本研究采用48只雄性SD大鼠(体重250-350 g)，在温度-(22±2°C)和湿度-(45-60%)控制的环境中进行12小时的光/暗循环。这些动物可以随意获得食物和水。这些大鼠被平均分为哮喘组和对照组。哮喘组大鼠在第0天和第14天腹腔注射10%卵清蛋白(OVA)加明矾，而对照组大鼠腹腔注射生理盐水[ 16］．然后在连续7天内将哮喘组大鼠用OVA气溶胶攻击（PBS中1％; 30分钟/ d）攻击。作为对照，对照组的大鼠用盐水敏化。实验由我们医院的伦理委员会批准，并根据护理和使用动物的指导方针进行。

从哮喘和对照大鼠的组织中分离出主要ASMC。通过组织消化与由1mg / ml胶原酶I，10mg / ml BSA的溶液组成的溶液分离平滑肌，并在37℃下将10mg / ml BSA和1mg / ml毒蛋白纸组成15 min. The separated cells were then cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) containing 20% FBS and seeded in cultured flasks with 10% FBS-DMEM. They were passaged when they reached 80–90% confluence [ 17］．采用第3 ~ 6代asmc进行试验。从哮喘大鼠模型中获得的asmc分为:(i)哮喘组;(ii)哮喘+重氮组，接受额外的重氮治疗(选择性mitoK_atp.通道开启器）（在DMSO中稀释; 100  μ.mol / L);(iii)哮喘+ 5-HD组，接受额外的5-HD(5-羟基癸酸盐，选择性mitoK)治疗_atp.通道阻断剂)(DMSO稀释;500年 μ.mol / l）。

将正常大鼠的asmc分为正常组、正常+重氮组、正常+ 5-HD组，如上所述。

采用相衬显微镜图像识别ASMCs的特定形态学特征。免疫组化染色鉴定asmc α.-smooth肌肉肌动蛋白。

asmc在6孔板中加载罗丹明-123 (R-123;10 μ.g/mL)， 37℃避光孵育30分钟。R-123荧光在静息Δ处猝灭 ψ当线粒体膜被去极化并且被线粒体选择性占据线粒体，因此揭示了R-123荧光与δ之间的线性相关性 ψm。在用二氮杂氧化物或5-HD处理后，通过D-Hanks溶液洗涤ASMC中未吸收的R-123，以确保其不影响荧光强度。荧光在488nm处刺激，并通过激光共焦显微镜检查在530nm处检测。使用HPIAS-1000图像分析仪进行分析结果。

将asmc培养于96孔板，细胞密度为1 × 10^4. cells/mL at 37°C and 5% CO₂，在培养基中，每2天更换新鲜培养基。贴壁细胞培养建立后，asmc用重氮或5-HD处理，如前所述。从试验孔中抽吸培养基，用PBS轻洗细胞。加入MTT溶液，孵育4 h，加入DMSO (1.5 mL)。然后小心地吸出上清。在570 nm处用分光光度法直接测定吸光度。将终浓度为25 mmol/L的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002加入哮喘组和哮喘+重氮组的细胞培养液中，测量吸光度值。

2天后，用PBS洗涤细胞并在含有0.5M Tris-HCl（pH7.4）的裂解缓冲液中裂解，1.5M NaCl，2.5％脱氧胆酸，10％NP-40,10mM EDTA和蛋白酶抑制剂（Millipore，贝德福德，ma），随后在冰上孵育30分钟。然后将混合物离心（13,000rpm; 30分钟）。用BCA试剂盒测量蛋白质浓度。将蛋白质提取物电流在6％BIS-TRIS蛋白凝胶上，然后转移至PVDF膜。在5％干乳中孵育1小时后，将膜与以下一抗：抗P-AKT，抗AKT（BD Biosciences）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（BioWorld，USA）一起温育。然后，将膜与过氧化物酶携带山羊抗兔IgG（H + L链;杰克逊免疫研究实验室，West Grove，PA）一起温育。增强化学发光（ECL）试剂盒（ECERSHAM，UK）用于检测蛋白质带。图像Pro Plus图像分析软件用于量化频带强度。平均灰度值用于进一步统计分析。

根据制造商说明，使用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从asmc中提取总RNA。然后，将RNA与oligo (dT)引物混合，使用cDNA第一链合成试剂盒(Fermentas, Burlington, Canada)逆转录为cDNA。随后，在ABI 7900成像系统(UVP, LLC Upland, CA, USA)中使用SYBR premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa, Dalian, China)进行qPCR。PCR条件为:94℃30秒，95℃5秒，56℃30秒，72℃60秒，共40个循环。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离。所有反应均为3个重复，用相对定量法计算基因表达水平。GAPDH作为内参基因。所有引物(Takara Biotechnology Co. Ltd, China, Dalian)列于表中 1。

所有数据显示为平均值±标准偏差，并由SPSS统计软件（版本20.0）分析。这 T.- 差异的最低和单向分析（ANOVA）测试分别用于两组或多个组之间的比较。 P. < 0.05 被认为具有统计学意义。

使用相位对比显微镜的这些细胞的具体形态特征（即“山丘和谷”特征）根据具体的形态特征（即“山谷”特征）来鉴定ASMC。免疫组织化学染色 α.-Smooth肌肉肌动蛋白也进行了识别ASMC。发现培养的细胞是阳性的 α.-smooth肌肉肌动蛋白。这些实验表明了ASMC的鉴定（图 1)．

δ. ψ采用罗丹明荧光染色法检测ASMCs中m。哮喘组(图 2（a）），荧光强度明显高于正常组中的强度（图 2 (d))．二酰氧化物在正常+二氮氧化物中显着提高R-123的荧光强度（图 2 (e))组与正常组比较(图 2 (d))．哮喘+二酰氧基群中的荧光强度（图 2（b））也比哮喘组的惊人更高（图 2（a）)．相反，哮喘+ 5-HD组R-123的荧光强度（图 2 (c)）低于哮喘组（图 2（a）)．δ ψ当存在质子梯度时，M是主要生产的，并且质子通过线粒体内膜。这些结果表明，二氮氧化物增强了MITOK_atp.哮喘模型大鼠ASMCs通道开放，而5-HD阻碍通道开放。

MTT方法用于检测ASMC的增殖。如图所示 3.，正常+二氧化物组和哮喘对照组中ASMC的吸光度值明显高于正常组中的吸光度值（ P. < 0.05 )．哮喘+二氧化物基团的吸光度值也明显高于哮喘组（ P. < 0.05 )．然而，哮喘+ 5-HD组中ASMC的吸光度值低于哮喘组（ P. < 0.05 )．正常对照组和正常+ 5-HD组之间的吸光度值没有显着差异（ P. > 0.05 )．这些结果表明，二氮氧化物增加了哮喘大鼠模型中ASMC的增殖，5-HD降低了。

如图所示 3.，哮喘+ LY294002组的吸光度值低于哮喘组（ P. < 0.05 ）哮喘+二氧化锑+ Ly294002组的吸光度值也低于哮喘+二氮氧化物基团（ P. < 0.05 )，提示PI3K/AKT通路抑制剂LY294002逆转了重氮对哮喘模型大鼠ASMCs增殖能力的影响。Western blot检测正常组和哮喘组ASMCs经重氮和5-HD处理后AKT和pAKT的表达水平。AKT蛋白表达水平在各组间无显著差异(图) 4.)．但与正常组相比，正常+重氮组和哮喘组p-AKT蛋白表达水平升高( P. < 0.05 )．此外，与哮喘组中的哮喘+ 5-HD组哮喘+二氧化物基团具有较低的p-akt蛋白水平，与哮喘组相比（ P. < 0.05 ） （数字 4.)．通过实时定量PCR检测的AKT mRNA表达的结果与Western印迹的结果一致（表 2)．因此，用二氮氧化物诱导的AKT磷酸化处理，并在大鼠哮喘模型中用5-HD的治疗降低AKT磷酸化。这些结果表明米托克_atp.通道打开在哮喘大鼠中调制PI3K / AKT信号通路。