GWAS编码snp的复制表明MMEL1是沙特阿拉伯乳糜泻患者的潜在易感位点

摘要

乳糜泻(CD)是一种麸质不耐症，欧洲人有57个遗传易感性位点，但在文化和地理上不同的民族人群中，如沙特阿拉伯的乳糜泻患者没有遗传易感性位点。因此，我们根据IRAK1中的Phe196Ser、SH2B3中的Trp262Arg和MMEL1中的Met518Thr三个基因多态性对沙特阿拉伯CD患者和健康对照进行了基因分型。单基因座分析发现，518 Thr/Thr (MMEL1)基因型携带者的疾病风险比非携带者高1.6倍(OR = 2.6;95%置信区间:1.22—-5.54;）.这种显著性甚至在等位基因(OR = 1.55;95%置信区间:1.05—-2.28;)和添加剂（OR=0.35；95%CI:0.17-0.71；)遗传模型。然而，Trp262Arg (SH2B3)和Phe196Ser (IRAK1)多态性的频率在患者和对照组之间没有显著差异。总体最佳MDR模型包括Met518Thr和Trp262Arg多态性，其最大检测准确率为64.1%，最大交叉验证一致性为10 / 10 (）.MMEL1中518 Thr/Thr多态性的等位基因分布主要表明其对沙特患者CD易感性的独立和协同作用。在沙特阿拉伯患者中缺乏IRAK和SH2B3基因多态性的显著相关性，但它们在欧洲组中的相关性表明CD的遗传异质性。

1.介绍

乳糜泻(CD)是一种t细胞介导的炎症性疾病，其潜在的自身免疫、遗传和环境因素[1，2]．这种慢性肠病是由于基因易感儿童和成人对从小麦、大麦和黑麦中摄入的麸质永久不耐受引起的[3.- - - - - -5].CD患者常见的临床表现为慢性腹泻、腹胀、发育不良和身材矮小[4，6]．白种人中大约1%的乳糜泻患病率使他们成为最易患乳糜泻的民族。然而，目前对乳糜泻患病率、临床和诊断特征的认识的提高表明，乳糜泻不仅在欧洲常见，但在发展中国家，小麦是主要的膳食成分[4，7]．在中东，最近的趋势表明，低风险人群的乳糜泻患病率为0.14% - 1.17%，高风险人群的患病率为2.4% - 44% [8- - - - - -10]．

乳糜泻是一种复杂的病理学，其发病由多种遗传因素控制。CD的遗传易感性表现为较高的家族发病率以及与某些人类白细胞抗原（HLA）2类等位基因的紧密联系[11]．多态HLA-DQ2和/或HLA-DQ8等位基因已被确定为乳糜泻发生的先决条件，但它们单独不能证明乳糜泻的发生。因此，非hla基因位点可能在乳糜泻易感性中发挥作用。全基因组关联研究(GWAS)和随后的免疫芯片精细定位研究在将腹腔疾病风险位点(包括HLA和非HLA)降至57个snp方面取得了重大突破。所有这些风险位点只能解释高达54%的乳糜泻风险在某些病例组中乳糜泻的遗传风险因素无法解释[12- - - - - -18]．

对于像乳糜泻这样的复杂性状，在推导基于基因型-表型关联的GWAS时，遗传学家面临的一个常见并发症是，大多数这些研究是在欧洲患者中进行的，因此他们错过了文化和种族不同的疾病群体中的人群特异性遗传效应。此外，GWAS样本还包括对疾病相关信号有不同贡献的非均匀对照队列。大多数SNPs位于内含子或调控区域，它们没有容易注释的基因功能，因此不能被分配到特定的生物学途径，这使得预测疾病相关GWAS位点的临床相关性变得更加复杂。相反，发生在编码区域的SNPs往往能够改变多肽的氨基酸序列，从而导致编码蛋白的结构和功能改变，从而改变细胞功能。Trynka等人揭示的一个重要发现[16]，即在57个与乳糜泻相关的基因位点的功能注释中，只有IRAK1中的rs1059702、SH2B3中的rs3184504、MMEL1中的rs3748816这3个基因变异发生在外显子区，并影响相关蛋白的氨基酸序列。

从统计相关的CD-GWAS基因座中临床确定真正的疾病原因遗传变异需要来自群体特异性复制研究的数据。人们一致认为，在大多数近亲的阿拉伯群体中进行遗传研究具有识别新的遗传联系的巨大潜力，也可能缩小遗传联系的范围降低复杂疾病中实际疾病相关基因的数量。据我们所知，迄今为止，还没有研究检测沙特裔患者中乳糜泻基因变异的贡献。因此，目前的研究旨在复制三种氨基酸替代SNPs的关联通过精细定位GWAS基因座，对欧洲人群的结果进行了分析，以质疑其在沙特阿拉伯患者CD发展中的意义。

2.方法

2．1．主题和抽样

目前的研究获得了吉达阿卜杜勒阿齐兹国王大学医院研究伦理委员会的伦理批准。研究参与者包括沙特阿拉伯人，其中97人是不相关的乳糜泻患者，124人是自我报告的健康对照组，他们从未报告任何健康并发症，包括过敏。乳糜泻的诊断是通过检测抗麦胶蛋白和肌内膜抗体(EMA)或组织转谷氨酰胺酶(TGA)，以及根据欧洲儿科胃肠病学、肝病和营养学会(ESPHGAN)制定的标准进行确认性小肠活检。在征得每位参与者的同意或批准后，采集2 mL血液样本用于基因分析。

2．2.基因分析

根据制造商的说明，使用DNA血液迷你试剂盒(QIAamp, Qiagen, Inc.， Valencia, CA, USA)从全血样本中分离DNA。在ABI7500HT序列检测系统(Applied Biosystems)上，使用商业化的TaqMan等位基因鉴别试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)对三个snp rs1059702、rs3184504和rs3748816进行基因分型。TaqMan探针标记如下:VIC染料(绿色荧光团)对应野生型等位基因，FAM染料(蓝色荧光团)对应突变型等位基因。扩增周期中绿色荧光的发射表明为等位基因固有型，蓝色为等位基因突变型，蓝色和绿色荧光的结合表明为异等位基因状态。根据FAM或VIC信号对应的每个样本自动计算的阈值周期值，绘制散点图。10μL反应混合物由5μL TaqMan基因分型主混合物（包含AmpliTaq Gold DNA聚合酶UP（超纯）、不含dUTP的dNTPs、被动参考ROX染料和优化混合组分），0.25 μL TaqMan SNP基因分型分析(每个特异性寡核苷酸引物300 nM, MGB探针200 nM)μL DNA (50 ng/μL)在微安培光学96孔反应板中进行。PCR条件为60°C 1 min和95°C 10 min，然后95°C 15 s和60°C 1 min的40个循环。使用SDS版本2.3软件进行基因分型。

２．３．统计分析

使用GraphPad QuickCalcs 6.0版（美国GraphPad软件公司）在线统计软件进行统计分析。对于每个SNP，计算乳糜泻患者和对照组的等位基因和基因型频率。使用Pearson标准卡方检验、优势比（OR）和95%置信区间（CI）确定等位基因和基因型的统计显著差异。Hardy-Weinberg平衡在观察到的与预测的基因型分布的列联表上用一个自由度的卡方检验进行了检验。使用开源多因素降维（MDR）软件（MDR版本2.0 beta 5，http://www.epistasis.org/）.通过1000个排列检验(MDR排列检验模块0.4.9 alpha)进行统计学显著性检验，将观察到的检验准确性与原关联原假设下的预期检验结果进行比较。一个0.05的值被认为具有统计学意义。

3.结果

我们的研究组包括57名青少年和40名儿童乳糜泻患者。疾病组的性别分布显示女性(54%)略高于男性。成人发病的平均年龄为几年后，在儿童身上也是如此对照组由140名成年人组成，他们的平均年龄为年。乳糜泻患者常见的临床症状如下：慢性腹泻（82%）、厌食症（80%）、腹胀（75%）和腹痛（31%）。CD组出现的自身免疫性疾病包括1型糖尿病（32%）、自身免疫性甲状腺炎（8%）和系统性红斑狼疮（3%）患者组中出现的其他非自身免疫介导的疾病为骨软化症（5%）、癫痫症（4%）和唐氏综合征（4%）。

关于基因分型结果，在CD患者和对照组中，所有三个测试SNP（rs1059702、rs3184504和rs3748816）均符合Hardy-Weinberg平衡。在本研究中，乳糜泻患者中IRAK1 rs1059702 SNP的AA（Phe/Phe）、AG（Phe/Ser）和GG（Ser/Ser）基因型频率分别为23.71%、24.74%和51.54%（表1）1）.

A的次要等位基因频率为36.08。然而，乳糜泻患者和健康对照组在基因型分布方面没有显著差异()和等位基因分布()(表2)对于SH2B3单核苷酸多态性，当测试隐性和显性疾病风险模型时，发现两个研究组之间TT（Trp/Trp）、TC（Trp/Arg）和CC（Arg/Arg）基因型以及T（Trp）和C（Arg）等位基因的频率没有显著差异()MMEL1 rs3748816 SNP中编码Met/Met（TT）、Thr/Met（TC）和Thr/Thr（CC）的基因型表明，在乳糜泻患者（25.77%）和对照组（12.09%）之间，Thr/Thr基因型存在显著差异[；或(95% ci) = 2.60(1.22-5.54)]。与这一发现相对应，主导模型分析也揭示了Thr/Thr基因型与蛋氨酸/Met +Thr/Met基因型与乳糜泻风险之间的显著关联[，或（95%CI）=0.35（0.17–0.71）]。与对照组相比，乳糜泻患者的Thr次要等位基因C编码显著较高[，或(95% ci) =1.55(1.05-2.28)]。

为了进一步阐述我们的基因型发现，应用MDR分析来描述病例和对照组的高阶基因-基因相互作用3.总结了三种多态性组合的详尽的MDR分析结果，研究了乳糜泻风险的发展。最好的模型将伴随着它们的测试准确性、交叉验证的一致性和由排列检验确定的显著水平。MDR结果显示MMEL1 (c.1553T > C;p.Met518Thr)和SH2B3 (c.784T > C;p.Trp262Arg)多态性为总体最佳模型，检验准确率最高为63.18%，交叉验证一致性最高为10 / 10。该模型在0.0156水平显著。这些结果加强了我们单基因位点分析的重要结果，即MMEL1是沙特阿拉伯人群中CD发展的危险因素。

4.讨论

最近的GWAS研究表明在乳糜泻易感性中有很多基因位点[12，13，17，19].然而，遗传变异（在等位基因频率和连锁不平衡方面）和环境因素（在饮食模式、酒精和吸烟方面）由于不同种族和地区之间的差异，导致对乳糜泻易感性SNPs的关联性缺乏共识。因此，在本研究中，我们研究了MMEL1、IRAK1和SH2B3基因中三种非同义多态性的关联性，以提高识别假定等位基因的可能性对沙特阿拉伯人群的乳糜泻风险易感性产生功能性有害后果。主要发现是MMEL1中的rs3748816对沙特阿拉伯血统患者的乳糜泻易感性有显著影响。尽管IRAK1和SH2B3的等位基因和基因型频率为患者和对照组之间存在显著差异，MMEL1和SH2B3基因之间存在潜在的协同效应，加强了MMEL1在乳糜泻易感性中的重要性。患者和对照组中三种检测的遗传多态性与Hardy-Weinberg平衡的符合性表明我们的结果不一致基因分型错误或群体分层可能会导致偏误。

人类MMEL1基因编码一个II类跨膜蛋白(779个氨基酸)，属于金属内肽酶家族，目前已知该基因普遍表达。该基因位于1号染色体上，大小达0.4 MB，有24个外显子。基因多态性rs3748816位于MMEL1的第16外显子，具有“T”等位基因编码(ATG)为非极性疏水性氨基酸蛋氨酸和风险“C”等位基因编码(ACG)氨基酸位置518的极性亲水苏氨酸。根据计算程序多态性表型(PolyPhen)，这种变化被预测为“可能具有破坏性”[20]．该氨基酸变体位于靠近MMEL1蛋白肽酶家族M13 n端结构域的α螺旋区域。MMEL1蛋白与金属内肽酶家族的其他成员似乎参与了神经肽降解[21]最近的GWAS和后续病例对照研究已确定MMEL1基因与类风湿性关节炎（RA）易感性的关联[22- - - - - -24]．

越来越多的证据表明，自身免疫性疾病，如乳糜泻和类风湿关节炎，至少有10个共同的遗传易感性位点[25]．在这些重叠位点中，rs4648562 ()导致相关转录本的剪接位点改变。虽然乳糜泻和类风湿关节炎在本质上是不同的疾病，但它们有共同的特征，如与HLA状态、靶器官t细胞浸润和自身免疫抗体的发展有关。目前还不清楚这种基因在谷蛋白敏感中起什么作用，如果它确实是一种疾病相关基因的话。TNFRSF14 (rs2234167)是一种乳糜泻的强候选基因，其下游小于60 kb处于强连锁()MMEL1的rs3890745进一步增加了其间接参与乳糜泻的可能性[26]然而，需要进一步涉及反向遗传学的工作，以充分确定该基因的功能，并确定MMEL1基因中的致病多态性如何在乳糜泻生物学中发挥作用。

尽管IRAK1（rs1059702）和SH2B3（rs3184504）非女性遗传多态性在统计学上与CD无关，但这并不意味着它们不是沙特阿拉伯患者中真正的疾病易感基因座。独立地，这两个基因座存在强连锁关系[通过LD评分；白种人乳糜泻发病的基因关键区域[14]。在12q24（Chr 12:111833788至Chr 12:111932800）的rs3184504的任一侧（至少0.2MB）存在候选基因，如RNA处理因子ATXN2和核定位抑制剂BRAP，它们在亚临床炎症和淋巴细胞活性调节中起作用[27]，并且它们以前与CD易感性相关[13]的确，rs3184504被认为与CD患者肠粘膜中SH2B3的表达状态有关[28]值得注意的是，这种多态性涉及蛋白质功能上重要的结构域中的氨基酸替代R262W，已知该结构域处于积极的自然选择之下，对有效响应外源抗原至关重要[29]．rs3184504在沙特患者中缺乏显著相关性，但在欧洲组中存在相关性[13，16，19提示乳糜泻的遗传异质性。

我们承认在解释目前的研究结果时存在一些局限性。首先，我们只筛选了3个非同义遗传多态性，没有涵盖剩余的50多个SNP（非编码SNP）通过密集的基因分型研究报告。第二，三个相关遗传标记及其连锁遗传区域的缺失基因表达数据，而不是其自身的等位基因或基因型频率，可能确实是乳糜泻发病机制中真正的致病因素。然而，复杂疾病的生物学特性肯定非常复杂比直接的SNP改变基因功能疾病关系更复杂，我们在仅基于统计关联提出乳糜泻致病基因和致病机制时必须非常谨慎。第三，本研究的样本量不足以得出明确结论，因此我们的发现可以推广到所有阿拉伯人群因此，为了验证GWAS的发现是否有助于确定与乳糜泻相关的病因遗传标记，我们建议进一步开展涉及更大人群、广泛SNP覆盖率分析和体外功能研究的研究。

5.结论

总之，本研究首次报告了MMEL1 518 Met/Thr多态性在沙特阿拉伯人中对乳糜泻风险的影响，无论是单一还是协同SH2B3基因标记。综上所述，我们的研究结果在沙特阿拉伯半岛地理和文化上不同的人群中复制欧洲特有的CD遗传易感性位点方面产生了混合的结果。根据我们的结果，本研究进一步强调了识别群体特异性遗传易感性位点的重要性，以获得可复制的稳健结果。特别是，考虑到沙特阿拉伯等人口饮食习惯的变化以及大量的膳食麸质成分，GWAS基因座关联的复制是相关的。为了更好地理解CD特异性GWAS基因座的临床意义，本研究将进一步建立背景数据，以进一步研究MMEL1可能参与乳糜泻发生的机制。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

Omar I. Saadah和Noor Ahmad Shaik也做出了同样的贡献。

致谢

所有作者真诚地感谢Al-Jawhara Al-Brahim公主遗传疾病卓越研究中心(PACER-HD)为本研究提供的实验室后勤支持。作者对Sana Khadir女士在与患者和对照组协调取样和临床数据收集方面所做的友好努力深表感谢。这项工作是由阿卜杜勒阿齐兹国王大学科学研究系主任(DSR)资助的。hici - 1434 - 140 - 1。因此，作者感谢DSR的技术和资金支持。

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