文摘

背景。Quinoline-3-carboxamides一直用于治疗自体免疫/炎症性疾病在人类,因为他们抑制功能S100 A9钙结合蛋白(S100A9),而参与中性哮喘病患者的炎症的发展,在中性粒细胞哮喘动物模型。然而,这些化学物质的疗效尚未评估在哮喘。本研究的目的是评估paquinimod的影响,quinoline-3-carboxamides之一,在中性粒细胞哮喘小鼠模型。方法。Paquinimod是口头管理6 C57BL / 6小鼠致敏和挑战卵白蛋白(OVA) /完全弗氏佐剂(CFA)和卵。肺部炎症和重塑进行了评估采用支气管肺泡灌洗(BAL)和组织学结果包括杯状细胞计数。S100A9 caspase-1, il - 1β、MPO、IL-17干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α使用西方墨点法测定肺溶解产物。结果。Paquinimod恢复增强气道阻力和中性粒细胞和巨噬细胞的增长数字矿山和杯状细胞的液体在卵子/ CFA老鼠向sham-treated老鼠的水平剂量依赖性的方式(0.1,1、10和25毫克/公斤/天,订单)。与此同时,p20激活caspase-1, il - 1βIL-17, TNF -α和干扰素-γ水平明显减弱。结论。这些数据表明,paquinimod有效抑制中性粒细胞炎症和重塑在中性粒细胞哮喘小鼠模型,IL-17,差别可能通过对这些干扰素-γ,il - 1β。

1。背景

哮喘是一种异构的疾病包括各种亚型,它可以被定义为病理学、严重性、病原学、生理参数,和对治疗的反应1]。聚类分析哮喘组最近导致了识别不同的哮喘临床subphenotypes和不同endotypes [2- - - - - -4]。气道炎症不同类地由嗜酸性、中性混合细胞,和paucigranulocytic类型,各有不同的生理和临床特点5,6]。具体地说,约有40%的成年哮喘患者中性气道炎症和5% -10%的人有严重的表现5- - - - - -7]。虽然引发,TNF -α干扰素-γ(正γ),并假定IL-17负责中性粒细胞炎症(8),治疗来防止这些分子尚未导致了严重的哮喘病人良好的临床反应(9]。因此,其它分子介质应当被视为治疗候选人中性粒细胞炎症的治疗。最近,我们表明,S100A9放大进行中性哮喘病患者的炎症和哮喘动物模型(10]。

S100A9是一个小的钙结合蛋白释放的细胞坏死强调,作为内源性危险信号加速和加重炎症反应(11,12]。这个分子诱导信号通路等炎症反应的趋化作用[11,12)和调制的中性粒细胞和巨噬细胞(13]。S100A9蛋白质结合促炎的受体,受体对于高级糖化终端产品(愤怒)和toll样受体4 (TLR4),这两个参与哮喘的发病机制14,15]。S100A9的转录调节外周血单核细胞在哮喘恶化[16]。同样,S100A9高架的痰中性粒细胞炎症严重的不受控制的哮喘(17]。S100A9蛋白的表达改变与肺部疾病有关,如囊性纤维化、和其他慢性炎性疾病,如风湿性关节炎(18- - - - - -20.]。Paquinimod (abr - 215757 C21H22N2O3),quinoline-3-carboxamide衍生品之一,目标S100A9蛋白通过打断愤怒和TLR4的绑定。此外,paquinimod抑制t细胞激活NKT-II细胞(21]。它显示有益作用在一些自身免疫/炎症性疾病模型:paquinimod减少病理学在实验collagenase-induced骨关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)患者(22和系统性硬化患者23]。因此,它是在中性粒细胞哮喘推测,paquinimod会有效。最近,部分结果已经出版的专利(PCT / KR2017/013799): paquinimod减少胶原蛋白的水平,炎症和杯状细胞在小鼠模型的哮喘和肺纤维化。然而,潜在机制paquinimod尚未定义。本研究的目标是确定paquinimod对中性实验哮喘气道炎症的影响使用卵清蛋白(OVA) /完全弗氏佐剂(CFA)敏化/挑战老鼠,这是生成如前所述[10]。我们也评估的影响paquinimod Th1的表达,Th17, il - 1β因为他们是高架和负责这个模型肺嗜中性10]。

2。方法

2.1。测试化合物和配方

Paquinimod (abr - 215757)(补充图1)是合成陶宏根有限公司(韩国首尔)。化合物溶解在水中,pH值调整到7.5,然后分发瓶足够为一个每日治疗,密封,储存在4°C,内使用1个月的准备。

2.2。老鼠

在这项研究中,48 6雄性C57BL / 6小鼠从ORIENTbio购买,韩国,在无菌设施饲养实验动物研究中心Bucheon Soonchunhyang大学医院。动物被安置与随意获得干净的水和食物12 h光明与黑暗周期。所有程序都执行按照世界医学协会赫尔辛基宣言。研究机构审查委员会批准的协议(IRB) / Soonchunhyang大学医院的伦理委员会(schbc -动物- 2014 - 012)。

2.3。Paquinimod中性模型的小鼠哮喘治疗协议

我们以前描述的neutrophil-dominant模型生成(10]。短暂,老鼠(6周的年龄,体重20 - 24 g)通过腹腔内注射致敏的V鸡蛋卵白蛋白(卵子,20级µg;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)完全弗氏佐剂(CFA, 75µL;Sigma-Aldrich)乳化endotoxin-free磷酸盐(PBS)天0、7和14。在天21日和22日,所有老鼠收到鼻内挑战50 0.1%的三级卵子µL盐水。控制老鼠注射生理盐水代替。所有程序都是在无菌环境中执行。Paquinimod(0.1、1、10、25毫克/公斤/天)通过饮用水管理从每天7 - 23所示。八个动物被用于每个控件和实验组。在研究期间所有的动物还活着。老鼠牺牲20后23天µ与75年g卵子µL CFA腹腔滴注法,肺是组织学和一个是单一化对蛋白质的量化和分析气道炎症是使用支气管肺泡灌洗(BAL)细胞分析进行补充图中描述2。这些老鼠被切断下腔静脉安乐死。

2.4。落下帷幕,气道阻力,测量和组织学分析

与ketamine-xylazine被麻醉后,老鼠tracheostomized和使用flexiVent机械通风系统(Scireq,蒙特利尔,加拿大)24小时之后最后一个卵子的挑战中描述(24]。气道阻力测定使用PBS和增加剂量的醋甲胆碱(0,20和100毫克/毫升;Sigma-Aldrich),表现为曲线下的面积(AUC)乙酰甲胆碱的挑战。后气道阻力测定,落下帷幕了,肺组织处理的组织学和蛋白质测量如前所述[25,26]。短暂,BAL是由四个×滴剂1毫升PBS和温和的检索。细胞数量是使用血细胞计数器测量的,微分细胞计数进行幻灯片由cytocentrifugation Diff-Quick染色(科学产品,Gibbstown新泽西),紧随其后的是计数500个细胞从每个动物。平衡液离心机,和上层清液储存在−80°C。

肺的一部分是固定在4%多聚甲醛缓冲和嵌入在石蜡。组织切成4µ米厚片,deparaffinized rehydrolyzed,苏木精和伊红染色())和周期性acid-Schiff (PAS)。杯状细胞被算作PAS-positive细胞在支气管上皮细胞的总数从400年的放大图像捕获×使用光学显微镜与ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)[27]。

2.5。免疫印迹

免疫印迹分析使用鼠标肺溶解产物如前所述[17]。短暂,肺组织样本中提取单一化里帕缓冲区包含50 mM用盐酸(pH值7.4),50 mM氯化钠,0.1% SDS,特里同x - 100, 1% EDTA 0.5毫米和100毫米phenylmethanesulfonyl氟化物在蒸馏水和离心机在14000 rpm 30分钟在4°C。肺溶解产物蛋白质(15μg /)加载和在15%聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移到硝化纤维膜在80 V 120分钟。1 h在室温下的膜被封锁在TBS Tween-20 0.1% 5%脱脂牛奶和孵化一夜之间在4°C anti-polyclonal S100A9抗体(1:1000稀释;罗福斯生物、利特尔顿,CA), anti-polyclonal caspase-1抗体(1:1000稀释;圣地亚哥Adipogen anti-IL-1 CA)β单克隆抗体(1:1000稀释;细胞信号技术,丹弗斯,MA), anti-IFN -γ单克隆抗体(1:1000稀释;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)、anti-IL-17单克隆抗体(1:1000稀释;研发系统,明尼阿波利斯,美国MN), anti-TNF -α单克隆抗体(1:1000稀释;Abcam)、anti-MPO单克隆抗体(1:1000稀释;Abcam)和反β肌动蛋白单克隆抗体(1:5000稀释;Sigma-Aldrich)。膜在室温下培养1 h辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000稀释;热,Fremont, CA)。目标蛋白质被增强化学发光检测解决方案(Amersham法玛西亚生物技术,小都,英国)使用x射线胶片。

2.6。统计分析

数据分析使用统计软件SPSS版本。20.0。比较非参数变量进行利用克鲁斯卡尔-沃利斯测试,然后使用Mann-Whitney事后分析U测试执行。所有的数据都表示为意味着±标准错误的意思。 小于0.05的值被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。抑制作用的Paquinimod中性粒细胞哮喘小鼠模型

一些paquinimod剂量(0.1,1、10和25毫克/公斤/天)是管理6 C57BL / 6小鼠通过饮用水从7天23(补充图2气道炎症),分析了使用BAL细胞分析和组织学分析。Paquinimod剂量依赖性减毒球的炎症细胞数量增加流体的CFA / OVA-sensitized /刺激老鼠;10到25毫克/公斤/天paquinimod显著降低中性粒细胞的数量,总细胞(巨噬细胞,嗜酸性粒细胞, ),而低剂量(0.1和1毫克/公斤/天)(图显示减少的影响1)。


图1
paquinimod对炎症细胞数量的CFA / OVA-treated老鼠。落下帷幕的细胞的数量显示为均值±SEM (×104/毫升)。 而虚假的集团; 相比之下,卵巢/ CFA组。的 值利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验和事后Mann-Whitney获得U测试。

)和PAS染色,大量炎症细胞渗透支气管旁和肺泡周围地区CFA OVA-sensitized /刺激小鼠相应增加的杯状细胞(图2)。治疗paquinimod显著和剂量依赖性衰减的炎症和杯状细胞数量的增加对sham-treated中发现的数字模型(数据2和3(一个))。肺阻力测量使用flexiVent显著增加在CFA OVA-sensitized /挑战老鼠,和paquinimod治疗减毒增强肺阻力在剂量依赖性的方式(图3 (b))。


图2
代表的苏木精和伊红())和周期性acid-Schiff (PAS)染色的肺部组织。肺部分从虚假的获得——和卵子/ CFA-treated老鼠有或没有paquinimod治疗10毫克/公斤/天,订单,组织部分沾不确定的存在杯状细胞(显微镜图像(x200型))。
(一)
(一)
(b)
(b)
图3
paquinimod对杯状细胞数和肺阻力的影响卵子/ CFA-treated老鼠。(a)的比例在支气管上皮杯状细胞;周期性acid-Schiff (PAS)阳性细胞和上皮细胞在上皮细胞数和PAS-positive细胞的百分比计算(n在每组= 8)。(b)肺阻力sham-treated或卵子/ CFA-treated老鼠和卵子/ CFA + paquinimod(0.1毫克/公斤/天至25毫克/公斤/天,订单)后的挑战随着浓度的乙酰甲胆碱(n在每组= 8)。 而虚假的集团; 相比之下,卵巢/ CFA组。的P使用Mann-Whitney价值了U测试。
3.2。Paquinimod对S100A9 CFA和细胞因子/卵巢的老鼠

免疫印迹显示肺组织的CFA / OVA-sensitized和CFA / OVA-stimulated老鼠显示增加的S100A9 caspase-1, il - 1β、MPO、IL-17干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α蛋白质。治疗paquinimod(10毫克/公斤/天,订单)减少caspase-1 S100A9随之而来的水平降低,il - 1β、MPO、IL-17干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(图4)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
免疫印迹的inflammasomes S100A9,细胞因子在小鼠肺溶解产物。(a)免疫印迹的代表人物S100A9 (kDa 13日),procaspase-1 (46 kDa)、裂解caspase-1 (30 kDa), p20激活caspase-1 (20 kDa),前身il - 1βil - 1 (31 kDa),成熟的形式β(kDa 17日),MPO (65 kDa), IL-17 (18 kDa)、干扰素-γ(17 kDa)和肿瘤坏死因子-α(25 kDa)上执行合并肺从sham-treated溶解产物(n= 3),CFA / OVA-treated小鼠(n= 3),CFA /卵+ paquinimod(10毫克/公斤/天,订单。)(n= 3)(b)和免疫印迹的微乐队强度归一化的β肌动蛋白。

4所示。讨论

我们之前报道的关系S100A9 neutrophil-dominant炎症的发展在CFA / OVA-induced小鼠哮喘模型(10]。在目前的研究中,我们表明,paquinimod S100A9化学抑制剂的功能,极大地废除了CFA / OVA-induced neutrophil-dominant炎症和气道重塑的杯状细胞增生。我们所知,这是第一个报告paquinimod的治疗效果与中性粒细胞哮喘动物模型。S100A9蛋白结合促炎涉及愤怒和TLR4受体(13),这两个参与哮喘的发病机制15]。S100A9 TLR4诱发NF -的绑定κB活化和细胞因子分泌髓细胞(28,29日]。因此,paquinimod可能有效的竞争性抑制这两种类型的绑定在我们的研究中。

第一quinoline-3-carboxamide类似物的发展是在1980年,当活跃的生物技术在瑞典发现roquinimex,后来成为著名的贸易名称,Linomide [30.]。此后,该类化合物在表现出很强的disease-inhibitory效应在实验模型的自身免疫性疾病,包括II型胶原蛋白在小鼠关节炎模型(31日糖尿病小鼠),(32),自身免疫性疾病中枢和周围神经系统(33实验性自身免疫性脑脊髓炎],[34]。基于这些结果,活跃的生物技术筛选quinoline-3-carboxamide类似物来确定第二代化合物的化学库缺乏促炎的副作用。

Paquinimod (abr - 215757)属于第二代quinoline-3-carboxamide衍生品、类结构相关的小分子化合物具有免疫调节特性(35]。paquinimod在目前的研究中,几个剂量(0.1,1、10和25毫克/公斤/天)是管理6通过饮用水C57BL / 6小鼠2周,与剂量> 1毫克/公斤/天显示良好的抑制性影响中性粒细胞炎症和重塑的老鼠。剂量决定使用一个体外研究如下:抑制活性的paquinimod S100A9是由测量NF -κB的荧光素酶活动293 - htlr md2 - cd14转染细胞(InvivoGen、圣地亚哥、钙、美国)。细胞转染在12-well板2μ克NF-kB记者向量(美国Panomics,圣克拉拉,CA)和1μ克pRL-TK向量(美国麦迪逊Promega)作为内部控制。第二天,细胞治疗10μpaquinimod S100A9 g蛋白与不同浓度(0,100,500海里,1μ米)(补充图8小时3),然后,细胞溶解产物的荧光素酶活动被光度计测量。作为结果,S100A9-induced NF-KB荧光素酶活动明显减少paquinimod剂量依赖性的方式和IC50% paquinimod估计约为878海里。paquinimod水平并不以小鼠的血,这是本研究的一个限制。然而,药代动力学研究涉及MRL-lpr / lpr小鼠系统性接触0.04和0.2毫克/公斤/天的饮用水paquinimod显示0.03的水平µmol / L和0.17µmol / L,分别22]。因此,1毫克/公斤/天的剂量目前的研究可能导致0.85的水平µmol / L (IC50%周围)。此外,paquinimod(0.1, 1、10和25毫克/公斤/天)通过饮用水管理从7天23补充图所示2。这一剂量高于使用的剂量MRL-lpr / lpr老鼠和人类研究;paquinimod剂量为1.5毫克/天的耐受性良好健康的志愿者,和临床剂量的1毫克/天和更高的预测是有效治疗系统性红斑狼疮患者(22),最近,在系统性硬化患者23]。此外,我们没有观察到任何老鼠死亡率在目前的研究中。

S100A家族蛋白质调节炎症反应的作用在各种各样的免疫和多发地细胞,包括单核细胞,中性粒细胞,内皮细胞,角质细胞,上皮细胞,后续生产的促炎细胞因子(28,36,37]。此外,S100A9直接诱导中性粒细胞脱粒和趋化性38)和白细胞粘附和内皮轮回39)可能在哮喘气道嗜中性的主要机制。此外,S100A家庭蛋白质与气道重塑;MUC5AC mRNA和蛋白表达诱导S100A8, S100A9, S100A12通过几个不同的信号通路(40]。因此,我们的数据paquinimod-induced杯状细胞数量的减少可能是在良好的协议与S100A家庭protein-induced MUC5AC mRNA的表达。此外,S100A9促进成纤维细胞增殖和移植III型胶原,α平滑肌肉肌动蛋白和受体晚期糖化终产物表达式(37]。Upregulation S100A9和愤怒有助于增强基底迁徙的纤维细胞运动性哮喘患者出现急性恶化和慢性气流限制(41]。因此,paquinimod可能有效的哮喘患者的气道增厚,虽然支气管旁平滑肌厚度并没有以目前的研究。

对于分子机制,CFA的肺组织/ OVA-sensitized和CFA / OVA-stimulated老鼠显示增加的S100A9 caspase-1, il - 1β、MPO、IL-17干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α蛋白质在西方的屁股类似报道(10],paquinimod治疗显著降低S100A9的水平,这些蛋白质的同时减少。在我们之前的动物研究中,我们报告说,政府S100A9航空诱导激活inflammasomes和干扰素的生产γ和IL-1710]。然而,paquinimod的抑制作用可能是不完整的S100A9抑制;S100A9-knockout比C57BL / 6小鼠更严重疾病控制在实验性自身免疫性脑脊髓炎,但他们仍然对治疗paquinimod [29日]。有趣的是,生物冗余可能发生在S100A9-knockout老鼠,也许S100家族的蛋白质(如S100A12) [42)为愤怒和TLR4作为配体(29日]。

最近,paquinimod报告修改NKT-II细胞减少促炎效应的启动CD4 (+) T细胞,CD115+Ly6C嗨单核细胞,CD11b+F4/80+CD206+巨噬细胞(21),虽然我们没有分析paquinimod这些免疫反应的影响,将在未来的学习。本研究的另一个限制是缺乏一个额外的小鼠中性粒细胞炎症模型。卵巢/脂多糖(LPS)模型被用作中性气道炎症(一个好的模型43),高剂量的有限合伙人与卵子诱导的中性粒细胞数量增加Th1和Th17免疫反应44]。因为直接刺激TLR4有限合伙人,这是一个目标分子paquinimod,卵巢/ CFA模型倾向于有限合伙人/卵巢模型在目前的研究。另一个限制是,BAL液体收集来自肺部,这可能改变杯状细胞的数量。

5。结论

在目前的研究中,我们评估paquinimod的影响,quinoline-3-carboxamides之一,中性粒细胞哮喘小鼠模型,敏化和挑战与卵清蛋白(OVA) /完全弗氏佐剂和卵子。Paquinimod恢复增强气道阻力和中性粒细胞和巨噬细胞的数量增加BAL液体和杯状细胞数量在卵子/ CFA老鼠向sham-treated老鼠剂量依赖性的方式的水平。与此同时,p20激活caspase-1, il - 1β、IL-17和干扰素-γ水平明显减弱。这些结果证明paquinimod是一种有效的抑制剂对中性粒细胞炎症和重塑在小鼠哮喘模型的差别可能是通过对这些il - 1β、IL-17和干扰素-γ。综上所述,paquinimod可能候选人对中性粒细胞哮喘治疗有用。

缩写

S100A9: S100 A9钙结合蛋白
肿瘤坏死因子: 肿瘤坏死因子
干扰素: 干扰素
IL: 白介素
有限合伙人: 脂多糖
拜尔港: 支气管肺泡灌洗
CFA: 完全弗氏佐剂
卵巢: 卵清蛋白
PBS: 磷酸盐
TBS: Tris-buffered盐水。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

研究机构审查委员会批准的协议(IRB) Soonchunhyang大学医院伦理委员会(schbc -动物- 2014 - 012)。

信息披露

资助机构没有参与这项研究的设计和收集、分析、解释数据也不写手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Lee JU公园CS,公园JS概念化。Lee JU, JA小君,可金策划数据。HJ歌曲表现形式分析。公园JS参与融资的收购。HS Chang负责方法。JA君、HJ歌和DG门敏验证数据。李和可金可视化研究。Lee JU,公园JS和CS公园准备初稿。Lee JU和CS公园审查和编辑的手稿。Lee JU公园CS, JA小君的贡献同样工作。

确认

这项研究是由韩国国家研究基金会的资助(NRF)由教育部(2017 r1a2b40126)和JS公园Soonchunhyang大学科研补助金。

补充材料

补充图1:化学结构的paquinimod(来源:PubChem)。C21H22N2O3 MW = 350.42。补充图2:原理与paquinimod协议治疗卵巢/ CFA-stimulated和致敏C57BL / 6。肺阻力,支气管肺泡灌洗和组织处理进行了23天。:鼻内;Rl测试:肺阻力。肺阻力(Rl:而言不啻2O / s /毫升)测量使用flexiVent醋甲胆碱浓度增加。图3:补充paquinimod NF -存在剂量依赖的相关性的影响κ荧光素酶活性。细胞阳性293 - htlr4a md2和NF - - cd13转染κB荧光素酶和pRL-Tk结构,荧光素酶活性测定治疗后8 h重组S100A9 10μg和paquinimod(0, 100, 500海里,1嗯)。数据意味着±SEM的六个实验; ,与PBS相比, ,相比之下,S100A9。 使用Mann-Whitney价值了U测试。(补充材料)