文摘
水分子发挥关键性的作用,协调配体和大分子之间的相互作用。这些生物分子周围的溶剂环境控制他们的结构和在protein-ligand交互中扮演重要的角色。的性质和作用的理解这些水分子活性位点的蛋白质可以大大提高效率的合理药物设计方法。我们表现的比较醛糖还原酶的晶体结构分析理解晶体的作用水protein-ligand交互。分子动力学模拟显示的多功能性质水分子在H桥键的相互作用。居住和生活时间的水分子依靠共晶配体出现在结构的类型。定制的信息可能是有用的在rational方法配体,从而桥H-bonding入住率和寿命更长时间。
1。介绍
糖尿病是一种使人衰弱的疾病导致严重的并发症和缩短寿命。Diabetes-specific微血管疾病会导致失明、肾衰竭和神经损伤,diabetes-accelerated动脉硬化,增加心肌梗死的风险,中风和截肢(1]。胰岛素治疗组织不需要胰岛素并不能防止并发症如神经病变、视网膜病变、肾病、白内障(2]。大型前瞻性临床研究显示强大glycaemia和糖尿病微血管并发症之间的关系在1型和2型糖尿病(3]。高血糖症和胰岛素抵抗是建议macrovascular并发症的发病机制中扮演很重要的角色4]。
醛糖还原酶2 (ALR2 alditol: NAD (P) 1-oxidoreductase, EC 1.1.1.21)是第一个酶催化作用的多元醇通路NADPH-dependent减少D葡萄糖D山梨糖醇(5]。胞质,单体的氧化还原酶,催化作用NADPH-dependent减少各种羰基化合物包括葡萄糖(6]。糖尿病高血糖症下,多余的葡萄糖是由多元醇代谢通路(图1)。这个途径组成的两种酶,即ALR2从而减少多余的葡萄糖到山梨糖醇,山梨糖醇脱氢酶山梨糖醇转化为果糖。糖尿病的并发症与山梨糖醇的过度积累,并针对多元醇通路通过抑制ALR2治疗提供了一个选项(7]。
在正常生理条件下,ALR2参与渗透调节而hyperglycaemic条件下导致严重的糖尿病并发症的发生和发展8]。高葡萄糖水平提高的活动ALR2通过直接增加葡萄糖通量通过这个途径和间接形成活性氧(ROS)的激活ALR2 [9]。增加ALR2导致酶活性降低NADPH /辅酶ii+比,它影响其他NADPH-dependent酶,如一氧化氮(NO)合酶,谷胱甘肽还原酶(10]。没有水平的降低导致减少神经传导和微血管错乱。抗氧化谷胱甘肽还原酶的酶引起的延迟活动氧化应激在糖尿病条件下(11]。抑制ALR2将提供一种避免糖尿病的并发症,因此,确定抑制剂是一个重要的药物目标。
Epalrestat是唯一成功的醛糖还原酶抑制剂治疗糖尿病神经病变在日本销售。许多有前途的化合物不同在体外和在活的有机体内之外的研究未能进行临床试验。缺乏功效和不利影响由于特定的抑制剂,并可能抑制相关醛还原酶是ALR2抑制剂的发展的主要瓶颈。催化机理和可用的知识结构信息的当前抑制剂加上ALR2可以帮助加速特定抑制剂的发现或设计。有限数量的当前可用药物治疗糖尿病并发症的只有新所表明的重要性研究12]。
ALR2单体(35.8 kDa),由单个基因位于染色体编码地区7 q35。ALR2,与315年由一个多肽链组成的残留物。水晶是单个域结构折叠成一个eight-stranded平行α/β主题。substrate-binding站点位于裂的羧基末端β桶,涉及循环残留。大型和高度疏水活性部位位于(的羧基端β/α)8桶。到目前为止,有95的ALR2晶体沉积在蛋白质数据银行13]。配体结合位点是一个大型,深,椭圆的口袋里的烟酰胺环NADPH代数余子式躺在基地。酶具有阴离子结合口袋和特异性的口袋(图2)。阴离子结合口袋里有酪氨酸48、His110 Trp111, Trp 20日Phe122, Trp 219而特异性口袋被残留Trp111排列,Thr113, Phe122, 300年阿拉巴马州299,低浓缩铀。
我们在座的分子动力学模拟研究ALR2酶的晶体结构。此外,我们的研究的目的是评估的重要性水晶水分子的活性部位ALR2。这些水分子调解氢键和帮助所绑定的活性部位。
2。材料和方法
2.1。比较规律晶体结构分析
87年人类规律得到的晶体结构蛋白质数据库(PDB) [13]。晶体被“同源”对齐对齐项目生物高聚物在Sybyl7.1模块,以酶蛋白(PDB id: 1广告)作为参考结构(14]。分析了晶体的命令/守恒的水分子在活性部位使用PyMol [15]。
2.2。MD模拟输入文件的准备
可用在所有人类ALR2的晶体结构,五个晶体结构有不同的配体(z89 t40 PDB id: 1, 1, 2 fz8 3 h4g和3 g5e)选择理解水分子结合的配体的作用与人类ALR2 [13]。的晶体结构被PDB坐标。失踪的残留物被添加,突变残留纠正使用薛定谔野生型残留大师包(16]。失踪的氢原子的配体和代数余子式添加使用薛定谔大师包中。AM1-BCC指控是用于配体以及代数余子式NADPH,使用前厅程序计算。参数使用一般的配体生成琥珀力场(赌博)和前厅模块琥珀而ff99SB力场被用于蛋白质。失踪的氢原子的蛋白质结构是琥珀的添加使用跳跃模块。氨基酸是保存在默认的电离状态。水晶水分子都在准备系统。复杂的使用斜方晶系的溶剂化TIP3P水盒,盒子的边缘之间的距离,和外围的蛋白质是8埃17]。溶剂化系统中和通过添加所需的反离子的数量。一个两阶段的方法是采用减少蛋白质。在第一阶段,蛋白质,配体和代数余子式固定约束较弱(10千卡/ mol-A2),只允许溶剂最小化。然后,在第二阶段,整个系统是最小化。最初,最小化最陡下降1000步的进行,这是紧随其后的是共轭梯度最小化的另一个500步。此后,减少溶剂,整个系统由水、蛋白质、和配体代数余子式是2500步没有约束最小化。
最小化过程之后,系统加热从0到300 K。为了避免任何在MD生产运行不稳定,一个初始的MD运行进行了核不扩散条约合奏(压力= 1条,温度= 300凯尔)平衡系统20 ps限制溶质较弱。生产运行进行了5纳秒时间,使用NVT系综和朗之万动力学用于控制温度通过碰撞频率1.0 ps−1(18]。步长一直在模拟2 fs。抖动算法应用于限制债券涉及氢原子(19]。范德瓦耳斯截止一直8埃和长程静电相互作用治疗使用粒子网格埃瓦尔德(中外)方法。坐标保存每1000步之后,终于用于分析。
所有模拟都使用桑德AMBER10程序包。分析使用VMD和琥珀Ptraj模块工具(20.]。此外,妄想和Pymol用于分子可视化(21]。
2.3。MM-PB (GB)股价计算
MMPBSA计算进行5复合物:1 t4o 1 z89 2 fz8 3 h4g和3 g5e。的相互作用能和salvation-free能源复杂,计算受体和配体的帮助下快照提取每10 1.5 ns的ps 5 ns。结果计算得到的平均估计的结合自由能。结合能的计算进行了与MM_PBSA MM_GBSA为了比较方法。此外,结合能也估计MM-PBSA薛定谔的主要模块的程序大师包中。
3所示。结果与讨论
3.1。比较ALR2复合物的晶体结构分析
人类ALR2的87晶体结构都是一致的“同源性调整”项目在Sybyl7.1生物高聚物模块中,酶蛋白,1广告作为参考结构。这个模块将蛋白质序列相似性的基础上。裁缝变量控制的差距点球,谜团,和相似矩阵。叠加C的序列进行比较α骨干,侧链,所有原子。的晶体结构有一个表示值大于0.5被否决。选中的28个晶体结构进行了分析使用Accelrys发现Studio 2.0 (22)和Pymol可视化和识别原子参与配位体绑定包括水分子活性位点。分析原子后,23岁的晶体结构被发现有水分子的活性部位显示氢键相互作用。
的标准选择氢键的键长是不应大于。观察活性部位有更多数量的桥接水分子在阴离子NADPH的口袋,而不是配体(表1)。我们假设中的磷酸基NADPH负责。配体被发现与至少一个水分子的活性部位。水分子是桥接,如果他们同时使氢键配体和氨基酸残基。
3.2。配体结合网站的分析
晶体结构、1 t40 1 z89 2 fz8 3 h4g和3 g5e,被选作进一步的研究。活动网站分析5配位识别区域的水分子数量和氢键相互作用与相应的配体。指出,大部分的结构至少有一个水分子的活性位点表明氢键与配体的相互作用。在图3的配体2 fz8和3 h4g使水分子的氢键在活性部位。所有的配体,除了1 z89,取代了9下令水分子活性位点的酶蛋白,而配体1 z89流离失所的6个水分子。这些差异可以归因于大小和构象配体的活性部位。5配合物,在叠加酶蛋白,显示他们的配体,取代6下令水分子活性位点的酶蛋白。配体的大小从3 h4g正好等于占用的大小6下令水分子酶蛋白;然而,其他配体有一个扩展的构象在阴离子和特异性。
(一)
(b)
3.3。结合自由能计算
明确以下所有复合物溶剂MD模拟进行了研究。复杂地层的绝对约束力的自由能估计从能量和熵的贡献,并为快照从轨迹中提取计算。的快照的蛋白质和复合物被从分子动力学(MD)和进一步加工2 ns使用周期性边界条件。快照只提取游离分子的溶剂化复杂的轨迹。共有1000个快照提取2 ns的轨迹,每一个都有200个快照的溶剂化复杂。
溶剂化自由能被计算为极性和非极性的贡献的总和,使用溶剂的连续表示。极地的贡献是通过求解泊松方程计算。非极性溶剂化自由能贡献由于空腔的形成和范德华相互作用,溶质和溶剂之间,估计solvent-accessible表面积。总的结合能是负面的复合物,它意味着良好的protein-ligand复合物。执行后的结果结合自由能模拟2 ns如表所示2。尽管结果显示zopolrestat,第二个强有力的配体(2 fz8)最高的亲和力,而磺酰pyridazinone (1 z89)最低绑定关联。抑制剂最大效力的区别之间的2.8最大规模和最有效的配体的图片50。它仅仅表明同时自然生物活性的相关性将划定的预测由于缺乏广泛的结合自由能。
的静电对溶解自由能的贡献5配合物如表所示3。Δ的和Δ静电(避署)和范德瓦耳斯就是secu * tanu减去VDW()的贡献,分别计算了MM力场。Δ的的内部能量(INT)引起的债券,角度,在MM力场二面角术语。就是secu * tanu减去VDW避署的总和,,,INT称为气相总能量。Δ的是计算出的非极性溶剂化自由能贡献的实证模型,而Δ吗静电溶解自由能的总和,MM静电能量。1 z89溶解自由能,使最高贡献3 g5e最低。非极性的贡献在所有五个复合物溶剂化作用是相似的。静电成分溶解自由能计算GB模型。极地贡献溶解自由能计算了应用线性PB模型和GB的扩展模型。它剥夺绑定ALR2蛋白质配体复合物。PB和GB计算给在这方面非常相似的结果。
此外,Δ计算的ALR2晶体结构有或没有晶体分子被发现合理。的结合能ALR2复合体没有水晶水被观察到的低3 - 7千卡每摩尔比与水复合物。它清楚地表明,晶体水分子帮助强大和稳定的protein-ligand复合物(表3)。
3.4。分子动力学模拟与水分子结晶
显式的模拟进行了晶体structures-1Z89, 2 fz8和3 h4g(图4)。水分子结晶被保留在这个仿真。清澈的河水的概念是棘手的MD模拟由于水是高度流动的,因此,他们迅速交换。即使在紧张的接口,比如protein-nucleic酸接口,结合水的一生是在纳秒时间尺度。因此,配体周围的海域溶解壳计算处理后的轨迹ptraj模块的琥珀。这个功能的输出包含第一壳体和第二壳体的水域。第一个溶解壳从溶质代表3.4的距离,也就是说,配体的利益而第二个溶解壳代表的距离5配位体的质心。分析提出了分别为每一个复杂。
(一)
(b)
3.4.1。1 z89分析复杂
1 z89是人类ALR2,加上小说sulfonyl-pyridazinone (62 p), 0.95的分辨率。抑制剂的pyridazinone集团占据了催化部位,而chlorobenzofuran一部分渗透开放特异性的口袋里。pyridazinone展览的亲和力与tolrestat sorbinil,显示IDD594相比略微降低了亲和力。62 p取代6下令水分子存在的酶蛋白1广告,而其他配体取代9水分子的酶蛋白。从晶体的分析,观察到O18的配体与HOH1147氢键相互作用。其他氢键相互作用观察O7 Tyr48哦,NE2 His110和陶瓷NE1 Trp111。随着模拟的进行水分子的位置波动图所示图5(一个)。图表显示了水分子的运动在第一和第二溶解壳在整个模拟。水分子为氧原子的位置是稳定的,但它与氢原子自由翻滚跳跃之间的氢键网络的几个位置。情节的水分子的数量波动在整个仿真过程中明确5 ns图所示5(一个)。
(一)
(b)
水分子的数量在第一溶剂化作用壳被发现1平均在5 ns仿真。然而,第二溶剂化外壳,有3个水分子平均。了解水协会、视觉分析领域的高入住率或搜索一个特定的水相互作用(表是很有用的4)。入住率被定义为比例在整个轨道的距离和角度标准得到满足。
一个网格生成100埃的溶质。结构安装在一个共同的参照系,RMS适合第一帧,所有的溶质分子的蛋白质。如果水分子在空间固定暴跌将与分子但网格并不固定在第一帧的位置。如果水是在同一位置对生物分子,然后水分子将侧链。由于电网不动,可以跨多个网格元素的密度。这将给一个想法的可能的水分子参与蛋白质的活性部位为模拟的进展。
水化网站是由水密度通过使用当地坐标系统水化网站。水结构分解成水化网站由水从蛋白质表面密度。这给了水分子的结构和动态属性显式的模拟。性能研究包括站点占用,邻近水域和氢键。水的入住率在配体磺酰pyridazinone分析了妄想。从密度地图,发现周围的密度集中O18 O7配体,在本机水晶是使水分子的氢键。
所示蛋白配体的表面表示正在与一个水分子氢键,宏1147(图5 (b))。在这个仿真,水晶水域被移除,但配体周围的水密度显示保留水分子的位置,也就是说,他们被显式地添加的水分子。密度是在同一位置配体与水分子,和同样的模式在剩下的复合物。这说明水分子的位置保存在所有属于这个家庭的复合物。
3.4.2。分析复杂2 fz8
绑定zopolrestat占据了几乎整个的c端端活性部位的口袋里β桶。抑制剂使异常多的接触活动网站。它让132联系人在≤4,110年15残留物,13的烟酰胺一半辅酶,9四个水分子有序的辅酶。这有助于良好的紧密绑定的抑制剂的影响。从我们的分析,我们发现配体取代9水分子酶蛋白中。配体的O1群使HOH1082氢键。另一个水分子也出现在活性位点,但是他们没有做任何与配体的相互作用。其他O3的配体之间的氢键相互作用是由酪氨酸48的哦,和NE2 His110;O2的零强度时间NE1 Trp111, N3 Leu300 N。
邻近的水分子的活性部位进行了研究。水的数量在第一溶剂化外壳,在配体2 fz8 6整个模拟,然而,在第二溶解壳13平均。水分子的数量在第一和第二溶剂化外壳,策划是水分子的数量对帧图中(图的数量6)。
(一)
(b)
水的入住率氧原子的配体在5 ns仿真每帧表所示5。最高的入住率是大约53% 2 fz8在模拟在不同的帧,它逐渐减少到15%,模拟的进展。
3.4.3。分析复杂3 h4g
3 h4g是一个规律与Fidarestat晶体结构(FID),这是证明有在抑制剂绑定和选择性的影响。配体取代9水分子活性位点的酶蛋白。桥接水分子之间存在HOH2275配体和蛋白质,使氢键相互作用N21, O10支撑材,2015啊。FID使氢键的O6I NE1 Trp114。同时,O10 FID氢键(HOH 2196,和O3的配体酪氨酸50的哦。
溶剂接触的程度来衡量每个网站平均数量截止距离内的邻近水域3.5和5 A,所有水域中存在的配体的活性部位,如图表(图所示7)。水分子的数量在第一溶剂化作用壳牌在配体3 h4g是整个模拟,而在第二个6平均溶解壳。图6 (b)显示了蛋白质表面的照片,配体在坚持表示,与水分子相互作用显示为红色的球体。配体是多个水分子相互作用的活性部位。
(一)
(b)
表6显示水的入住率氧原子配位体在整个模拟不同的帧。入住率和氢键的距离是整个模拟监控。最初,最高的入住率为98%,降低到89%,模拟的进展。水在这个蛋白质最高的入住率相比其他蛋白质在这项研究中,这也证实了锋利的水化网站。
同时,减少数量的水分子在水化壳(数字5(一个),6(一),7(一))。尽管ALR2活性部位的高度疏水,和水分子观察出席开幕式的活性部位腔,该地区包括在水化壳。水分子是随机模拟的进展而迁避溶剂水分子的平均数量仍类似于水分子在晶体结构。桥H-bonding互动被认为把这些水分子在高度扰乱网站。此外,没有观察到严重的结构性变化的平均骨干均方根偏差(RMSD)发现< 0.72和< 0.89为活性位点残基(5 cocrystal配体周围地区)和蛋白质(图8)。
(一)
(b)
(c)
4所示。结论
绝对的自由能评估的传统方法在MM-PB SA (GB)的方法,没有“非物质”毁灭或解耦方案并绑定到其受体的配体是必要的,也不需要一个模拟所需的部分游离状态,潜在的意思是力量使用伞抽样估计。因此,结合自由能计算MM-PB (GB)股价在两端点的绑定使用物理状态的反应,从而避免了需要把电脑的时间中间状态。因为绝对的结合自由能计算的准确性取决于一种微妙的平衡不同的能量和熵的贡献,计算在网上结合自由能仍然可以认为接近实验数据决定。
周围的水密度高入住率的配体显示区域的水在这些位置。他们密切繁殖的水分子的位置观察到晶体结构。水分子的生活时间和入住率也根据不同类型的抑制剂3 h4g有入住率为98.92%,53.55%,2 fz8, 1 z89只有16.5%。占用率也与观察到的密度,在协议中3 h4g有更多的密度在配体相比其他抑制剂。对静电自由能的贡献的溶剂化作用很低3 h4g相比其他复合物。所以desolvate绑定所需要的能量粒子在这个复杂的很低,而所需的最高能量desolvate在1 z89结合能较低。此外,绑定ALR2复合物的能量模式和没有水意味着protein-ligand中的水分子相互作用的重要性。本研究证实了水分子结构桥梁的稳定性总是出现在模拟和水分子还显示其他结构性的存在,停留时间和入住率较低的复合物。