所有实验程序有关羊实验和样品收集动物实验伦理委员会批准,墨尔本大学(Parkville,维多利亚,澳大利亚)和澳大利亚遵守行为准则的动物保健和使用科学的目的。羊肺组织样本获得的另一项研究[ 25),实验设计简要如下。

肺纤维化是诱导在八个女性美利奴羊( n= 8)年龄在9 - 12个月内,使用硫酸博来霉素(Hospira、墨尔本,维多利亚,澳大利亚)准备0.6 U博来霉素/毫升生理盐水的浓度( 25]。从准备博来霉素溶液,5毫升丸进入管理所需的肺段通过光导纤维支气管镜活检港口(总剂量3 U博来霉素/肺段)。同样,5毫升的0.9%无菌生理盐水注射侧尾肺段作为内部控制(图 1)。博来霉素/第二剂量生理盐水是管理相同的肺段后14天(数字 1(一)和 1 (b))。然后,羊都被另一个14天肺纤维化发展。所有的羊都牺牲在28天管理静脉注射巴比妥酸盐(Lethabarb、Virbac动物卫生、澳大利亚)。

肺被移除在验尸和有针对性的肺段中被确认。尾部分有针对性的肺叶分离出来,插管,让细支气管充气的片段1:1的混合最优切削温度(10月)和无菌PBS溶液的压力下大约20厘米/ H₂啊,为了保护肺组织架构在处理。然后,0.5厘米厚肺组织样本固定在4%多聚甲醛其次是70%的乙醇和加工石蜡进行组织病理学分析。

持续伤害II型原子能委员会和肺巨噬细胞可能导致ER应激,进而可以进展到细胞凋亡。葡萄糖调节蛋白78 (GRP)是最合适的ER伴护蛋白质之一,作为一个典型的标记来评估ER应激。免疫组织化学进行了使用兔单克隆anti-GRP78主要抗体(Abcam (ab108615))来评估ER应激II型原子能委员会和巨噬细胞石蜡肺部分。每个试验与消极的控制执行不增加主要抗体。

石蜡部分受到deparaffinization补液,沉浸在二甲苯三5分钟变化,紧随其后的是两个5分钟的变化绝对乙醇,其次是70%的乙醇为5分钟。抗原使用预检索进行柠檬酸缓冲(pH-6)加热15分钟,和幻灯片离开冷却10分钟洗PBS紧随其后。然后,幻灯片保存在3% H₂O₂10分钟阻断内源性过氧化物和用PBS彻底冲洗。未稀释的胎牛血清(FCS)被添加到每个幻灯片和孵化1小时阻止非特异性抗原的绑定。Anti-GRP78抗体(Abcam ab108615)稀释1:50与FCS添加到每个样本和孵化1小时。幻灯片与PBS轻轻冲洗,然后设想^TM双重链接system-HRP(辣根过氧化物酶)(Dako、北美Inc .)、钙、美国)和孵化申请30分钟。抗原抗体反应,形象化新星红过氧化物酶底物(美国CA向量实验室Inc .)被添加到每个样本和孵化为3分钟。然后,样本用蒸馏水洗净和苏木精counter-stained停止反应。

点击它^TM比色末端Transferase-dUTP尼克结束标记(TUNEL)试验(点击它^TMTUNEL比色包含IHC检测装备,美国热费希尔科学)进行石蜡肺组织部分评估II型原子能委员会和巨噬细胞营业额在羊bleomycin-induced肺纤维化模型(图 2)。每个试验与消极的控制执行不增加负反应混合物。石蜡切片是由二甲苯deparaffinized和水化和乙醇分级系列根据制造商的说明(点击它^TMTUNEL比色包含IHC检测设备,热费希尔科学,美国)。幻灯片蘸1% H₂O₂10分钟阻断内源性过氧化物酶。稀释蛋白酶K(稀释比例1:50)被添加到每个样本和孵化5分钟。然后,样品被封锁与阻断缓冲区(1%牛血清白蛋白(BSA) + 5%正常羊血清(NSS) + PBS) 30分钟。幻灯片是用PBS彻底洗5分钟前3次每一步。末端转移酶(TdT)反应,幻灯片是孵化的负反应缓冲了10分钟。负反应混合物准备根据制造商的协议并将其添加到每个幻灯片和孵化了60分钟。与PBS充分冲洗后淬火TdT反应,幻灯片被浸在盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲了15分钟,然后在PBS和点击它TUNEL比色清洗解决方案。点击它TUNEL比色反应鸡尾酒(点击它反应缓冲+ CuSo4叠氮化生物素+反应缓冲区添加剂)是根据制造商的建议,准备添加到每个样本,孵化了30分钟。样本用PBS洗净并单击比色清洗解决方案。然后,样本孵化与Streptavidin-Peroxidase 30分钟洗PBS和去离子水紧随其后。 DAB was diluted 1 : 200 with DAB substrate buffer and added to each sample and kept for 30 seconds to facilitate the reaction. Then, the sections were washed with deionized water to stop the reaction and counter-stained with methyl green. 2 g of methyl green was dissolved in 100 ml of distilled water and extracted in chloroform to remove the crystal violet. Working solution was prepared by mixing 1 : 1 methyl green with 0.1 M acetate buffer. Slides were then counter-stained with methyl green for 10 min, followed by quick dehydration with 70% and 100% ethanol and fixed in xylene.

羊肺组织得到从我们以前的研究( 24, 26),下面是一个简单的实验设计的描述。肺纤维化是诱导30美利奴羊( n= 30)年龄在9 - 12个月使用博来霉素如上所述(数字 3(一个)和 3 (b))。羊被允许制定另一个2周的肺纤维化。羊被随机分成三组( n= 10)。然后每组采用了30毫克/公斤senicapoc (Icagen Inc .、杜伦、数控)/ pirfenidone(美国Selleckchem)或甲基纤维素(控制)0.5%甲基细胞MC (Sigma-Aldrich,城堡山、新南威尔士、澳大利亚)每天口服两次。的治疗方案、羊被管理牺牲静脉注射巴比妥酸盐(Lethabarb、Virbac动物卫生、澳大利亚)和肺组织收集和处理如上所述。ER应激和II型原子能委员会和巨噬细胞的凋亡,被染色对anti-GRP78和TUNEL分析评估,分别如上所述。

使用徕卡DM500显微镜图像被抓获。二十个代表重叠字段选择和捕获的40倍放大。棕色染色细胞数在每个字段和表达手段和标准错误方式(均值±SEM)。II型原子能委员会和巨噬细胞被确定基于他们的形态。II型原子能委员会是立方形的细胞集中位于细胞核和细胞基底膜所覆盖,与一小部分暴露在肺泡表面( 3]。巨噬细胞被确定大型著名核和细胞质颗粒形状不规则。

统计分析进行了使用软件GraphPad 8.0.1棱镜版本Windows(美国加州拉霍亚GraphPad软件)。正常测试了使用D 'Agostino-Pearson综合正常测试。 t执行以及评估ER应激和凋亡在II型原子能委员会和绵羊肺组织中巨噬细胞。senicapoc和pirfenidone ER应激的影响和II型原子能委员会和巨噬细胞营业额评估使用单向方差分析与图基的事后测试组之间的多重比较。一个观察 p 值小于0.05 ( p < 0.05)被认为是具有统计学意义。

ER应激的数量被确定评估GRP78 immuno-positive细胞部分抽样从不同治疗肺段事后剖析(数据收集 1(一)和 1 (b))。ER应激在II型原子能委员会和肺巨噬细胞被红胞质染色显示,表明GRP78蛋白的高表达(图 1 (c))。ER应激的速度II型原子能委员会在绵羊肺组织显著增加两周后他们被注入了博来霉素(博来霉素1.16±0.17 vs 0.27±0.06细胞/盐水, p =(图0.0002) 1 (d))。同样,有一个显著增加的速度与巨噬细胞ER应激控制/生理盐水相比,博来霉素灌注肺段(博来霉素3.30±0.84 vs 0.46±0.24细胞/盐水, p =(图0.006) 1 (e))。

广泛的核DNA碎片由于内切酶激活是一个晚期凋亡的标志。DNA片段(TUNEL-positive)是由布朗表示核染色II型原子能委员会和巨噬细胞(图 2(一个))。如图 2 (b),II型原子能委员会的细胞凋亡率显著增加在bleomycin-infused肺段saline-infused相比肺段(博来霉素1.64±0.25 vs盐水0.28±0.07凋亡细胞/字段, p = 0.0001)。显著增加的数量也观察到凋亡的巨噬细胞bleomycin-infused肺段,与对照相比,肺段(博来霉素1.06±0.20 vs盐水0.22±0.08凋亡细胞/字段, p = 0.0001)。

KCa3.1离子通道已经被证明能够起到关键作用的发展ER应激和凋亡在II型原子能委员会和肺巨噬细胞( 18]。因此,我们调查是否ER应激和凋亡在II型原子能委员会和肺巨噬细胞可以减少阻塞Ca^{2 +}激活K⁺离子通道(KCa3.1)使用KCa3.1-specific离子channel-blocking senicapoc药物。在这个实验中,我们评估了ER应激和细胞凋亡在肺组织中各自的最后一博来霉素灌注组7周后。组织结构和实验过程的时间表在这个实验中给出的数字 3(一个)和 3 (b)。

胞质表达ER应激标记GRP78在巨噬细胞和原子能委员会显示不同治疗肺段的图 3 (c)。控制羊处理甲基纤维素,有增加数量的GRP78-positive II型原子能委员会(盐水0.19±0.04 vs博来霉素0.68±0.12细胞/字段, n= 10, p =(图0.0003) 3 (d)0.32±0.10)和巨噬细胞(生理盐水对博来霉素1.46±0.42细胞/字段, n= 10, p =(图0.005) 3 (e))bleomycin-infused肺段saline-infused相比段。这表明,疾病模型是正常。当羊组接受senicapoc或pirfenidone与甲基纤维素对照组相比,原子能委员会的数量表达GRP78蛋白在bleomycin-infused显著降低肺段羊对待senicapoc或pirfenidone (senicapoc 0.26±0.06 vs 0.68±0.12细胞/汽车领域, n= 10 p = 0.002;pirfenidone 0.36±0.04 vs 0.68±0.12细胞/汽车领域, p =(图0.01) 3 (d))。此外,senicapoc和pirfenidone-treated羊的数量GRP78-positive原子能委员会在bleomycin-infused肺段saline-infused肺段(图没有明显不同 3 (d))。ER应激增加这些数据表明,原子能委员会由于博来霉素伤害与治疗与pirfenidone或senicapoc减毒。

巨噬细胞,只有senicapoc治疗显著降低巨噬细胞的数量在肺段暴露在博来霉素ER应激,相比vehicle-treated控制肺段受伤由博来霉素(senicapoc 0.47±0.11 vs 1.46±0.42细胞/汽车领域, p = 0.017;pirfenidone 0.86±0.11 vs 1.46±0.42细胞/汽车领域, p =(图0.2) 3 (e))。在senicapoc-treated羊,GRP78-positive巨噬细胞的数量在bleomycin-infused saline-infused肺肺段没有明显不同部分(图 3 (e))。GRP78-positive巨噬细胞的数量在bleomycin-infused肺段pirfenidone-treated羊高于saline-infused肺段,数据也没有明显不同(图 3 (e))。

TUNEL-positive支离破碎的DNA是布朗作为核染色II型原子能委员会和巨噬细胞不同治疗肺段在图 4(一)。控制羊处理甲基纤维素,有增加数量的TUNEL-positive II型原子能委员会(盐水0.23±0.04 vs博来霉素0.94±0.16细胞/字段, n= 10, p < 0.0001)(图 4 (b)0.14±0.04)和巨噬细胞(生理盐水对博来霉素0.53±0.07细胞/字段, n= 10, p =(图0.0001) 4 (c))bleomycin-infused肺段saline-infused相比段。这表明,疾病模型运行正常,细胞凋亡在2型原子能委员会和巨噬细胞仍然很高最后博来霉素灌注后7周。

当羊组接受senicapoc或pirfenidone与甲基纤维素对照组相比,数量TUNEL-positive原子能委员会在bleomycin-infused显著降低肺段羊对待senicapoc (senicapoc 0.43±0.06 vs 0.94±0.16细胞/汽车领域, n= 10, p =(图0.003) 4 (b))。而凋亡有较低的原子能委员会pirfenidone治疗,与甲基纤维素控制治疗相比,差异不显著(pirfenidone 0.65±0.07 vs 0.94±0.16细胞/汽车领域, n= 10, p =(图0.2) 4 (b))。senicapoc——和pirfenidone-treated羊的数量TUNEL-positive原子能委员会在bleomycin-infused肺段没有明显不同于saline-infused肺段(图 4 (b))。

巨噬细胞,治疗senicapoc显著降低肺巨噬细胞凋亡的数量部分暴露在博来霉素,相比vehicle-treated控制肺段受伤由博来霉素(senicapoc 0.31±0.04 vs 0.53±0.07细胞/汽车领域, n= 10, p = 0.04;pirfenidone 0.35±0.04 vs 0.53±0.07细胞/汽车领域, n= 10, p =(图0.1) 4 (c))。