线粒体atp敏感K+通道开放通过激活PI3K/AKT信号通路增加哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖

摘要

气道平滑肌细胞（ASMC）的异常增殖导致气道重塑和哮喘的发育。本研究旨在评估线粒体ATP敏感k +（MITOK_atp.)通路通过调控哮喘大鼠asmc的3-磷酸肌苷激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)通路调控asmc的增殖。用含卵蛋白明矾免疫48只sd大鼠，建立哮喘模型。采用相衬显微镜和免疫组化染色对asmc进行分离鉴定α-smooth肌肉肌动蛋白。ASMC用米托克的强化活化剂治疗_atp.二氮氧化合物，或一种mitoK抑制剂_atp.，5-羟基二癸酸（5-HD）。Rhodamine-123（R-123）用于检测线粒体膜电位（δψ采用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基溴化四唑)法检测asmc的增殖情况。western blot和实时荧光定量PCR检测AKT和p-AKT蛋白和mRNA的表达。结果表明，重氮增强了mitoK_atp.5-HD对哮喘模型大鼠ASMCs通道开放有抑制作用。重氮可促进哮喘模型大鼠ASMC增殖，而5-HD可减轻ASMC增殖。然而，PI3K/AKT通路抑制剂LY294002逆转了重氮在哮喘模型大鼠ASMCs增殖能力中的作用。重氮处理可诱导AKT磷酸化，5-HD处理可降低哮喘模型大鼠asmc中AKT磷酸化水平。总之，mitoK_atp.在哮喘模型大鼠中，通道打开通过激活PI3K/AKT信号通路增加asmc的增殖。

1.介绍

以气道重塑、慢性气道炎症和气道高反应性为特征的哮喘是全世界人类的主要威胁[1，2］．气道重塑主要表现为上皮-间充质转化、粘膜细胞上皮化生、粘液分泌过多、基底膜增厚、胶原沉积、气道平滑肌细胞增生等[3.- - - - - -6］．当受到细胞外因子刺激时，asmc执行收缩功能并进行表型转化[7］．根据以往的研究，ASMC增殖参与了重度哮喘患者的气道重塑和不可逆气道阻塞[8］．

线粒体atp敏感钾(mitoK_atp.）通道是在多个细胞中发现的重要膜蛋白，并且已在许多类型的细胞中进行广泛研究，例如神经细胞，平滑肌细胞，心肌细胞和骨骼肌细胞。它们的细胞功能包括生物电性活性和细胞能量代谢[9，10］．之前的研究表明mitoK_atp.通道激活强烈地调节线粒体膜电位(ΔψM)防止线粒体通透性转变，从而在缺血/再灌注过程中保护线粒体[11］．然而，只有少数研究考虑了mitoK的作用_atp.ASMCs在哮喘中的增殖能力。最近的研究表明，人肺动脉平滑肌细胞和ASMCs的增殖能力，除了表型转化和气道重建外，可能受到mitoK开放的调控_atp.频道和δ的去极化ψm [12，13］．然而，潜在的机制仍不清楚。

的phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B (PI3K/AKT) pathway mediates various targets (e.g., glycogen synthase kinase-3, mammalian target of rapamycin, phosphodiesterase-3B, and insulin receptor substrate-1) to regulate cellular survival, growth, and proliferation through many mechanisms [14］．该信号传导途径在炎症细胞募集中起着至关重要的作用，调节炎症介质的表达和活化，以及慢性炎症呼吸道疾病中的气道重塑，免疫细胞功能和皮质类固醇不敏感性[14］．此前的一项研究表明PI3K/AKT通路在哮喘患者分离的ASMCs增殖中发挥了重要作用[15］．

这项研究的目的是确定mitoK_atp.频道在ASMC的增殖能力中起作用作用作用，并且该作用是与PI3K / AKT信号传导途径有关，为寻找治疗哮喘治疗的新靶点提供研究依据。

2.材料和方法

2.1。生成哮喘大鼠模型

本研究采用48只雄性SD大鼠(体重250-350 g)，在温度-(22±2°C)和湿度-(45-60%)控制的环境中进行12小时的光/暗循环。这些动物可以随意获得食物和水。这些大鼠被平均分为哮喘组和对照组。哮喘组大鼠在第0天和第14天腹腔注射10%卵清蛋白(OVA)加明矾，而对照组大鼠腹腔注射生理盐水[16］．哮喘组大鼠随后用OVA气溶胶(1% PBS;30 min/d)，连续7天。对照组大鼠用生理盐水致敏作为对照。实验经我院伦理委员会批准，按照动物护理使用指南进行。

２.２.ASMC准备和培养

从哮喘和对照大鼠的组织中分离出主要ASMC。通过组织消化与由1mg / ml胶原酶I，10mg / ml BSA的溶液组成的溶液分离平滑肌，并在37℃下将10mg / ml BSA和1mg / ml毒蛋白纸组成15 min. The separated cells were then cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) containing 20% FBS and seeded in cultured flasks with 10% FBS-DMEM. They were passaged when they reached 80–90% confluence [17］．采用第3 ~ 6代asmc进行试验。从哮喘大鼠模型中获得的asmc分为:(i)哮喘组;(ii)哮喘+重氮组，接受额外的重氮治疗(选择性mitoK_atp.通道开孔器)(DMSO稀释;100年μmol / L);(iii)哮喘+ 5-HD组，接受额外的5-HD(5-羟基癸酸盐，选择性mitoK)治疗_atp.通道阻断剂)(DMSO稀释;500年μmol / L)。

将正常大鼠的asmc分为正常组、正常+重氮组、正常+ 5-HD组，如上所述。

２.３.asmc的识别

采用相衬显微镜图像识别ASMCs的特定形态学特征。免疫组化染色鉴定asmcα-smooth肌肉肌动蛋白。

2.4。罗丹明荧光的测量

培养ASMCS在装载罗丹明-123的六孔板中培养并生长（R-123; 10 μg/mL)， 37℃避光孵育30分钟。R-123荧光在静息Δ处猝灭ψm，当线粒体膜去极化并被线粒体选择性吸收时，R-123荧光量增加，表明R-123荧光量与Δ呈线性相关ψm.经二氮或5-HD处理后，将asmc中未吸收的R-123用D-Hanks溶液冲洗，确保其不影响荧光强度。在488 nm处激发荧光，在530 nm处用激光共聚焦显微镜检测荧光。使用HPIAS-1000图像分析仪对结果进行分析。

2．5．MTT试验

将asmc培养于96孔板，细胞密度为1 × 10⁴细胞/mL在37°C和5% CO₂，在培养基中，每2天更换新鲜培养基。贴壁细胞培养建立后，asmc用重氮或5-HD处理，如前所述。从试验孔中抽吸培养基，用PBS轻洗细胞。加入MTT溶液，孵育4 h，加入DMSO (1.5 mL)。然后小心地吸出上清。在570 nm处用分光光度法直接测定吸光度。将终浓度为25 mmol/L的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002加入哮喘组和哮喘+重氮组的细胞培养液中，测量吸光度值。

2.6。西方墨点法

2天后，用PBS洗涤细胞，用含有0.5 M Tris-HCl (pH 7.4)、1.5 M NaCl、2.5%脱氧胆酸、10% NP-40、10 mM EDTA和蛋白酶抑制剂(Millipore, Bedford, MA)的裂解缓冲液溶解细胞，然后放在冰上孵育30分钟。然后将混合物离心(13000 rpm;30分钟)。用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白提取液在6%的Bis-Tris蛋白凝胶上电泳，然后转移到PVDF膜上。在5%奶粉中孵育1小时后，用以下一抗孵育膜:anti-p-AKT、anti-AKT (BD Biosciences)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) (Bioworld, USA)。然后，用过氧化物酶亲和纯山羊抗兔IgG (H + L链;杰克逊免疫研究实验室，西格罗夫，宾夕法尼亚州)。采用增强化学发光(ECL)试剂盒(Amersham, UK)检测蛋白条带。使用image - pro Plus图像分析软件量化频带强度。 The mean grey value was used for further statistical analysis.

2.7。逆转录PCR和定量PCR

根据制造商说明，使用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从asmc中提取总RNA。然后，将RNA与oligo (dT)引物混合，使用cDNA第一链合成试剂盒(Fermentas, Burlington, Canada)逆转录为cDNA。随后，在ABI 7900成像系统(UVP, LLC Upland, CA, USA)中使用SYBR premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa, Dalian, China)进行qPCR。PCR条件为:94℃30秒，95℃5秒，56℃30秒，72℃60秒，共40个循环。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离。所有反应均为3个重复，用相对定量法计算基因表达水平。GAPDH作为内参基因。所有引物(Takara Biotechnology Co. Ltd, China, Dalian)列于表中1．

2.8。统计分析

所有数据均以均数±标准差表示，并采用SPSS统计软件(20.0版)进行分析。的t- 差异的最低和单向分析（ANOVA）测试分别用于两组或多个组之间的比较。 被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。ASMCs的特征和鉴定

利用相差显微镜根据细胞的特殊形态特征(即“山丘和山谷”特征)鉴定asmc。免疫组织化学染色的α-Smooth肌肉肌动蛋白也进行了识别ASMC。发现培养的细胞是阳性的α-smooth肌肉肌动蛋白。这些实验表明了ASMC的鉴定（图1）.

３．２．Δψm在哮喘模型大鼠ASMCs中的表达

Δψ采用罗丹明荧光染色法检测ASMCs中m。哮喘组(图2(一个))，荧光强度明显高于正常组(图2 (d)）.重氮显著增加了正常+重氮中R-123的荧光强度(图)2 (e))组与正常组比较(图2 (d)）.哮喘+重氮组的荧光强度(图2 (b)）也比哮喘组的惊人更高（图2(一个)）.相反，哮喘+ 5-HD组R-123的荧光强度（图2 (c)）低于哮喘组（图2(一个)）.δψM主要是在质子梯度存在时，质子通过线粒体内膜时产生的。这些结果表明，重氮增强了mitoK_atp.哮喘模型大鼠ASMCs通道开放，而5-HD阻碍通道开放。

3.3。MitoK效果_atp.来自哮喘大鼠模型的ASMCS增殖的渠道开放

MTT方法用于检测ASMC的增殖。如图所示3.，正常+重氮组和哮喘对照组ASMCs的吸光度值明显高于正常组( ）.哮喘+二氧化物基团的吸光度值也明显高于哮喘组（ ）.而哮喘+ 5-HD组ASMCs的吸光度值低于哮喘组( ）.正常对照组与正常+ 5-HD组的吸光度值无显著性差异( ）.上述结果表明，二氮嗪可促进哮喘模型大鼠ASMCs的增殖，而5-HD可降低ASMCs的增殖。

3．4．MitoK效果_atp.哮喘模型大鼠ASMCs中PI3K/AKT信号通路的通道打开

如图所示3.，哮喘+ LY294002组的吸光度值低于哮喘组( ）哮喘+二氧化锑+ Ly294002组的吸光度值也低于哮喘+二氮氧化物组（ ），提示LY294002 (PI3K/AKT通路抑制剂)逆转了重氮对哮喘模型大鼠ASMCs增殖能力的影响。Western blot检测正常组和哮喘组ASMCs经重氮和5-HD处理后AKT和pAKT的表达水平。AKT蛋白表达水平在各组间无显著差异(图)4）.但与正常组相比，正常+重氮组和哮喘组p-AKT蛋白表达水平升高( ）.哮喘+重氮组p-AKT蛋白水平高于哮喘组，哮喘+ 5-HD组p-AKT蛋白水平低于哮喘组( ）(图4）.通过实时定量PCR检测的AKT mRNA表达的结果与Western印迹的结果一致（表2）.因此，用二氮氧化物诱导的AKT磷酸化处理，并在大鼠哮喘模型中用5-HD的治疗降低AKT磷酸化。这些结果表明米托克_atp.通道打开在哮喘大鼠中调制PI3K / AKT信号通路。

4.讨论

哮喘是一种与气道高反应性、阻塞和重塑有关的慢性疾病。结构改变与气道重塑有关，包括上皮细胞脱落、杯状细胞化生或增生、上皮下纤维化、支气管新生血管[18，平滑肌细胞增生[19］．Asmcs是支气管混凝土的效应细胞，产生炎症介质和血管生成因子。增加的ASMC水平可能导致气道重塑和持久气流限制[20.］．先前的研究表明ASMCs与哮喘发病机制密切相关[21］．

MITOK._atp.通道在各种细胞中的线粒体离子平衡中发挥重要作用，并且参与各种蜂窝功能[22］．MITOK._atp.蛋白质维持线粒体中的钾平衡，以及mitoK的开启和关闭_atp.通道可以改变δψ在本研究中，二氮氧化合物被用来选择性地打开和激活mitoK_atp.5-HD作为选择性阻滞剂，特异性地减少mitoK_atp.频道活动(23］．δψR-123荧光染色检测各组ASMCs中m的变化。结果如图所示2表明重氮处理导致mitoK_atp.asmc中的通道打开。相反，5-HD显著降低了mitoK_atp.通道开口，通过降低R-123的荧光强度所证明。

之前的研究证明了mitoK_atp.通道激活导致哮喘大鼠ASMC增殖和分泌[24］．在这项研究中，我们研究了MITOK的影响_atp.使用MTT测定的ASMC增殖能力的通道开口。根据MTT测定结果，与正常对照中的毒性哮喘大鼠挑战的支气管哮喘大鼠的AMSC增殖增加（图3.）.此外，在哮喘+二氧化物基团中观察到的吸光度值显着高于哮喘组中的吸光度值，而哮喘+ 5-HD组的吸光度值远低于哮喘组中的吸光度值。结果表明，双子氧化物在​​哮喘大鼠模型中增加了ASMC增殖，5-HD降低了。这些结果指出了MITOK_atp.通道开口导致增强ASMC增强。这些发现与先前报道的结果一致[25］．最近的一项研究表明，Δψm和mitoK_atp.通道打开可能导致人肺动脉平滑肌细胞增殖[12］．另一项研究报告称，Δψm和mitoK_atp.通道开放有助于哮喘诱导ASMCs的细胞增殖和凋亡能力[13］．

PI3K/AKT与细胞增殖、细胞存活和癌症进展的各种功能密切相关[26，27］．AKT是PI3K的主要下游靶点，可被各种刺激、激素和生长因子激活。AKT磷酸化可作为PIK3活性的指标。PI3Ks是一种参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运的蛋白家族。增殖受多种丝氨酸/苏氨酸激酶级联反应和多种细胞信号通路的影响，包括PI3K/AKT信号通路。先前的研究表明，抑制PI3K/AKT信号可能会减弱ASMC的增殖[28］．最近，Dai等人提供了抑制TGF-的证据β1诱导的ASMC增殖与PI3K / AKT失活相关[29］．但是，米托克之间的相互作用_atp.- ASMC的依赖性增殖和PI3K / AKT信号通路仍然不确定。在本研究中，PI3K / AKT途径抑制剂Ly294002逆转二氮嗪对哮喘大鼠模型中ASMC的增殖能力的影响，表明PI3K / AKT途径可参与ASMC和进展的增殖能力和进展哮喘。我们的研究结果表明，二氮杂氧化物处理诱导的AKT磷酸化，5-HD处理在哮喘大鼠模型中减少ASMC中的AKT磷酸化。这些结果表明AKT的磷酸化依赖于米托克_atp.通道开放。占据了，可以得出结论，在Asmcs，MITOK_atp.通道开度激活PI3K / AKT信号通路，从而增加细胞增殖和加重气道重塑。

5.结论

本研究的结果提供了证据，在无氧条件下的ASMCs中，哮喘可能导致mitoK的激活和开放_atp.的通道和部分去极化ψm，通过激活PI3K/AKT信号通路进一步促进ASMCs细胞增殖。这些发现揭示了mitoK_atp.通道开放和PI3K/AKT信号通路在哮喘发病机制中发挥重要作用。此外，他们认为mitoK_atp.通道可能是治疗哮喘的新靶点。

数据可用性

在研究过程中生成的分析数据集可由通讯作者根据合理要求提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

高敏和孙钦然对这项工作贡献相当。

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