一个特定的循环MicroRNA簇与阿霉素诱导的心脏毒性的晚期差异心脏反应相关在活的有机体内

摘要

背景．心脏毒性是抗癌药物阿霉素(DOX)的一种有害副作用，其特征是进行性心功能障碍。循环microrna (mirna)被认为是心脏病的潜在生物标志物;因此，我们的目的是在动物疾病模型中研究它们与晚期心脏毒性的关系。方法。20只C57BL/6雌性小鼠给予DOX或生理盐水24 mg/kg累积剂量，疗程2周，恢复1个月(T42)。基线和T42时进行超声心动图检查，T42时采集血浆。所有感兴趣的mirna通过文献综述和筛选进行筛选，然后进行RT-qPCR验证．结果。T42时的心功能分析表明，5只经dox处理的动物与对照组(CTRLs)无明显区别(NoTox)，而4只出现了心脏损伤(Tox)。我们的分析确定了8种功能障碍相关的血浆mirna。特别是，与CTRLs相比，miR-1-3p、miR-122-5p、miR-127-3p、miR-133a-3p、miR-215-5p、miR-455-3-p和miR-499a-5p被发现下调。相反，在Tox血浆样本中miR-34a-5p水平升高。值得注意的是，我们确定了一个由miR-1-3p、miR-34a-5p、miR-133a-3p和miR-499a-5p组成的聚类，以高精度Tox区分NoTox小鼠。结论．这是第一个研究表明，类似于在病人身上观察到的，给药的动物对治疗表现出不同的心脏反应。此外，我们的研究结果表明，血浆中存在特异性mirna，其表达反映了药物诱导损伤中存在心功能障碍。

1.介绍

阿霉素(DOX)是属于蒽环类药物家族的一种化疗药物。它目前被用于治疗几种类型的肿瘤，包括乳腺癌、白血病和淋巴瘤[1]，但其使用受累积剂量相关心脏毒性的限制[2］.事实上，患者可能会出现从轻度心室功能不全到严重心力衰竭的各种心脏症状，可能导致心脏移植[3.］.根据美国超声心动图学会和欧洲心血管造影学会最近的指南，心脏毒性被定义为左室射血分数(LVEF)下降大于10点[4］.很难预测哪个患者会出现这种损伤，因为它可能发生在治疗早期或用药后几年。因此，对于那些有心脏损害风险的患者，及时诊断发病功能障碍是至关重要的。目前，LVEF超声心动图监测、核成像和有需要时心肌内膜活检都被用于检测和监测心脏毒性[5］.不幸的是，这些技术都有一个局限性，包括对心脏损害发生的晚期诊断。在过去的几年里，为了早期评估和预测心功能不全的发生，研究了几种循环标志物。其中，心肌肌钙蛋白(cTn)和脑利钠肽(BNP)的敏感性和可靠性最高[6，但仍需要额外的工具来及时、准确地评估心肌损伤的严重程度和进展。

MicroRNAs (miRNAs)是一种小的(22-24个核苷酸)内源性非编码rna，通过抑制和/或降解靶信使rna (mRNAs)参与基因表达的转录后调控。它们的活动可以影响多种生物过程，如增殖、分化、发育和细胞死亡[7，它们的失调是各种疾病的原因，包括癌症和心脏病[8］.近年来，由于mirna在几乎所有体液(如血液、血清、血浆、尿液和唾液)中稳定表达，以及准确定量检测技术的发展，mirna可能成为几种疾病的特异性生物标志物[9］.特别是，几个小组研究了循环mirna在心血管疾病诊断和/或预后设置中的潜在用途，以便制定量身定制的治疗策略[10.］.有限数量的临床前研究聚焦于循环mirna与DOX心脏毒性的关系，主要是在治疗的急性期，目的是了解机制，而不是诊断[11.］.本研究旨在研究在小鼠模型中与dox诱导心脏损伤晚期相关的特异性血浆mirna。

2.方法

2．1.心脏毒性动物模型

C57BL/6雌性小鼠(Charles River Laboratories)， 10周龄，给予生理盐水(CTRL， ）盐酸阿霉素(DOX， ，累积剂量24 mg/kg, Sigma-Aldrich)，通过腹腔注射(4 mg/kg)，每周3次，持续2周，如以前报道的[12.］.雌性小鼠被选择来模仿女性乳腺癌患者。这项研究严格按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)《实验动物护理和使用指南》(Guide for The Care and Use of Laboratory Animals)的建议进行。该议定书得到了米兰大学动物实验伦理委员会和意大利卫生部的批准(批准号379/2015-PR)。在对照组动物中，死亡率为0%，而DOX治疗的一只小鼠在治疗结束两周后因不明原因死亡，并被从研究中移除。因此，经dox处理的小鼠最终数量为9。

2．2．心脏功能评估

治疗前采用Vevo 2100高分辨率成像系统(visualsonic)进行心功能超声监测(T0;基线)和第一次注射后42天(T42)(图S1)．麻醉诱导采用2%异氟醚(梅里亚)与100%氧气混合，在诱导室中进行2分钟。然后将小鼠以仰卧位放置在热垫上，并保持在37°C，以减少体温的波动。数据采集采用0.5%至1%异氟烷轻度麻醉小鼠，以维持心率≥450次/分钟。行二维短轴m型超声心动图，测量左室收缩期末容积(LVSV)、左室舒张末期容积(LVDV)、内收缩期末、舒张末期内径(LVSD、LVDD);计算左室射血分数(LVEF)和左室缩短分数(LVFS)。

2．3.血浆心肌肌钙蛋白和脑钠肽的评价

在血浆样本中测定心肌肌钙蛋白I ( ）在T42使用小鼠心脏Tn-I(高灵敏度)试剂盒(生命诊断)，按照制造商的说明。测定血浆样本中的血浆BNP ( ）在T42使用鼠标BNP-EIA试剂盒(RayBiotech)，按照制造商的说明。

２.４.样品收集

处死(T42)时，用CO麻醉动物₂服药过量导致颈椎脱位。然后，将血液收集到edta涂层的试管中，立即离心分离血浆，如前所述[13.]，置于−80°C下保存，直至再次使用。

2．5．总RNA净化

从200开始的RNA总净化 μ使用TRIzol (Life Technologies)按照修改后的协议进行血浆/样本的L测定[14.]对于液体标本。将RNA颗粒重悬于无RNase的水中。由于不可能从等离子体进行RNA定量，因此将样品储存在-80℃直至进一步使用。

2.6。MicroRNA筛选

采用TaqMan啮齿动物microRNA A阵列v2.0(应用生物系统)，按照制造商的液体标本方案，在T42位点进行miRNA表达谱分析。对每组4个血浆样本进行筛选。数据使用ExpressionSuite v1.0.3专用软件(Life Technologies)进行分析，采用全局归一化方法，所有Ct值为> 28的mirna均视为未表达。所有的mirna表现出≥2倍和a倍的变化选取值< 0.05进行单试验验证。此外，根据已知的与心脏病有关的mirna，还分析了一些额外的mirna [13.- - - - - -15.]: miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-499a-5p。

2.7。Single-miRNA化验

采用TaqMan Advanced miRNA cDNA synthesis kit (Life Technologies)从2开始进行MicroRNA反转录μL总RNA。根据制造商的协议，使用单个塔克曼先进的miRNA测定（Life Technologies）评估筛选筛选的表达水平。选择等离子体miR-27-3p作为标准化器基于筛选结果，如前所述[16.］.事实上，当用于规范化时，它在所有样本中都显示了强烈的表达，且组内变异性非常有限。这些观察结果也通过使用NormFinder (http://moma.dk/normfinder-software.)软件。

2.8。统计分析

结合评估的心功能参数(LVEF、LVFS、LVSD、LVDD、LVSV、LVDV)进行聚类分析，在无监督的情况下识别样本组。GENE-E软件(http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE-E/index.html)绘制热图和树状图。根据皮尔逊相关性计算出不同矩阵。采用三维多维尺度(MDS)评估选择的差异表达mirna的分辨能力;通过轮廓指数(aSI)的平均值来评价分组的优度[17.- - - - - -19.］.采用Kruskal-Wallis检验(GraphPad Prism 5软件)评估心功能参数的差异，采用双向方差分析评估miRNA表达水平的差异，考虑治疗反应和时间(T0和T42)作为变异性来源。采用Tukey后置测验评价各类别对之间的差异。“汽车”、“集群”和“统计”[20.R包就是为此目的而被利用的。值< 0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．阿霉素对小鼠的异质心脏毒性作用

为了鉴定与DOX的不良心脏反应相关的循环miRNA，我们通过在第一次注射后基线（T0）和42天（T42）进行心脏超声心动图的心脏毒性发作（图1)．特别是，心功能参数的无监督聚类分析表明，一些dox处理的动物在T42时对给药表现出异质性反应(图)2)．事实上，根据心脏功能数据，5只接受治疗的小鼠(NoTox)与对照组小鼠分组，而4只小鼠(Tox)与对照组小鼠和NoTox小鼠分组。值得注意的是，使用基线数据进行的相同分析表明，通过对6个心脏参数的定量分析，所有动物在DOX治疗前都分组在一起。不同的是，当考虑T42时获得的数据时，与NoTox和CTRL动物相比，Tox小鼠表现出心脏功能受损(图)3.和补充表1)．特别是，它们呈现LVEF和LVFs的显着降低，LVSV和LVDV的强烈增加，LVDD和LVDV中的中等升高。T0和T42之间的比较显着仅在Tox组中对DOX进行了不利影响。不同地，在实验的持续时间内，Ctrl和诺诺毒蛇动物在心脏功能上没有明显变化。Carciac肌钙蛋白I和BNP水平被测量为心脏损伤和T42的功能障碍指标。有趣的是，对于诺克克毒素或Tox动物的标记没有观察到Ctrl水平的变化（图S2)．

３.２．T42的血浆miRNA谱分析和验证

为了鉴定血浆中可能与长期dox治疗相关的mirna，我们对T42时的CTRL、NoTox和Tox样本进行了基于阵列的筛选。我们发现了14个mirna ( ）在所有组中(未显示)。特别的是，经过验证，8个mirna在其血浆表达中证实了显著的失调(图)4和补充表2)．有趣的是，与ctrl和NoTox组相比，Tox组中miR-1-3p和miR-499a-5p两种miRNAs表现出强烈的下降。不同的是，miR-122-5p仅在NoTox组降低(与CTRLs和Tox小鼠相比)，类似于miR-455-3-p(仅与CTRLs相比)。此外，miR-127-3p、miR-133a-3p和miR-215-5p在Tox组较CTRL组明显下调，而miR-34a-5p则上调。

３．３．基于循环mirna的dox受影响小鼠与不受dox影响小鼠的区别

这些结果促使我们研究dox调控的mirna是否可以用于区分药物影响和药物不影响的动物。因此，我们基于所有8个调控mirna的表达进行了多维尺度分析。如图所示5(一个)，根据计算出的平均轮廓指数(0.10)，该miRNA标记正确地区分了NoTox和Tox动物的CTRLs。然后，我们只在DOX动物上进行了相同的分析，以识别那些在Tox和NoTox小鼠之间具有最佳区分潜力的mirna。我们确定了一个由四种mirna (miR-1-3p、miR-34a-5p、miR-133a-3p和miR-499a-5p)组成的簇，在两组之间具有更好的鉴别潜力(aSI: 0.44)。确实，在受dox影响和未受dox影响的小鼠之间可以观察到一个完整的分区(图)5 (b))．

4.讨论

这是第一个研究表明，类似于癌症患者，动物模型对蒽环类药物治疗的反应并不相同。这项工作的主要发现是，在长期接触阿霉素后，循环mirna可以区分药物影响和药物未影响的动物。在临床实践中，最重要的dox相关问题是及时发现被治疗患者的心脏并发症，通常发生在用药后数年[21.］.事实上，正确识别出现心功能不全高风险的受试者对确保采取适当的干预措施至关重要[11.］.在我们的小鼠模型中，连续注射阿霉素引起心脏毒性。有趣的是，心脏功能不全的存在，尽管由一些心脏参数的改变提示，在长期恢复的动物中并不明显。因此，与以往的作品不同[22.，我们决定对心脏参数进行全面评估，以评估药物对治疗动物的真实影响。令人惊讶的是，我们的分析证明，在给药小鼠之间，对DOX的心脏反应存在显著差异。事实上，我们鉴定了一组动物显示没有或可忽略的功能缺陷(NoTox)，而另一组动物显示了药物引起的强烈心脏损害(Tox)。与这一观察结果一致，我们基于阵列的筛选导致了与对照相比，在Tox和NoTox动物中鉴定了几个调控的血浆mirna。有趣的是，我们仅在Tox动物的血浆中评估了dox诱导的miR-34a-5p上调。这一结果与之前的研究一致，表明在循环水平上miR-34a-5p增加[11.，尽管我们是第一个报道其在长期治疗释放后的调节。有趣的是，除了dox引起的心脏毒性[23.]， miR-34a-5p循环水平升高与心室重塑相关[24.]及出现心力衰竭[25.，26.心肌梗塞之后。此外，它的抑制似乎对心功能障碍有有益的效果[27.，暗示其可能作为生物标志物和治疗靶点进行临床开发。

一个有趣的发现是，在Tox组中观察到的miR-1-3p、miR-133a-3p和miR-499a-5p的失调，此前观察到的心脏损伤患者血浆中miR-1-3p、miR-133a-3p和miR-499a-5p升高[28.］.特别是，后者的循环表达此前已被证实与梗死期间的血浆肌钙蛋白水平有关[29.］.然而，令人惊讶的是，与CTRL和NoTox动物相比，这三种miRNAs在T42时在Tox动物中显示出强烈的减少，可能是因为治疗引发的反应机制。值得注意的是，在我们的实验中，我们没有观察到心肌肌钙蛋白I和BNP的血浆水平有任何扰动，这两者被认为是心脏毒性的最重要标志物[30.，31.］.但结果，这些结果似乎不是一个罕见的事件在活的有机体内研究[32.，我们不能排除技术限制在某种程度上影响了结果。

在其他调控的miRNAs中，之前只有miR-215-5p在慢性阿霉素治疗中被显示为“正”扰乱，尽管在不同的时间和给药量中发现它在大鼠心脏中上调[33.］.关于miR-127-3p，它在心脏生理和心脏毒性中的作用从未被评估，尽管在患有与肺损伤相关的急性胰腺炎的患者中发现它是下调的[14.，34.］.有趣的是，miR-122-5p和miR-455-3p仅在NoTox组中出现差异表达，同样可能是因为在Tox动物中心脏功能障碍引发了一些未知的影响。值得注意的是，尽管血浆miR-122-5p被认为是肝脏特异性的，但已经有报道称其在心血管疾病中受到负调控[35.］.至于miR-455-3p，它被证明是鼠模型中肥大的增强子，但同时，它降低了左心室功能的渐进性劣化[36.，37.］.

这项工作的主要新颖之处在于鉴定了一种miRNA标记，它能有效地将受药物影响的小鼠与未受药物影响的小鼠和对照组小鼠分离开来。事实上，一整套dox调控的mirna在区分动物的三个“功能”组时显示出了良好的准确性。然而，我们的分析表明，并非所有dox调控的mirna都是正确分离动物群体所必需的。值得注意的是，由DOX调控的8个循环mirna中的4个组成的子签名表明，足以从NoTox动物中正确识别Tox。

应该承认这项工作的一些局限性。由于我们使用的是健康动物，因此无法评估肿瘤对miRNAs的血浆组成的贡献以及癌症可能的有害系统影响。事实上，包括miR-34a-5p在内的一些循环mirna的表达被一些肿瘤所影响[38.]但我们决定将注意力集中在“清洁环境”中药物的心脏作用。尽管如此，我们的结果部分与癌症患者进行最近调查的人部分重叠（至少适用于MIR-1-3P）[14.，尽管我们知道，在我们的动物模型中评估的时间框架与在临床研究中评估的时间框架不能相提并论。我们意识到，由于只关注雌性老鼠，我们的发现在一定程度上削弱了力量。然而，由于我们的目的是模拟女性乳腺癌患者，我们认为在我们的研究中纳入男性受试者可能会导致不必要的混杂变量的增加。由于发情周期未被评估，因此不能排除对这里所描述的心脏毒性过程的可能影响。女性生殖激素被认为与心脏保护状态有关;然而，尽管已经提出了可能的潜在机制，但没有研究阐明在发情周期的特定阶段心脏组织的潜在变化。评估动情周期激素波动对心脏组织重塑的影响超出了我们的目标，我们认为这一课题值得进行具体的研究。此外，除了基线和长期数据，我们没有评估治疗急性期的mirna和心脏功能参数。事实上，我们决定关注随访期，这通常是心脏毒性发作的最关键时期，也是之前从未在动物模型中研究过的时期。此外，还需要进行以患者为基础的调查，以验证我们的发现是否可以应用于临床。 Anyhow, we demonstrated, for the first time, the existence of a heterogeneous cardiac functional response to DOX over time, which is reflected by variation of expression of specific clusters of circulating miRNAs.

数据可用性

在当前的研究中生成和分析的筛选数据集可从相应的作者要求。

的利益冲突

两位作者宣称没有相互竞争的利益。

致谢

作者要感谢Elena Sommariva博士，Chiara Vavassori和Veronica Ricci对手稿的重要修改。这项工作得到了意大利卫生部给Y. D.的GR-2011-02346742赠款(Ricerca Finalizzata)的支持。

补充材料

补充1．补充图S1:超声心动图。该小组描绘了CTRL组、NoTox组和Tox组在T0(左)和T42(右)处具有代表性的三幅二维短轴超声心动图(m模式)。T0时各组间无差异，而Tox组在T42时出现功能障碍迹象。

补充2．补充图S2：血浆肌钙蛋白I和BNP水平。在Ctrl（蓝杆）和诺曲克诺克斯（绿杆）和Tox（红色棒）动物中测量等离子体TNI和BNP水平（ ）T42。各组之间没有观察到差异。值表示为平均值±SD。

补充3．补充表S1:治疗动物和对照动物的心功能参数已执行比较的值。参数值表示为mean±SD。

补充4．补充表S2：折叠调节MIRNA的数据。值表示为平均值±SD。

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