞总裂解液。经SDS-PAGE分离后，将相同数量的蛋白置于PVDF膜上。首先用人GAPDH (ab8245)、E2F1 (ab4070)、SOX4 (ab243739)、E-cadherin (ab233611)、vimentin (ab92547)或N-cadherin (ab76011)特异性抗体进行印迹培养，然后用酶标二抗进行印迹培养。用TTBS冲洗印迹6次。然后，使用Beyo ECL Plus试剂进行印迹显影，使用凝胶成像系统记录图像。Abcam公司(中国上海浦东)提供所有抗体。将GAPDH (Rabbit anti-GAPDH)的表达数据归一化。

2.14。统计分析

采用SPSS统计软件包(标准版本18.0,SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行统计分析 除非另有说明，否则通过单因素方差分析和Student's检验确定两组或更多组的比较的统计显著性 -测试。 被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．baap2 - as1在HCC中上调

我们搜索了GEPIA，进一步发现在HCC标本中BAIAP2-AS1水平呈上升趋势( )与正常肝脏标本比较( )（图1（a））.此外，泛癌检测显示，BAIAP2-AS1过表达是多种肿瘤中常见的事件(图)1（b）)为了证实上述结果，我们在队列中进行了RT-qPCR，发现与匹配的非肿瘤标本相比，肝癌标本中BAIAP2-AS1的表达明显降低（图1（c）)我们还观察到与LO2细胞相比，BAIAP2-AS1在四种肝癌细胞系中的高表达（图1（d））.此外，我们还观察到BAIAP2-AS1在HepG2和PLC5细胞中的表达高于其他两种细胞。因此，我们选择HepG2和PLC5细胞进行进一步的功能实验。然后，我们使用GEPIA分析BAIAP2-AS1表达对存活时间的影响。如图所示1（e），我们未观察到BAIAP2-AS1表达与OS和DFS之间的关系( ）.

３.２．E2F1在HCC细胞中激活BAIAP2-AS1转录

大量研究报道了lncRNA在癌症中的失调;然而，这些分子调控不当的因素仍不清楚[20.,21］.越来越多的研究人员发现了一些关键转录因子对人类癌细胞lncRNA失调的贡献的证据[22,23]为了研究肝癌中BAIAP2-AS1上调的机制，本研究通过在线生物信息学软件JASPAR探索了BAIAP2-AS1的启动子区域，揭示了E2F1结合的六个潜在位点（图2（a））.然后，通过UALCAN检测HCC中E2F1的表达模式，发现HCC标本中E2F1表达增加，尤其是晚期HCC(图)2（b）和2 (c)）.基于TCGA数据集，我们还观察到HCC标本中E2F1表达与E2F1呈正相关(图)2 (d)）.我们还发现，与LO2细胞相比，5个HCC细胞系的E2F1水平升高(图)2 (e))为了研究E2F1的失调是否会影响BAIAP2-AS1的表达，我们过度表达或下调了E2F1的表达，并进行了RT-qPCR，结果表明，在E2F1基因敲除后，BAIAP2-AS1水平明显降低，而E2F1的过度表达则显示出相反的结果（图1）2 (f)和2 (g))随后对E2周围的内源性BAIAP2-AS1启动子区域进行的芯片分析表明，E2F1具有明显的结合活性（图2 (h)）.此外，荧光素酶报告基因检测显示，E2F1除E2位点(-1424 bp)外未与其他位点结合(见图)2(我)和2 (j)）.

３．３．抑制baap2 - as1可抑制肝癌细胞的增殖和转移

为了检测BAIAP2-AS1对肝癌生长的生物学影响，我们将sh-BAIAP2-AS1-1、BAIAP2-AS1-2或sh-NC转染HepG2和PLC5细胞。RT-qPCR证实sh-BAIAP2-AS1-1和BAIAP2-AS1-2处理后，HepG2和PLC5细胞中BAIAP2-AS1的表达水平明显降低(图)3(一个)）.因此，CCK-8检测结果显示，sh-BAIAP2-AS1-1和BAIAP2-AS1-2转染的细胞活力明显低于sh-NC转染的细胞(图)3 (b)）.此外，从菌落形成试验中发现，baap2 - as1敲低可缩短HepG2和PLC5细胞的克隆生存时间(图)3 (c)）.Edu试验也证实了BAIAP2-AS1敲低可抑制肝癌细胞的增殖(图)3 (d)）.用transwell侵袭法检测细胞的侵袭能力。与sh-NC组相比，sh-BAIAP2-AS1-1或sh-BAIAP2-AS1-2转染HepG2和PLC5细胞的侵袭能力明显降低(图)4(一)）.为了探究baap2 - as1影响肝癌细胞转移能力的机制，我们观察到在HepG2和PLC5细胞中，baap2 - as1的沉默促进了E-cadherin的表达，同时抑制了N-cadherin和vimentin的表达(图)4 (b))基于上述结果，BAIAP2-AS1被认为是肝癌的肿瘤启动子。

3.4.BAIAP2-AS1直接与miR-361-3p相互作用并抑制其表达

为了探究BAIAP2-AS1如何促进肝癌细胞的恶性表型，我们假设一种lncRNA的功能依赖于其亚细胞分布，在此假设下对其亚细胞定位进行了研究[24］.如图所示5(一个)，亚细胞分馏提示BAIAP2-AS1主要在细胞质中表达。根据StarBase v2.0软件发现，BAIAP2-AS1可能是BAIAP2-AS1的目标(图2)5 (b)）.荧光素酶报告基因检测显示，baap2 - as1 - wt和miR-361-3p模拟共转染显著抑制了荧光素酶活性(图)5 (c)）.在baap2 - as1 - mut和miR-361-3p抑制剂共转染时也观察到类似的结果。此外，baap2 - as1反义探针抑制miR-361-3p和baap2 - as1 RNA(图)5 (d)）.此外，来自HepG2和PLC5细胞裂解液的miR-361-3p也被全长BAIAP2-AS1 RNA富集(图)5 (e)）.抑制BAIAP2-AS1可促进miR-361-3p的表达(图)5 (f))然后，对其在HCC细胞和标本中的水平进行了研究，发现在HCC细胞中BAIAP2-AS1的表达水平明显较高（图5 (g))最后，发现miR-361-3p的下调导致BAIAP2-AS1的高表达水平，而其过度表达则产生相反的结果（图1）5 (h)）.

3．5．在HCC细胞中，BAIAP2-AS1调节miR-361-3p调节SOX4

上文揭示了BAIAP2-AS1对miR-361-3p表达的影响。随后，我们考虑了其功能。之前已经报道过SOX4参与HCC进展和miRNA靶向下游基因的能力[25,26］.在3SOX4的UTR，潜在的miR-361-3p结合位点被生物信息学工具证实(图)6(一)）.TCGA数据库结果显示，SOX4在HCC中高表达(图6 (b))此外，相关分析发现BAIAP2-AS1表达与SOX4表达之间存在正相关（图6 (c))我们还观察到，与LO2细胞相比，HCC细胞中SOX4表达的mRNA和蛋白质水平均明显增加（图6 (d)）.基于TCGA数据集的生存分析显示，SOX4表达越高，OS和DFS越短(图)6 (e)）.此前，SOX4已被证明是多种肿瘤的致癌基因，包括HCC。通过荧光素酶活性报告基因检测，验证SOX4是否是miR-361-3p的直接靶点。当细胞与miR-361-3p mimic和3共转染时，荧光素酶活性显著降低UTR-SOX4-WT记者向量。然而，细胞共转染3HepG2和PLC5细胞中的UTR-SOX4-MUT报告载体和miR-361-3p模拟物在这方面没有变化（图6 (f)）.当miR-361-3p过表达时，SOX4的表达在蛋白和mRNA水平均降低(图)6（g）).为了研究BAIAP2-AS1是否通过调节miR-361-3p/SOX4轴促进HCC的进展，我们进行了拯救实验。如图所示7(一)在HepG2和PLC5细胞中，miR-361-3p抑制剂可部分缓解baap2 - as1敲低对SOX4表达的影响。随后，我们进行了功能实验，发现被BAIAP2-AS1敲低抑制的HepG2和PLC5的增殖和侵袭能力被miR-361-3p下调部分挽救(图)7 (b)–7（e））.此外，我们还发现SOX4敲低可逆转miR-361-3p抑制导致的HepG2和PLC5细胞增殖和侵袭能力增强(图)8(一个)–8（c））.

4.讨论

许多HCC患者直到晚期才表现出明显的症状，在非洲和中国观察到越来越多的HCC发生率[27]临床资料表明，早期诊断和基于临床预后的个体化治疗可以提高许多肝癌患者的长期生存率[28,29]近年来，越来越多的研究表明lncRNAs可能成为肝癌患者预后和诊断的新的生物标志物[30.,31］.在HCC患者中发现了明显高水平的BAIAP2-AS1表达，表明它可能是HCC进展的调节因子。然而，TCGA数据集显示，BAIAP2-AS1表达异常并不影响HCC患者的OS和DFS。因此，这些结果应该得到更大规模的临床试验的证实。总的来说，我们的数据显示，BAIAP2-AS1可能是HCC患者的生物标志物。

尽管通过微阵列分析观察到许多lncRNAs在HCC中的异常表达，但其潜在机制仍不清楚。最近，与一些蛋白质编码基因一样，有报道称lncRNAs的转录受转录因子的调控[32］.例如，stat3介导的lncRNA HOXD-AS1过表达促进了肝癌细胞的转移[33]然后，我们搜索Jaspar数据库，重点关注E2F1，其得分相对高于其他调节因子。我们的研究组还观察到E2F1在HCC中过度表达，这与之前的研究一致。E2F1在调节lncRNA转录中的作用之前也有报道。随后，我们进行了荧光素酶表达分析orter分析和芯片qPCR分析，证实E2F1通过结合其启动子区域诱导BAIAP2-AS1的正转录的能力。根据文献和本研究的综合结果，转录因子的异常激活可能与肿瘤细胞中lncRNAs的过度表达有关。

越来越多的研究表明lncRNA可以影响肿瘤细胞的转移和增殖。然后，我们证实了在抑制baap2 - as1的作用下，肝癌细胞的增殖和转移受到抑制。有报道称EMT可能是肿瘤生长和转移的重要驱动因素[34］.Western blot结果表明，抑制baap2 - as1可抑制EMT通路的活性。这些发现表明，baap2 - as1在HCC中具有促进肿瘤发展的作用。为了进一步探索其分子机制，考虑到lncRNA功能依赖于其亚细胞定位，我们确定了其在HCC细胞中的定位。我们的结果证实了BAIAP2-AS1是胞质lncRNA，表明它可以作为microRNA海绵。生物信息学分析和荧光素酶报告基因技术提示BAIAP2-AS1可能与miR-361-3p结合。在许多类型的肿瘤中，miR-361-3p被观察到表现出一个降低的水平，并作为一个抗基因，包括HCC [35,36］.在我们的队列中，我们也观察到miR-361-3p水平在HCC中降低，并通过相关性分析发现其水平与baiap2 - as1呈负相关。因此，我们认为BAIAP2-AS1可能通过海绵作用miR-361-3p发挥其致癌作用。

一般来说，lncrna作为一种ceRNA，其功能依赖于mirna的mRNA靶标[37]因此，miRNA的靶向基因是调控网络的重要组成部分。使用StarBase 2.0，我们发现SOX4可能是miR-361-3p的潜在靶点。SOX4作为一种关键的发育转录因子，已被证明对祖细胞发育、细胞分化和干细胞具有调控作用[38,39］.此外，多个发育通路的活性也受到该基因的调控，如TGFβ、Wnt和PI3K信号[40］.在二十多种恶性肿瘤中，SOX4明显过表达，越来越多的功能实验显示SOX4是一种致癌基因[26］.在TCGA数据集中，发现SOX4在HCC中过表达，并预测HCC患者预后不良。此外，荧光素酶报告基因检测和Western blot检测证实SOX4是miRNA-361-3p的潜在靶点。为了进一步探究lncRNA是否通过mirna - 3161 -3p/SOX4的调控来调控HCC的进展，我们进行了抢救实验，发现当mir - 3161 -3p降低时，由BAIAP2-AS1沉默介导的SOX4表达抑制在一定程度上降低。此外，一系列功能实验表明，miR-361-3p敲低可缓解由抑制BAIAP2-AS1介导的肝癌细胞增殖和转移抑制。此外，SOX4敲低可逆转miR-361-3p抑制导致的HepG2和PLC5细胞增殖和侵袭能力增强。因此，baap2 - as1 - mir -361-3p- sox4整合通路为肝癌的发生提供了新的认识，提示了通过靶向baap2 - as1 - mir -361-3p- sox4轴的潜在治疗方法。

5.结论

本研究结果表明，在HCC细胞中，baap2 - as1被E2F1调节因子上调并激活。BAIAP2-AS1可通过海绵作用miR-361-3p和释放SOX4促进肝癌细胞的增殖和转移。这项研究为lncrna靶向肝癌诊断和治疗方法的发展做出了贡献。

数据可用性

在研究过程中生成的分析数据集可由通讯作者在合理的要求下获得。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

杨燕和徐爱霞做了概念化。杨燕和红歌负责方法论。葛洪和李德清负责统计分析。杨燕和李德清进行了调查。杨燕和徐爱霞负责写作。葛红和徐爱霞负责监督。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

本研究得到了潍坊市人民医院卫生与医疗合作创新项目（编号：20190107004）的资助。

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