通过增加肺纤维化绵羊模型的ER压力和细胞凋亡的增加在活的有机体内KCa3.1离子通道的封锁

抽象的

特发性肺纤维化（IPF）是一种致命的间质肺病，其特征在于对肺组织的渐进损伤。II型肺泡上皮细胞（AECS）和肺巨噬细胞中的细胞凋亡和内质子resculum（ER应激）与IPF的发育有关。因此，凋亡和ER应激靶向疗法引起了潜在的IPF潜在途径。已经提出了钙活化的钾离子通道KCA3.1作为包括IPF的纤维化疾病的潜在治疗靶标。虽然KCA3.1在AECS和巨噬细胞中表达，但在疾病过程中对ER应激和细胞凋亡的影响尚不清楚。我们利用了一种新型肺纤维化的绵羊模型，以证明凋亡和ER应激在II型AECS和绵羊中巨噬细胞的肺纤维素引起的肺纤维化。使用标记碎片核DNA的TUNEL方法鉴定II型AEC和巨噬细胞的细胞凋亡，同时通过GRP-78 ER伴侣蛋白的表达增加了ER应力。我们证明II型AECS和巨噬细胞的凋亡和ER应激在最终博来霉素输注后2周增加2周，并且含有高达7周的博来霉素损伤后长达7周。Senicapoc治疗显着降低了II型AECs和巨噬细胞的ER应激率，驻留在岩土霉素注入的肺段中。在Senicapoc处理绵羊肺区段中II型AECS和巨噬细胞的凋亡率也有显着减少。 In vivo blockade of the KCa3.1 ion channel alleviates the ER stress and apoptosis in type II AECs and macrophages, and this effect potentially contributes to the anti-fibrotic effects of senicapoc.

1.介绍

特发性肺纤维化（IPF）是一种致命的间质肺病，其特征在于对肺组织的渐进损伤，这反过来导致肺气交换功能的损害[1-3.］．虽然Pirefenidone和Nintedanib是目前由FDA批准的两种药物，以减缓IPF的进展[4.-7.]这些药物不会治愈疾病[4.-7.］．由于对肺中纤维化发病机制缺乏了解，抑制持续治疗目标抑制持续的纤维化的潜在治疗目标仍然​​是一个重大挑战。

IPF的进展涉及许多疾病元素，包括活化转化生长因子β（TGF-β)等趋化因子，II型肺泡上皮细胞(AECs)凋亡，凋亡细胞清除无效，创面异常愈合和内质网(ER)应激[8.那9］．ER是一种特殊的细胞器，通常负责折叠合成的蛋白质，并随后将蛋白质以囊状运输到高尔基体。Ca等因素²⁺耗尽，氧化还原稳态改变，营养剥夺和环境损伤会影响这些折叠过程，最终导致展开蛋白质的积累，破坏了er功能，导致ER应力[10.］．

内质网应激已知会启动细胞凋亡途径[11.通过激活caspase-12。Caspase-12使caspase-9特异性裂解，并伴随下游效应最终导致细胞凋亡[11.］．

II型AEC中的ER应力是IPF的突出特征之一，并且经常在家族和零星IPF患者中发现[12.］．内质网应激也在石棉肺患者肺部的巨噬细胞中观察到[13.］．内质网应激诱导炎症信号、上皮-间充质转化、肌成纤维细胞活化、巨噬细胞极化和T细胞分化，这些可能导致IPF疾病进展[14.-17.］．

钙激活钾离子通道KCa3.1被认为是包括IPF在内的纤维化疾病的潜在治疗靶点[18.-21.］．KCA3.1离子通道以肺部和其他组织中的许多细胞类型表达[18.那20.那22.］．重要的是，刺激KCA3.1离子通道的刺激激活涉及IPF疾病过程的成纤维细胞，巨噬细胞和上皮细胞的细胞[18.］．我们最近报道，在绵羊肺纤维化模型中，使用senicapoc (ICA-17043)阻断KCa3.1离子通道可减轻间质性肺纤维化，改善肺顺应性，并减轻微血管重构[23.那24.］．在目前的研究中，我们利用绵羊模型分析II型AECS和纤维化疾病中巨噬细胞的KCA3.1离子通道的调节功能。

本研究的目的是首先确定实验诱导纤维化的绵羊肺中是否观察到内质网应激和II型AECs和巨噬细胞凋亡率的增加。其次，我们研究了在肺纤维化大动物模型中，用特异性抑制剂senicapoc阻断KCa3.1离子通道是否会减缓内质网应激和II型AECs和巨噬细胞的凋亡率。

2。材料和方法

２.１.利用绵羊模型评价博莱霉素诱导的肺纤维化II型AEC和巨噬细胞内质网应激和凋亡的体内实验设计

所有与绵羊实验和样本采集相关的实验程序均由墨尔本大学(帕克维尔，维克，澳大利亚)动物实验伦理委员会批准，并遵守澳大利亚为科学目的护理和使用动物的行为准则。绵羊肺组织样本取自另一项研究[25.]，实验设计简述如下。

8只雌性美利奴绵羊(n = 8) aged within 9–12 months, using Bleomycin sulphate (Hospira, Melbourne, Victoria, Australia) prepared at a concentration of 0.6 U bleomycin/ml saline [25.］．从准备好的博莱霉素溶液中，5 ml作为丸剂经纤维支气管镜活检口注入所需肺段(总剂量为3u博莱霉素/肺段)。同样，给予对侧肺尾段5 ml 0.9%无菌生理盐水作为内对照(图)1)．在14天后施用第二剂的博莱霉素/盐水（图1（a）和1 (b))．然后，绵羊再持续14天以发展肺纤维化。所有绵羊在第28天处于静脉内巴比妥酸盐（Lethabarb，Virbac Animal Health，Australia）。

２.２.尸体解剖和组织取样

在尸检期间被移除肺，鉴定靶向肺区段。通过暴露支气管，分离出靶向肺裂隙的尾段，并通过在约20cm / h的压力下使支气管膨胀，使得最佳切削温度（OCT）和无菌PBS溶液的混合物膨胀。₂O，以便在加工过程中保存肺组织结构。将0.5 cm厚的肺组织标本在4%多聚甲醛和70%乙醇中固定，石蜡处理后进行组织病理学分析。

2.3。II型AEC和巨噬细胞ER应激评估

II型AECS和肺巨噬细胞的持续损伤可能会诱导ER应激，这反过来又可以进入凋亡。葡萄糖调节蛋白（GRP）78是最好表征的ER伴侣蛋白之一，并用作评估ER应激的经典标记物。使用兔单克隆抗GRP78初抗体（ABCAM（AB108615））进行免疫组织化学，以评估II型AECS和巨噬细胞对石蜡肺切片的巨噬细胞的ER应激。每次测定以阴性对照进行，而不添加一抗抗体。

2.4。抗GRP78免疫组织化学染色

石蜡切片在二甲苯中浸泡3次5 min，再用无水乙醇浸泡2次5 min，最后用70%乙醇浸泡5 min。抗原回收采用预先加热的柠檬酸缓冲液(pH-6)加热15 min，置玻片冷却10 min, PBS冲洗。然后将玻片保存在3% H内₂O₂10分钟，阻断内源性过氧化物，用PBS彻底冲洗。将未稀释的胎牛血清(FCS)加入各载玻片，孵育1小时，阻断与抗原的非特异性结合。加入FCS 1:50稀释的抗grp78抗体(Abcam, ab108615)，孵育1小时。用PBS轻轻冲洗玻片，然后用EnVision冲洗^TM将双链路系统-HRP（辣根过氧化物酶）（达科，北美洲公司，CA，USA）施用并孵育30分钟。为了使抗原 - 抗体反应可视化，将Nova红过氧化物酶底物（矢量实验室，CA，USA）加入每个样品中并孵育3分钟。然后，用蒸馏水洗涤样品以停止反应并用苏木精反应染色。

2．5．II型AEC和巨噬细胞凋亡的评价

点击它^TM比色末端脱氧核苷酸转移酶-UTP缺口末端标记（TUNEL）测定（点击 - 它^TMTunel Colorimetric IHC检测试剂盒，Thermo Fisher Scientific，USA）是对石蜡肺组织切片进行的，以评估II型AECS和巨噬细胞造成羊肉植物肺纤维化的肺纤维化（图2)．每种测定用阴性对照进行，而不添加TDT反应混合物。根据制造商的说明，通过二甲苯和二甲苯和乙醇再水化链烷烃切片和再水化乙醇（点击 - 它^TMTunel Colorimetric IHC检测试剂盒，Thermo Fisher Scientific，USA）。将载玻片浸入1％h中₂O₂10分钟阻断内源过氧化物酶。向每个样品中加入稀释的蛋白酶K（稀释率1：50）并孵育5分钟。然后，将样品用阻断缓冲液（1％牛血清白蛋白（BSA）+ 5％常规绵羊血清（NSS）+ PBS）封闭30分钟。在每个步骤之前用PBS彻底洗涤载玻片3次。对于末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）反应，将载玻片与TDT反应缓冲液一起温育10分钟。根据制造商的方案制备TDT反应混合物，并加入每个载玻片并孵育60分钟。用PBS冲洗以完全淬灭TDT反应后，然后将载玻片浸入盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液中15分钟，然后在PBS中咔哒咔啉比色法洗涤溶液。单击IT Tunel比色反应混合物（点击IT反应缓冲液+ CusO4，Biotin叠氮化物+反应缓冲液添加剂）根据制造商的推荐制备，加入每个样品，并孵育30分钟。用PBS洗涤样品，然后单击比色洗涤溶液。然后，将样品与链霉抗生物素蛋白 - 过氧化物酶一起温育30分钟，然后用PBS和去离子水洗涤。 DAB was diluted 1 : 200 with DAB substrate buffer and added to each sample and kept for 30 seconds to facilitate the reaction. Then, the sections were washed with deionized water to stop the reaction and counter-stained with methyl green. 2 g of methyl green was dissolved in 100 ml of distilled water and extracted in chloroform to remove the crystal violet. Working solution was prepared by mixing 1 : 1 methyl green with 0.1 M acetate buffer. Slides were then counter-stained with methyl green for 10 min, followed by quick dehydration with 70% and 100% ethanol and fixed in xylene.

2.6。在体内实验设计中，评估Senicapoc和Pirfenidone对II型AEC型ER应激和凋亡的治疗效果和巨噬菌素诱导的肺纤维化的巨噬细胞

绵羊肺组织取自我们之前的研究[24.那26.[实验设计的简要说明如下。肺纤维化诱导30 Merino绵羊（n= 30) 9-12个月使用博莱霉素(见图)3（a）和3（b）)．在接下来的2周时间里，这些羊的肺纤维化继续发展。然后这些羊被随机分成三组(n= 10)。然后，每组分别给予30 mg/kg的senicapoc (Icagen Inc.， Durham, NC)/吡非尼酮(Selleckchem, USA)或甲基纤维素(Control) 0.5%甲基细胞MC (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia)口服，每日2次。在治疗方案结束时，通过静脉注射巴比妥酸盐(Lethabarb, Virbac Animal Health, Australia)处死绵羊，收集肺组织并如上所述进行处理。如前所述，通过抗grp78染色法和TUNEL法分别检测II型AECs和巨噬细胞内质网应激和凋亡情况。

2.7。定量图像分析

使用Leica DM500显微镜捕获图像。选择并捕获了20个代表性的非重叠场，并在40倍放大率下捕获。在每个场中计数棕色染色细胞，并表示为平均值的平均值和标准误差（平均值±SEM）。基于它们的形态鉴定II型AECS和巨噬细胞。II型AECS是具有中心定位核的立方体细胞，细胞被基底膜覆盖，小部分暴露于肺泡表面[3.］．通过具有突出的细胞核和颗粒细胞质的巨大不规则形状来鉴定巨噬细胞。

2.8。统计分析

使用软件GraphPad Prism版本8.0.1进行统计分析，适用于Windows（GraphPad软件，La Jolla California USA）。使用D'Agostino-Pearson Omnibus正常性测试进行正常性测试。t-检测绵羊肺组织中II型AECs和巨噬细胞内质网应激和凋亡情况。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey事后试验(post - hoc test)评估senicapoc和吡非尼酮对内质网应激、II型AECs和巨噬细胞周转的影响，并进行组间多重比较。一个观察值小于0.05（ < 0.05) was considered statistically significant.

结果

3.1。ER应激在绵羊模型中的博莱霉素诱导的肺纤维化之前

通过确定从在后验尸中收集的差异处理的肺段中取样的部分中的GRP78免疫阳性细胞的数量来评估ER应激（图1（a）和1 (b))．红色细胞质染色显示II型AECs和肺巨噬细胞内质网应激，提示GRP78蛋白表达升高(图)1 (c))．II型AECS中的ER应激率在绵羊肺组织中含有两周后，它们被注入玻璃霉素（Bleomycin 1.16±0.17 Vs盐水0.27±0.06个细胞/领域， = 0.0002) (Figure1 (d))．同样，与对照组/生理盐水肺段相比，博莱霉素输注后巨噬细胞内质网应激率显著增加(博莱霉素3.30±0.84 vs生理盐水0.46±0.24细胞/场， = 0.006) (Figure1（e）)．

3.2。II型AEC和巨噬细胞凋亡的评价

由于内切酶的激活，细胞核DNA的广泛碎裂是晚期细胞凋亡的标志。II型AECs和巨噬细胞的棕色核染色显示DNA片段(tunel阳性)(图)2(一个))．如图所示2（b）与生理盐水灌注肺段相比，灌注博莱霉素肺段的II型AECs凋亡率显著升高(博莱霉素1.64±0.25 vs生理盐水0.28±0.07凋亡细胞/场)。 = 0.0001). A significant increase was also observed in the number of apoptotic macrophages in the bleomycin-infused lung segments, when compared to the control lung segments (bleomycin 1.06 ± 0.20 vs saline 0.22 ± 0.08 apoptotic cells/field, = 0.0001).

３．3.KCa3.1离子通道阻断可显著减轻博莱霉素诱导的肺纤维化II型AEC和肺巨噬细胞内质网应激和凋亡

KCA3.1离子通道已被证明在II型AECS和肺巨噬细胞的ER应激和凋亡中发挥至关重要作用[18.］．因此，我们研究了阻断Ca是否可以减少II型AECs和肺巨噬细胞的内质网应激和凋亡²⁺激活K⁺离子通道（KCA3.1）使用KCA3.1特异性离子通道阻断药物Senicapoc。在该实验中，我们在最终博来霉素输注后7周从各组评估了肺组织中的ER应激和凋亡。本实验中的程序组结构和实验时间表在图中提供3（a）和3（b）．

显示巨噬细胞和AECs中的ER应激标记GRP78的细胞质表达，用于图中的差异处理的肺段3（c）．在用甲基纤维素处理的对照绵羊中，GRP78阳性II型AECs的数量增加（盐水0.19±0.04 Vs Bleomycin 0.68±0.12个细胞/场，n = 10,=(图0.0003)3 (d)）和巨噬细胞（盐水0.32±0.10 Vs Bleomycin 1.46±0.42个细胞/领域，n = 10, = 0.005) (Figure3 (e))与盐水灌注的肺段相比，博莱霉素灌注的肺段有明显差异。这表明疾病模型正常运作。当用甲基纤维素对照组进行使用的SeniCapoc或Pirfenidone治疗的绵羊组时，用Senicapoc或Pirfenidone（Senicapoc 0.26±0.06 Vs 0.68±0.68±0.68±0.68±0.68±0.68±） 0.12 cells/field in vehicle,n = 10= 0.002;吡非尼酮0.36±0.04 vs 0.68±0.12 cells/field=(图0.01)3 (d))．此外，在senicapoc和吡非尼酮处理的绵羊中，博莱霉素灌注的肺段与盐水灌注的肺段中grp78阳性AECs的数量无显著差异(图)3 (d))．这些数据表明，由于吡霉素损伤引起的AECS中的ER应激增加被衰减用Pirfenidone或Senicapoc治疗。

对于巨噬细胞，与由Bleomycin损伤的载体处理的对照肺区段相比，仅与Senicapoc的治疗显着降低了暴露于博莱霉素的肺区分中的巨噬细胞数量 = 0.017; pirfenidone 0.86 ± 0.11 vs 1.46 ± 0.42 cells/field in vehicle,=(图0.2)3 (e))．在SeNicapoc处理的绵羊中，BLEMYCIN-注入的肺区段的GRP78阳性巨噬细胞的数量与盐水注入肺段没有显着差异（图3 (e))．虽然Pilefenidone治疗绵羊的Bleomycin-Infed肺区段的GRP78阳性巨噬细胞的数量高于盐水注入的肺段，但数据也没有显着差异（图3 (e))．

图中，tunel阳性的DNA片段在II型AECs和巨噬细胞中表现为棕色核染色，显示不同处理的肺段4（a）．在用甲基纤维素处理的对照绵羊中，随着TUNEL阳性II型AECS的数量增加（盐水0.23±0.04 Vs BLEOMYCIN 0.94±0.16个细胞/领域，n = 10, < 0.0001) (Figure4 (b))和巨噬细胞(生理盐水0.14±0.04 vs博莱霉素0.53±0.07 cells/field，n = 10,=(图0.0001)4 (c))与盐水灌注的肺段相比，博莱霉素灌注的肺段有明显差异。这表明疾病模型功能良好，在最终输注博莱霉素7周后，2型AECs和巨噬细胞的凋亡仍然很高。

当用甲基纤维素对照组进行比较用Senicapoc或Pirfenidone治疗的绵羊组时，用Senicapoc处理的绵羊的羊霉素注入的肺区段显着降低了Tunel阳性AECs的数量（Senicapoc 0.43±0.06 Vs 0.94±0.16个细胞/领域在车辆，n = 10, = 0.003) (Figure4 (b))．吡非尼酮处理组AECs凋亡率较对照组低，但与甲基纤维素对照组比较，差异无统计学意义(吡非尼酮0.65±0.07 vs 0.94±0.16 cells/field)。n = 10,=(图0.2)4 (b))．在Senicapoc和Pirfenidone治疗的绵羊中，Bleomycin-Infused肺区段中的TUNEL阳性AECs的数量与盐水肺段没有显着差异（图4 (b))．

对于巨噬细胞，与对照组相比，塞尼卡波克处理显著降低了博来霉素暴露肺段的巨噬细胞凋亡数量(塞尼卡波克0.31±0.04 vs 0.53±0.07细胞/场)。n = 10,= 0.04;吡非尼酮0.35±0.04 vs 0.53±0.07 cells/field in vehicle，n = 10,=(图0.1)4 (c))．

4.讨论

本研究是第一个报告博莱霉素治疗增加II型AECS和肺巨噬细胞的ER应激和凋亡，并且这种效果显着改善在活的有机体内用药物Senicapoc阻断KCA3.1离子通道。我们以前的使用羊肺纤维化模型的研究报告说，用Senicapoc处理的绵羊肺纤维化和微血管重塑显着降低[23.那24.］．在参官处理绵羊中的减毒肺病理与这些动物的改善肺功能相一致[24.］．目前研究的结果表明，封锁KCA3.1离子通道在II型AECS和巨噬细胞中降低了ER应激和凋亡，并且这种效果可能导致在该肺纤维化羊模型中观察到的病理学和改善的肺功能。

慢性内质网应激介导的II型AECs和巨噬细胞凋亡已被确认为IPF的主要致病机制之一[12.那27.］．但内质网应激介导的细胞凋亡的潜在机制是复杂的，尚未完全了解[28.］．我们的结果显示，在最后一次博莱霉素输注后2周，II型AEC和巨噬细胞内质网应激和凋亡的患病率很高，并且在博莱霉素损伤后至少7周内保持显著的高水平。

小心应注意，这些结论基于差异处理的肺样品中的相对少量的凋亡和ER应激细胞。在我们研究中观察到的ER应激或凋亡阳性细胞的范围在每场0-6个细胞内。虽然发现这些指数的统计上显着减少了药物治疗，但需要询问的问题是这些观察指数是否减少了临床相关结果。与其他器官相比，每个场的一些低阳性细胞计数是由于肺实质中的细胞总密度较低，而肺的气体交换区域中的相对高的空气对组织空间比。在先前对肺特性间质肺炎的研究中，肺上皮中的TUNEL阳性细胞的频率是与培养细胞相比计算的总肺上皮细胞的相对较低的1％〜3％[29.］．作者认为，凋亡细胞被迅速吞噬，因此在光镜或电子显微镜下只存在相对较短的时间。因此，虽然在组织标本中观察到的tunel阳性凋亡细胞的频率很低，但这一小部分仍可能反映了相当大程度的细胞损失[30.］．总的来说，在目前的绵羊研究中观察到的吡非尼酮和senicapoc减少细胞凋亡和内质网应激，应该与我们之前使用这些药物的临床发现相关联。我们之前已经证明，在使用KCa3.1通道阻断剂senicapoc和fda批准的药物吡非尼酮治疗的绵羊中，肺顺应性、纤维化评分、血管重塑和胶原沉积有显著改善[23.那24.那26.］．在目前的研究中，这些药物治疗后减少细胞凋亡和内质网应激是其整体临床疗效的一部分。

这些胞内事件与KCa3.1离子通道的关系有待进一步阐明。我们报道KCa3.1离子通道在肺泡上皮细胞中广泛表达[24.］．膜电位和钙²⁺肺泡上皮细胞的信号传导主要由KCa3.1通道调控，以维持细胞的激活、迁移和增殖等关键功能[18.那31.］．KCA3.1离子通道是无关的k⁺在细胞内CA打开的频道²⁺水平增加，导致CA²⁺激活K⁺efflux。该过程在调节细胞体积中起着重要作用。当存在连续刺激时，KCA3.1离子通道被激活[18.那32.］．这将导致细胞内k的大量损失⁺外壳到细胞外隔室，超过细胞内K的50％⁺可因流出而丢失[18.］．细胞内钾的消耗⁺离子通过caspase激活、细胞色素c释放和DNA降解诱导凋亡[33.-35］．本研究可能通过在体内阻断KCa 3.1通道来维持细胞内外间的离子平衡，从而减少细胞凋亡[36］．

未折叠蛋白的积累，钙的不平衡²⁺稳态，氧化应激和缺血是一些因素，这些因素诱导多个器官中退化和纤维化障碍中的ER应激[14.那37］．GRP78是一种内质网应激伴侣蛋白，在维持内质网蛋白合成、折叠和细胞内钙稳态方面发挥重要作用[10.那38］．通过评估GRP78蛋白在II型AECs和巨噬细胞中表达水平的增加，我们证明了用senicapoc阻断KCa3.1离子通道可显著延缓II型AECs和巨噬细胞内质网应激的速率。我们的研究结果与之前评估钙依赖内质网应激与KCa3.1通道之间相关性的研究结果一致，KCa3.1离子通道的阻断或基因缺失被证明可以减少钙离子²⁺过载并衰减人类和小鼠的星形胶质细胞中的r r压力[39］．虽然这些实验正在处理人和小鼠脑细胞，但调查结果与在用Senicapoc处理的II型AECS和肺巨噬细胞中的Bleomycin诱导的ER应激的降低一致。

我们发现，批准的抗纤维化药物Pirfenidone的给药也降低了II型AECS和巨噬细胞中凋亡的细胞凋亡率。负责Pirfenidone抗纤维化作用的潜在分子机制尚不完全理解。已知pirefenidone抑制tgf-β人肺成纤维细胞的刺激胶原合成、肌成纤维细胞分化和成纤维活性[4.-6.］．肺泡巨噬细胞，II型A​​ECS，肌纤维素和嗜酸性粒细胞是TGF的主要来源β肺纤维化[40］．作为tgf-β是II型AECS凋亡的有效诱导剂，Pirefenidone可以通过抑制TGF来发挥其效果β途径。

5.结论

在体内阻滞具有KCA3.1离子通道的特异性抑制剂，可缓解II型AECS和巨噬细胞的ER应激和凋亡。我们的数据介绍了这种药物如何与这些细胞类型在纤维化肺组织中与这些细胞类型相互作用，从而有助于了解其肺纤维化中的抗纤维化作用。

缩写

IPF:	特发性肺纤维化
呃：	内质网
AECS：	肺泡上皮细胞
KCa3.1:	钙活化钾离子通道
GRP78：	葡萄糖调节蛋白78
食品药品监督管理局:	食品和药物管理局
TGF -β：	转化生长因子β
十四：	最佳切削温度
PBS:	磷酸缓冲盐
TDT：	末端脱氧核苷酸转移酶
BSA：	牛血清白蛋白
NSS:	正常绵羊血清
Tunel：	末端脱氧核苷酸转移酶-UTP缺口末端标记
轻拍:	Diaminobenzidine
SEM：	标准错误的手段
LC:	留下尾部
RC：	正确的尾
BLM：	博来霉素。

数据可用性

本研究中的原始数据集可以根据要求从相应的作者获得。

伦理批准

所有与绵羊实验和样本采集相关的实验程序均由墨尔本大学(帕克维尔，维克，澳大利亚)动物实验伦理委员会批准，并遵守澳大利亚为科学目的护理和使用动物的行为准则。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

UEP是研究的主要研究人员;她进行了实验室工作统计分析和解释。UEP和KJS参与了概念和学习设计并准备了稿件。LO和SNVD在研究方法中建议。如免疫组织化学辅助。AS和HBD协助编制了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

致谢

作者要感谢墨尔本大学解剖病理学技术员Paul Benham先生，感谢他在绵羊免疫组化方面的帮助。

参考文献

1. N. Sakai和A. M.标签，“二纤维化二：上皮细胞 - 成纤维细胞相互作用，肺纤维化”Biochimica et Biophysica Acta（BBA）分子疾病基础，卷。1832年，没有。7，pp。911-921,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. G. Raghu, M Remy-Jardin, J. L Myers等，“特发性肺纤维化的诊断。正式的ATS/ERS/JRS/ALAT临床实践指南美国呼吸系统杂志CHINESS第198卷第2期5，页44 - e68, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. M. Plataki, A. V. Koutsopoulos, K. Darivianaki, G. Delides, N. M. Siafakas，和D. Bouros，“特发性肺纤维化上皮细胞中凋亡和抗凋亡标志物的表达”，胸部，第127卷，第127期1，页266-274,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. K. Meyer和C. Decker，《吡非尼酮在治疗肺纤维化中的作用》，治疗和临床风险管理，卷。13，pp。427-437,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. G. Margaritopoulos, E. Vasarmidi, K. Antoniou，“吡非尼酮在特发性肺纤维化治疗中的作用:基于证据的治疗地位综述，”核心证据， 2016年第11卷，第11 - 22页。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. U. Costabel，E.Bendstrup，V.Cottin等，“特发性肺纤维化的Pirfenidone：专家小组关于药物相关不良事件管理的讨论”治疗进展第31卷第1期4, pp. 375-391, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. S.-J。Kim, P. Cheresh, R. Jablonski, D. Williams, and D. Kamp，“线粒体DNA在介导肺泡上皮细胞凋亡和肺纤维化中的作用”，国际分子科学杂志，第16卷，第5期。9、pp. 21486-21519, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. S. Johnson，S. B. Shaikh，F. Muneesa，B. Rashmi和Y.P.Bhandary，“辐射诱导凋亡和肺纤维化：姜黄素有效干预？”国际放射生物学杂志，卷。96，没有。6，pp。709-717,2020。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. a . J. Byrne, T. M. Maher, C. M. Lloyd，“肺巨噬细胞:纤维化性肺病的新治疗途径?”分子医学发展趋势第22卷第2期4, pp. 303 - 316,2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. 李勇，“钙离子载体A23187对转化生长因子-beta1刺激的肝星状细胞凋亡的影响”，细胞应力和伴侣， 2018年第23卷第1页。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. V. Sharma，R. Kaur，A.Bhatnagar和J. Kaur，“低pH诱导的细胞凋亡：内质网的作用胁迫诱导的钙渗透性和线粒体依赖性信号传导”细胞应力和伴侣，第20卷，第2期。3, pp. 431 - 440,2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. W. E. Lawson, P. F. Crossno, V. V. Polosukhin等，“肺泡上皮细胞内质网应激在IPF中是突出的:与表面活性蛋白加工改变和疱疹病毒感染的关联，”美国生理学杂志-肺细胞和分子生理学，卷。294，不。6，PP。L1119-L1126,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. A. J. Ryan, J. L. Larson-Casey, C. He, S. Murthy, and A. B. Carter，“石棉诱导的钙稳态破坏诱导巨噬细胞内质网应激”，生物化学杂志第289卷，第289期。48, pp. 33391-33403, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. J.A.KROPSKI和T.Blackwell，“内质网在纤维化疾病发病机制中的内质网胁迫”，临床调查杂志，第128卷，第128号1, pp. 64-73, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. M. Thamsen，“IRE1Alpha激酶/ RNase的小分子抑制在肺中具有抗纤维化作用”普罗斯一体，卷。14，不。1，2019年物品ID e0209824,2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. W. A. Wuyts，C.Agostini，K.M.Antoniou等，“肺纤维化的发病机制：移动目标”欧洲呼吸杂志号，第41卷。5, pp. 1207-1218, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. “内质网应激在特发性肺纤维化发病机制中的作用”，中国生物医学工程学报，2017,34(4):531 - 534。美国翻译研究杂志，第9卷，第5期。2，第722-735页，2017。视图:谷歌学者
18. H. Wulff和N. A. Castle，“KCA3.1的治疗潜力阻止：最近的进展和有前途的趋势，”《临床药理学专家评论》，第3卷，第2期。3，页385-396,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. L. Sevelsted Moller:“钙激活钾通道KCa3.1是肝脏损伤的重要调节因子。”科学报告，卷。6，p。28770,2016。视图:谷歌学者
20. A. Olivan-Viguera，“抑制中间导钙激活的K通道（KCA3.1）和通过α-亚麻酸的成纤维细胞培养物和溶酶体储存障碍，法布里疾病和Niemann挑选的通道表达的改变，”前沿生理学， 2017年第8卷，第39页。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. I. Grgic, E. Kiss, B. P. Kaistha等，“靶向阻断KCa3.1钾通道可减轻肾纤维化。”国家科学院的诉讼程序，卷。106，没有。34，pp。14518-14523，2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. K.M. Roach，“K +通道KCA3.1作为特发性肺纤维化的新靶标”普罗斯一体，卷。8，不。12，2013年物品ID e85244,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. H. B. Derseh，“在博莱霉素诱导的肺纤维化大动物模型中，KCa3.1通道阻断减弱微血管重构，”科学报告，第9卷，第5期。1, p. 19893, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. L. Organ，B.Bacci，E.Koumoundouros等，“抑制KCA3.1通道减轻了大型动物模型中建立了肺纤维化”的肺纤维化“美国呼吸细胞与分子生物学杂志，卷。56，没有。4，pp。539-550,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. L. Organ，B.Bacci，E.Koumoundouros等人。，“绵羊源霉素诱导肺纤维化的新细分挑战模型”实验肺部研究号，第41卷。3，pp。115-134,2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. S. N.V.V.Vewage，“Pirefenidone在肺纤维化羊模型中的疗效”美国呼吸系统杂志CHINESS，卷。45，不。9-10，第310-322,2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. M.Korfei，C.Ruppert，P.Mahavadi等，“散发性特发性肺纤维化上皮内质网胁迫和凋亡，”美国呼吸系统杂志CHINESS，第178卷，第2期8，第838-846页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. R. V. Rao, H. M. Ellerby和D. E. Bredesen，“内质网应激与细胞死亡程序的耦合”，细胞死亡与分化，第11卷，第5期。4，页372-380,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. K.Kuwano，N.Hagimoto，T.Maeyama等，“线粒体介导的特发性间质肺炎的肺上皮细胞凋亡”，实验室调查，卷。82，没有。12，pp。1695-1706,2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
30. J. M. Isner，M.Kearney，S. Bortman和J.Pasteri，“人类动脉粥样硬化和再狭窄的细胞凋亡”，循环第91卷第1期11，第2703-2711页，1995。视图:出版商的网站|谷歌学者
31. B. M. Brown, B. Pressley，和H. Wulff，“KCa3.1通道调节剂作为胶质母细胞瘤潜在的治疗化合物”，当前神经药理学，第16卷，第5期。5，pp。618-626,2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. T. L. Peña, S. H. Chen, S. F. Konieczny, and S. G. Rane，“Ras/MEK/ERK上调成纤维细胞KCaChannel FIK是碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-的共同机制β肌生成抑制”,生物化学杂志，卷。275，没有。18，pp.13677-13682,2000。视图:出版商的网站|谷歌学者
33. “离子对缺血性脑卒中后细胞体积变化和细胞死亡的调控”，平移中风研究，卷。5，不。1，pp。17-27，2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
34. M. I.Panayiotidis，C. D. Bortner和J.A.Cidlowski，“关于细胞凋亡的离子调控机制：Na + / K + -Atpase请站起来？”作为(Oxf)，卷。187年，没有。1-2，PP。205-215,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
35. A. Kondratskyi, K. Kondratska, R. Skryma，和N. Prevarskaya，“凋亡调控中的离子通道”，Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Biomembranes，卷。1848年，没有。10，pp。2532-2546,2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
36. P. A. Lang，“Ca2+激活的K+通道在人红细胞凋亡中的作用”，最荣幸，卷。285，PP。1553-1560,2003。视图:谷歌学者
37. N.Khodaee，“内质网膜钾通道功能障碍高脂饮食诱导大鼠肝细胞应激”，“最荣幸， vol. 13, pp. 1075-1087, 2014。视图:谷歌学者
38. M. Liu，G. Shi，A. Zhou，C. E.Rupert，K.L.K.Coulombe和S. C. Dudley“展开蛋白质反应的激活下调人类诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞中的心脏离子通道。”分子与细胞心脏病学杂志，卷。117，pp。62-71,2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
39. Z. Yu，“Ca（2 +） - 依赖性内质网与星形梭菌的应力相关性涉及kca3.1的上调和对Akt / mtor信号传导的抑制作用”《神经炎症，卷。15，不。1，p。316,2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
40. X. Yue，B. Shan和J. A. Lasky，“TGF-β：肺纤维发生的巨毛，”《神经炎症，卷。6，不。2010年2日。视图:出版商的网站|谷歌学者

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