致死性covid -19相关肺损伤中的中性粒细胞胞外陷阱

摘要

中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)的过度形成，此前被证明与细胞因子风暴和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)密切相关，并伴有普遍的内皮功能障碍和血栓形成，已被假定为影响严重COVID-19病理生理学和临床表现的一个中心因素。越来越多的血清学和形态学证据增加了这一假设，也涉及到潜在的治疗选择。在本研究中，我们使用免疫组化和组织化学方法在7例COVID-19患者的尸检肺组织中追踪NETs及其分子标志物。关键免疫形态学特征的量化使其能够与非covid -19弥漫性肺泡损伤进行比较。我们的结果加强和扩展了最近的发现，证实了NETs在严重受损的COVID-19肺组织中大量存在，特别是与肺泡毛细血管微血栓相关。此外，我们提供的证据表明，低密度中性粒细胞(ldn)特别容易发生NETosis，在很大程度上导致covid -19相关的肺损害，特别是血管阻塞。

1.导言

自首次发表关于新冠病毒-19临床特征的报告以来（例如[1])，越来越多的证据表明，中性粒细胞细胞外DNA诱捕器(NETs)对组织的破坏作用可使危重病例严重恶化[2］．可能与细胞因子风暴有关[3.- - - - - -5，危重型COVID-19患者出现的症状此前均被确认与NETosis密切相关(这是Barnes等人提出的一个主题)。[6]和Mozzini和Girelli [7])如严重的组织损伤、凝血障碍和肺屏障功能障碍[8］．大量促炎肽释放导致细胞因子风暴，如COVID-19 [9]，长期以来被认为是诱发NETosis(例如，[10])。

目前的证据表明，重度COVID-19是一种特殊的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)表型，经常表现为弥漫性肺泡损伤(DAD)，表现为内皮功能障碍和高凝状态[11- - - - - -22]先前的研究已经阐明了NETs在其他病因和其他炎症性肺病的ARDS肺泡和血管损伤中的中心作用[23，24]和血管内凝血和血栓形成[25- - - - - -35]，表明NETosis与ARDS之间可能存在病理生理学联系。

各种病因的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）先前已被证明伴有血清D-二聚体水平升高[36，但明显低于COVID-19，以及无细胞DNA [35]，两者都与NETosis密切相关(例如，[37])。因此，系统性NETosis和导致COVID-19微血管凝固的内皮功能障碍之间的潜在联系是非常有可能的。与此同时，新冠肺炎血清中发现了丰富的NETosis标志物，如细胞游离DNA、髓过氧化物酶(MPO-)相关DNA、瓜氨酸组蛋白H3 (citH3)，以及急性期c反应蛋白(CRP)和d -二聚体水平升高[38，39］．初步免疫组化数据进一步证实NETosis在covid -19相关肺损伤和血栓栓塞并发症中的作用[40- - - - - -42］．基于这一证据，net及其副产品在COVID-19发病机制和结果中的潜在影响作用现在正迅速得到接受，并已被考虑到COVID-19的治疗方法，如抗il6和IL26疗法(例如，[5，43- - - - - -45])。

本研究旨在加强和扩展上述发现。我们采用免疫标记和组织化学染色的方法，在7例COVID-19患者的尸检肺组织中追踪net形成细胞、net及其分子标志物。采用体视点计数对这些组织中的citH3+ NETs和citH3+中性粒细胞进行量化，还可以与非covid -19细菌性肺炎和DAD样本以及健康对照肺中的NETosis水平进行比较。

2.材料和方法

根据先前描述的安全协议，所有尸检均在瑞士巴塞尔大学医院病理研究所进行[18].用4%磷酸盐缓冲福尔马林（72 （室温下）并切成0.5-1份 cm矢状面旁切片。从每个肺叶的边缘和中心提取用于组织学分析的样本，随后脱水并包埋在石蜡中。目前的研究是在从具有良好特征的新冠病毒-19患者的上肺叶中选择的七个样本的组织宏观阵列上进行的（Menter等人队列中的1号至7号患者）[18]，女2名，男5名，年龄68-96岁;表格1)．通过解剖0.5 cm(即0.108 cm)等边三角形碎片构建组织阵列²)，并以类似Battifora所述的方式将这些碎片转移到受体阻断区[46］．来自年龄匹配的非COVID-19肺炎和ARDS死亡患者的直径为1mm的组织芯片芯用于citH3+ net和中性粒细胞的定量评价。这些参考标本包括5例细菌(肺炎链球菌)肺炎47]5例非新冠病毒相关性DAD[48]，以及5个无病理学的参考对照肺。

对于中性粒细胞酶MPO，染色质裂缝抗原相关细胞粘附分子CD66B和聚糖决定因子CD15 / Lewis X的染色质裂解标志物，以及人骨髓细胞的显着标记，后两者称为高度表达低密度中性粒细胞（LDNS）[49］．使用以下一抗:兔抗mpo(参考文献760-2659;兔抗组蛋白H3/瓜氨酸R2+R8+R17 (ab5103;Abcam, Cambridge, UK)，兔多克隆抗cd66b (ab197678;和单克隆抗cd15(克隆MMA, Ref. 760-2504;Ventana-Roche Rotkreuz、瑞士)。OptiView DAB IHC检测试剂盒，Ventana基准超自染色(含MPO和CD15)和ap标记的山羊抗兔IgG (ab97048, Abcam，英国;用citH3和CD66b)进行二次观察。组织化学普鲁士蓝染色(Perls染色)用于识别内源性铁(含铁血黄素)沉积的巨噬细胞。苏木精(与MPO和CD15)、Feulgen-Rossenbeck反应(与citH3和CD66b)和核坚贞红(与普鲁士蓝)作为核/DNA反染色。

使用ImageJ软件对citH3+ NETs和细胞核仍完整的citH3+细胞(后者假定为诱导NETosis的中性粒细胞)进行体视点计数。随机不重叠的微观场(最终尺寸) ）从citH3 Feulgen双染色宏观阵列样本（每个样本5个字段）和类似染色的参考样本（见上文）中提取。显微镜下的视野被数字地覆盖上一层规则的纹理 方形阵列测试系统;计算落在目标结构上的阵列交叉点并用于计算面积分数。使用非参数kruskal-wallis测试来评估杂交差异。

2．1．伦理批准

这项工作是在两个机构的合作下进行的，并得到了瑞士西北部和中部道德委员会（Ethikkommission Nordwest-und Zentralschweiz）的批准，项目ID 2020-00969，5月19日的决定^th，2020年（德文正式信函）。

3.结果

所有NETosis标记物的免疫组化分析在不同患者的组织样本之间产生了不同的结果，并证明信号不仅局限于产生细胞，而且还存在于二次播散的部位。

MPO的免疫染色显示广泛的中性粒细胞浸润主要在肺泡间隔间隙。在不同样本间，MPO+细胞在肺泡表面和肺泡腔内呈散在分布，在毛细血管内皮和其他小血管内壁聚集和/或排列(图)1(a))。在增生性弥漫性肺泡损伤(DAD)区域发现大量MPO+细胞聚集(图)1(b)和1(k))。大量透明膜沉积(图中星号)1(c)人口密度通常较低。在某些区域，MPO+细胞呈播散状，胞体呈大的卵形，包裹体呈斑点状或网状，部分包裹DNA(图中箭头所示)1(d)，详见图1(e))。在灶状和/或斑片状的情况下，细胞外部位也可以观察到mpo染色颗粒。MPO信号可在实质中不同部位的细颗粒沉积物或纤维网状结构中发现，通常与肺泡表面、肺泡间隔内层和毛细血管有关，显示侵蚀外观(图)1(f)和1(i))，微血栓中MPO+细胞间胶结(图1(g) -1(k))。根据以往的调查[50，51，我们假设这些形成与NETs的组织形态学相关。与MPO+细胞相似，透明膜上的沉积物几乎没有MPO+纤维物质的点缀。

图1

髓过氧化物酶(MPO)免疫染色(棕色)，DNA/细胞核苏木精反染色(蓝色)。(a)总览图像显示MPO+细胞中度肺泡间隔浸润，多为中性粒细胞来源;毛细血管和中等大小的血管(箭头)也有明显的聚集。(b)细支气管化肺泡中MPO+细胞的积累。(c) DAD中有一簇扩大的MPO+细胞，呈网状和颗粒状内含物(箭头)，旁边是透明膜的沉积物(星号)。(d)增大的卵圆形细胞，网状MPO+填充肺泡腔;邻近的纤维结构与附在MPO+材料(箭头)DNA染色，因此被认为是NETs。(e) (d)细胞的高倍放大:网状填充部分与DNA有关，并在周围磨损，因此也被认为是NETs。(f) MPO+细胞类似于(c-e)和受损肺泡间隔的游离NETs斑块(箭头)。(g) net形成细胞和net在血管中的聚集; note partial overlay of the MPO stain and the DNA counterstain (arrows). (h) MPO+ cells in microthrombotic capillary occlusions (asterisks). (i–k) Microthrombotic formations that consist entirely (i, j) or largely (h) of MPO+ cells ((h) in DAD tissue). Scale bars: (a) 100 μ10米,(e)μ和(b-d)和(f-k) 50μm。

citH3的染色模式与MPO的染色模式基本一致（也与下文描述的CD66b的染色模式一致）.整个肺部不同位置的单个或成簇细胞citH3染色呈阳性，表明PAD4介导的染色质解聚开始。与MPO类似，最常见的阳性染色部位包括肺泡隔（图2(一)和2(b))、血管壁(图2（c） –2(e))和血栓性闭塞(图2（c） –2（f） ）。一些血栓几乎完全由citH3+细胞组成（图2(d)和2(e))。与MPO和CD66b染色模式一致，citH3也经常在细颗粒和/或纤维状细胞外结构中发现，并经常与DNA染色有关，因此证实了我们的假设，即这些结构代表NETs(图中星号)2(f) -2(h))。与MPO一样，NETosis呈斑块状分布，另外在血栓内部发现并与血栓成分混杂(图中星号)2(e))。细胞内和细胞外的citH3含量特别高，在增生性DAD中同样可见(图)2(h))。

图2

瓜氨酸组蛋白H3 (citH3)免疫染色(深蓝色)，Feulgen法DNA/细胞核反染色(紫色)。(a, b) citH3+细胞(最可能形成net的中性粒细胞)大量分布于肺泡壁(箭头);网状DNA网状结构沿受损肺泡壁形成(星号)。(c)微血栓中的citH3+中性粒细胞。(d, e) citH3+中性粒细胞附着于并插入血管内皮(箭头);腔内的微血栓主要由网状DNA凝在一起的citH3+中性粒细胞组成((e)中的星号)。(f)带有含有citH3+细胞微血栓的闭塞血管外表面的NETs增生(星号)(箭头)。(g)被侵蚀的肺泡壁的网(星号)。(h)增殖DAD中citH3+中性粒细胞(箭头)和NETs(星号)的聚集。酒吧规模:50μm. (i, j)盒须图显示了citH3/Feulgen双染色COVID-19肺组织、非COVID-19细菌性肺炎和DAD参考标本以及病理正常肺中citH3+ NETs (i)和citH3+中性粒细胞(j)所占面积组分的四分位数范围和中位数(%)。

citH3+网络和中性粒细胞的量化结果表明，与对照组相比，新冠病毒-19肺中两个靶变量的患病率明显较高肺炎球菌肺炎和非Covid-19爸爸（P4，第139-144行和数字2(我),2(j))。citH3+ NETs在COVID-19和细菌性肺炎之间、核仍完整的citH3+细胞在COVID-19和非COVID-19 DAD之间、以及在两个目标变量均无病理的COVID-19和对照肺之间的差异具有统计学意义( 每个）。

所有样品中的大量细胞均针对CD66B和CD15染色。许多强烈表达这些粒细胞标记的细胞可能代表强烈易于Netosis的LDN [49]CD66b+和CD15+细胞的定位和分布反映了MPO+细胞的模式，尤其存在于肺泡壁和间隙中（图3.(一),3.(b),3.（e） ,，3.(h)和3.（k） ）、血管内和血管周围（图3.（c） ,，3.（d） ,，3.(f),3.(j),3.（k） ，及3.（l） ），在净相关血栓中（图3.（c） ,，3.（f） ，及3.(l))，偶见于肺泡间隙(图3.(e))。在增生性DAD样本中也发现了最大的CD66+细胞聚集(图)3.(f)和3.(m))。CD66b和CD15胞外染色丰富，形态与MPO基本一致，即在血管和肺泡壁显示弥漫性或纤维性包裹物(图中箭头所示)3.(f),3.(我),3.(j))和有斑点或网状物质的圆形斑块(图3.(g)和3.(n)可与MPO+中性粒细胞弥漫性残留相比较(参见图)1(d)和1(e))。一些血凝块几乎完全由强烈的CD66b+或CD15+细胞(即推测的ldn)组成，部分混杂了细胞外物质，同样显示出这些标志物中的一个阳性(图)3.(f)和3.（l） ）。

图3

用于低密度中性粒细胞（LDN）标记的免疫染色CD66B（深蓝色（A-G））和CD15（棕色（H-N）），DNA /核与Feulgen方法（紫色（A-G））和苏木精（蓝色（H-N））。（a）概述图像显示CD66b +细胞的分布;注意肺泡隔膜中的凝聚。（b）CD66B +细胞的肺泡隔膜渗透（大多数可能是LDN）;具有网状物的椭圆形细胞具有网状物CD66 +填充物，其在左上（箭头）处的肺泡空间中的DNA染色。（c）由CD66B +推定的LDN和网组成的微生物族。（d）凝结毛细管分岔旁边的净形成CD66b +细胞。（e）在肺泡空间中的CD66B +细胞聚集。（f）爸爸CD66b +细胞的广泛积累和微生物形成;血管墙壁（箭头）的网斑点。 (g) Large CD66b+ cell (presumably macrophage) in an alveolar space. (h) Overview image showing the accumulation of CD15+ cells in alveolar septa and the occurrence of such cells in vascular clots (arrows). (i) CD15+ NET-like extracellular material interstratifying an eroded alveolar septum. (j) NET-forming CD15+ cell (arrow) in an arteriolar microthrombus. (k) Top left: microthrombus exclusively formed by CD15+ cells (presumably LDNs); bottom right: “conventional type” microthrombus mainly consisting of anucleated material but interspersed with NETs surrounding a strong CD15+ cell. (l) Massive mural microthrombotic accretion of CD15+ cells in a medium-sized arteriolar vessel with tangentially sectioned wall. (m) CD15+ cells and NETs in proliferative DAD. (n) Alveolar spaces with enlarged ovally shaped CD15+ NET-forming cells (arrows) similar to those shown for MPO and citH3; nearby NETs costain for DNA and CD15 (arrowheads); NETs also abundantly intersperse wall tissues (asterisk). Scale bars: 50 μm。

七个样本中的六个样本还含有相关数量的不同大小的普鲁士蓝染色细胞（Perls染色）。普鲁士蓝染色的大细胞主要在肺泡中形成松散的群或簇（图4(一)-4（c）），但单细胞也被检测在室间石结表中，邻近血管（图4（d） ）普鲁士蓝染色颗粒也出现在圆形斑块中，这些斑块类似于扩张的中性粒细胞（图4（e） -4（g） ；比较数字1(d)和1(e)和数字3.(j)和3.（k） ）和不同位置的其他（较小）单元格（图4(h)和4（i） ）。还发现这些颗粒与细胞外物质混合，可能包括释放蚊帐的区域（图4（G））。

图4

普鲁士蓝(PB)染色，细胞核牢固红反染。(a)肺泡内单个大细胞(箭头)，胞浆包体呈斑点状，细胞核呈分叶状。(b, c)主要是肺泡中pb染色细胞和细胞外物质的链状聚集(血管血凝块均未染色)。(d) DAD中PB+细胞和细胞外颗粒沉积物散在被侵蚀的血管周组织和透明膜碎片中。(e-g)肺泡内呈圆形斑块，呈网状充填物和颗粒状PB+包体;(e, g)中的细节与图中放大的net形成细胞非常相似1- - - - - -3.（h，i）.肺泡中较小的PB+细胞，一个紧挨着一簇类似染色的颗粒沉积物（如（h）中的箭头所示），另一个在穿过肺泡壁时固定（如（i）中的箭头所示）。比例尺：（a–e）和（h，i）：50 μM， (f, g): 10μm。

4.讨论

根据先前的Covid-19肺分析（例如，[40])，免疫组化显示中性粒细胞浸润几乎所有的肺组织室，在肺泡间隔处加重（图1(一)和1（f） ，数字2(一)和2(b)和数字3.(一)和3.（b） ）和毛细血管内衬（图1(g),1(我),1(k);数字2(c);和图3.(c))，特别是增殖性DAD的积累(图1(b)和1(k);数字2(h);和数字3.(f)和3.(m))。后者的相关性不仅可以在有害的炎症环境中看到，还可以在其他病因的ARDS中看到，如酸诱导的肺损伤，表明中性粒细胞通过增强II型肺细胞增殖促进肺泡上皮再生[52］．目前的证据表明，网络的负面影响将远远超过任何可能的好处。事实上，MPO、citH3、CD66b和CD15的免疫染色明确显示在肺泡损伤部位存在大量的net和net生成中性粒细胞(如图)1（a） ；数字2(c)和2(g);和数字3.(b),3.(我),3.(n))和血管内凝血(图1(h),1(我),1(k);数据2（c） ,，2(e)2（f） ；及数字3.（c） ,，3.(j)3.(k)在COVID-19肺部。由此观察到的卵形细胞带有网状的MPO+， CD66+或CD15+ DNA包涵体(图)1(d)和1(e)和数字3.(g)和3.(n)与我们所知的排出net的中性粒细胞惊人地相似体外诱导研究(A.O，未发表的工作，图。S1在补充材料)。死亡前的血清学数据似乎也反映出NETosis的有害增强状态(见表)1)，特别是高水平的CRP和乳酸脱氢酶(LDH)(由[53])7名患者中有4名出现强中性粒细胞。

总之，这明显证实了我们最初的假设，即与covid -19相关的DAD和DAD总体上固有地涉及并可能因过度NETosis而恶化。原则上，这与与流感有关的DAD所显示的情况相似[23，54]及细菌性肺炎[32，55]然而，目前的形态学发现以及citH3的比较定量分析结果（图2(我),2(j))指出COVID-19中NETosis的潜在更严重的副作用。

目前的结果对COVID-19血栓炎症病理的影响似乎是多方面的。我们目前的观察为之前在COVID-19患者中发现的具有肺和其他器官血管功能障碍的DAD的发现提供了重要的进一步支持[13，16- - - - - -18］．证实所见微血管血栓并非简单的尸体血栓(凝血肝病杂志)但真正的微血栓来自于发现这些结构包含形成良好、免疫阳性的纤维蛋白铸型（5-20） μ米的尺寸[18]从血栓性微血管病的广泛临床证据来看，即使是在非致死性COVID-19中[56］．尽管微血栓并不是COVID-19的独有特征，而是DAD的潜在并发症，但我们的研究结果表明，COVID-19中此类微血栓的患病率要高得多。此前对同一队列的一项研究发现，在同一7名COVID-19患者中，受损肺组织的每个标准面积的肺泡毛细血管微血栓比流感患者增加了9倍[17］．结合文献中的几行证据(例如，由[12)，这支持了COVID-19与一种以极度高凝为特征的更特殊形式DAD相关的结论。

我们目前的研究提供了证据，证明COVID-19中的一些微血栓几乎完全由citH3+、CD66b+和CD15+细胞组成(图)2(d)和2(e)和数字3.（e） ,，3.(f),3.（k） ，及3.（l） ）并指出了高度易感LDN在新冠病毒-19血管凝血中的重要作用。该发现证实并进一步明确了Jiménez Alcázar等人的相关结果[57米德尔顿等人[41]，和Leppkes等人[40］．癌症研究的证据表明，ldn代表了不成熟和成熟变异的混合物，其比例随疾病背景而变化[58，59］．有人提出，不成熟的ldn实际上是一类骨髓源性抑制细胞，能够干扰T细胞-而成熟的ldn是通过一种依赖于宿主和/或病原体来源的因素的机制从正常密度中性粒细胞(ndn)转化而来的，因此同样获得免疫抑制特性[58，60]如结核病所示，LDN衍生的蚊帐可能通过增加NDN到LDN的转化而导致恶性循环[61]最近的天气学分析表明，人类LDN在多种情况下，如急性和慢性感染、炎症、癌症和妊娠，具有相当大的病理生理作用[62］．因此，ldn衍生的网络在COVID-19中的作用值得进一步研究。

普鲁士蓝染色的大细胞（图4(一)-4(c)和4(e))极有可能是含铁血黄素的巨噬细胞。它们的存在与COVID-19患者的支气管肺泡灌洗(BAL)分析结果一致[63］．同时在可能形成net的中性粒细胞中存在含铁血黄素颗粒(图)4（e） -4（g） ）和其他移动蜂窝（图4（i） ）和在不同的细胞外部位，这可能促使人们考虑SARS-CoV-2诱导的红细胞血红蛋白损伤的范围。事实上，肺泡巨噬细胞（以及可能的其他吞噬细胞）收集游离铁离子来自血红素卟啉的铁置换[63- - - - - -65］．需要注意的是，簇集的大普鲁士蓝+细胞与也出现在COVID-19肺部的巨大(伪)合胞体具有显著的相似性。由于它们对表面活性剂-A、甲状腺转录因子1和napsin A的染色，这些最近被归类为肺细胞来源[66］．与铁离子吸收的关系尚待确定。

4．1.组织取样注意事项

仔细检查选定的COVID-19组织样本，并使用相对较大碎片的宏阵列，而不是传统的组织微阵列芯(通常直径为1毫米，即0.785毫米)²)以及将对照组织切成三份，以防止由于组织微观不均一性导致的结果混淆。

5.结论

总体而言，我们的免疫检查结果证实并对近期Covid-19肺部的Netosis病症的组织病理学发现产生了相当大的扩展。网在各自的严重受损的呼吸系统组织和血栓形成血管闭塞中大量出现，通过福尔马林自发荧光无偏偏叠。我们的结果还明确支持LDN对Covid-19病理生理学的相关贡献，重点是血管阻断和微生物形成。进一步阐明潜在机制允许更多样化的嗜中性粒细胞异质性和Covid-19免疫失调的影响。

数据可用性

作者确认支持这项研究结果的数据可在文章及其补充材料中获得。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

Alexandar Tzankov和Walter Stoiber对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

这项工作得到了巴塞尔博特纳儿童健康研究中心（BRCCH）的支持。

补充材料

作为补充，我们提供了一个由三幅尚未发表的图片组成的小组（图S1A-C），这些图片来自我们之前研究过程中拍摄的扫描和透射电子显微镜（分别为SEM和TEM）体外网络的引入[51]这些图像记录了人类中性粒细胞在佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）刺激后释放网状细胞，其形态与我们在图中所示的充满网状物质染色的大椭圆形细胞非常相似1(d)和1(e)和数字3.(g)和3.（n）。SEM图像（图S1a，b）显示了一种不规则圆形的网，环绕其原产地（s1a）的静止紧凑剩余物，以及中性粒细胞的遗骸，在进一步的净化阶段，薄网径向向外突出并捆绑成尾部延伸部（S1B）。TEM图像（图S1c）通过与图1中的类似的电池从80nm水平部分取出。S1a。该电池显示出具有部分完整的外膜和具有部分保存的核膜的静止识别核。脱稠的染色质存在于细胞质中。用囊泡装饰的网螺纹附着在电池表面上。（补充材料）

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