细胞MRI显示基因工程转移性乳腺癌细胞的脑阻滞改变

摘要

意图．解剖磁共振成像(MRI)、细胞磁共振成像和生物发光成像(BLI)的联合使用使临床前癌症模型的脑转移监测更加敏感和完善。通过使用这些补充技术，我们可以测量全身给药后大脑中存活的单个细胞的停止，这些细胞的清除和/或保留，生长成明显的肿瘤，以及肿瘤体积和相对癌细胞存活率随时间的变化。虽然BLI在测量细胞活力方面非常有用，但已经报道了使用荧光素酶工程细胞的一些考虑，如增加肿瘤体积变异，改变转移性疾病的模式，以及抑制体内肿瘤生长。程序．在这里，我们应用细胞和解剖MRI来评估体内氧化铁标记naïve (4T1BR5)和荧光素酶表达(4T1BR5-氟- gfp)小鼠脑寻乳腺癌细胞的生长差异Balb/C小鼠接受心内注射20000个细胞，并在第0天和第14天进行MRI成像。接受4t1br5 - flc - gfp细胞的小鼠也在第0天和第14天用BLI成像。结果.与接受4T1BR5 FLuc GFP细胞的小鼠相比，接受4T1BR5细胞的小鼠在第0天大脑中的信号空洞数量（代表铁标记的癌细胞）显著增加( )．与接受4T1BR5-氟- gfp细胞的小鼠相比，接受4T1BR5细胞的小鼠也有明显更高的脑瘤总负担和脑转移数量( )．结论．通过使用高灵敏度的细胞MRI工具，我们证明了工程细胞不像naïve细胞那样形成肿瘤，这似乎主要是由于细胞阻滞的减少。这些结果表明，用报告基因工程癌细胞可能会改变它们对特定器官的趋向性，并为使用报告基因成像来跟踪转移癌细胞命运的研究小组强调了另一个重要的考虑体内．

1.介绍

在临床前肿瘤模型中准确量化肿瘤生长的能力对于有效研究肿瘤生物学、转移扩散和治疗反应至关重要。虽然一些皮下和原位肿瘤体积可以使用手动或电子卡钳测量，但这依赖于一个相当发达的可触摸的肿瘤。例如，许多小鼠癌症模型已经被开发出来，试图提高临床相关性，例如微小或巨大的转移在脑、骨和肺中形成，因此不能用卡尺测量。为了更好地监测亚扪及或转移性疾病的纵向生长，需要采用无创成像技术。

在临床前癌症模型中，有许多细胞和分子成像模式可用于非侵入性测量肿瘤大小、位置、代谢和转移负担，如超声(US)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、正电子发射断层成像(PET)和光学成像方式，如荧光成像和生物发光成像(BLI) [1.–3.］.其中，BLI由于其高敏感性、高通量和相对成本效益，继续是评估肿瘤生长和生存能力的最常用技术之一。对于BLI，肿瘤细胞系被设计成表达荧光素酶报告基因，最常见的是萤火虫荧光素酶(FLuc)，它产生光作为匹配的荧光素底物的氧化产物。某一特定位置产生的相对光量可以间接测量癌细胞随时间的生存能力[4.］.这是一个重要的考虑，因为较大的肿瘤可能有水肿和/或坏死，有助于肿瘤体积的成像测量，因此，高估了存在的活癌细胞的数量[5.］.此外，在评估治疗反应的模型中，肿瘤内存活组织的数量可能会在任何解剖变化发生之前发生变化。因此，BLI可以为测量肿瘤大小提供有价值的补充信息，无论是卡尺还是解剖成像模式，如MRI。

我们之前已经证明了BLI、解剖MRI和细胞MRI工具的联合使用用于监测小鼠实验性乳腺癌脑转移[6.］.细胞核磁共振成像需要癌细胞在移植到小鼠之前用培养的超顺磁氧化铁(SPIO)纳米颗粒标记[7.]。铁会导致磁场失真，导致铁敏感MRI序列中的信号丢失。SPIO产生的开花伪影比细胞本身大，因此，我们可以看到注射时单个癌细胞在大脑中停滞，以及保留其活性的非分裂癌细胞铁标签随着时间的推移[8.］.一小部分癌细胞会分裂并失去铁标记，但可以通过常规的核磁共振成像看到。通过在同一动物中同时使用细胞MRI、解剖MRI和BLI，我们可以获得活单细胞阻滞和细胞清除的测量，以及随着时间的推移跟踪大脑肿瘤生长和/或生存能力的变化[6.］.

而BLI在评估许多不同细胞群的命运方面非常有用体内包括肿瘤细胞在内，近年来也有使用BLI的考虑报道。随着荧光素酶对细胞的工程，一些研究已经注意到肿瘤体积在动物之间的变化，改变癌细胞对特定器官的取向，以及肿瘤生长速度的差异[9–12].利用细胞MRI敏感跟踪单个细胞的传播、停止、休眠或生长的能力可能为细胞工程的潜在效应提供新的见解。这项工作的目的是使用细胞和解剖MRI来描述体内naïve和慢病毒工程脑寻三阴性乳腺癌细胞在小鼠大脑中共同表达荧光和生物发光报告的生长模式

2.材料和方法

2.1。体外研究

2．1．1．细胞工程

寻找大脑的小鼠乳腺癌细胞（4T1BR5）是Patricia Steeg博士实验室（美国国家卫生研究院癌症研究中心）赠送的一种礼物，经过工程处理后可稳定共表达红移Luciola italica荧光素酶（FLuc）和GFP使用商业慢病毒载体（RediFect Red FLuc GFP慢病毒颗粒；Perkinlemer，USA）。细胞在20的多重感染下转导，并使用FACSAria III流式细胞仪细胞分选仪（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）基于GFP表达进行分选.所得4T1BR5 FLuc GFP细胞在37°C和5%CO下保持在含有10%FBS的DMEM中_2.全部的在体外实验分三次进行。

2.1.2.铁标签

对于铁标签，2 × 10^6.细胞被镀在75厘米内^3.烧瓶，补充含有10%FBS的DMEM，并允许粘附24小时。细胞再培养24小时 10小时 mL培养基，含25 μg/mL的MPIO珠(0.9µ直径m, 63%磁铁矿，闪光红标记;Bangs实验室，fisher, IN, USA)。用汉克斯平衡盐溶液(HBSS)洗涤细胞三次，然后用0.25%胰酶- edta进行胰蛋白酶化。然后收集细胞，用HBSS彻底清洗三次以上，以去除未加入的MPIO细胞，然后注射细胞在体外评价

2.1.3。碘化丙啶细胞周期测定

如上所述培养乳腺癌细胞（原始和工程4T1BR5）。细胞在1000℃下离心 转速为5分钟。然后用500%的硫酸固定细胞颗粒 μ在4°C条件下加入70%乙醇30分钟，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，并在850℃下离心 g、 然后用50%葡萄糖处理细胞 μL核糖核酸酶（100 μg / mL)。将混合物在37℃水浴中保存30分钟，然后用200染色μL碘化丙啶溶液(50μg/mL)，然后使用FACSAria III流式细胞分选仪(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)进行流式细胞仪分析。

2.1.4。扩散分析

Vybrant MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯四唑溴化铵)增殖试验用于评估基因工程是否对其产生影响在体外增殖。将4T1BR5和4T1BR5 FLuc GFP细胞接种在96孔板中(每个井的单元数）为0.25 在0、24、48和96小时评估细胞增殖 µ五十） 添加到每个孔中，吸光度为450 使用微孔板分光光度计（Fluoroskan Ascent FL，Thermorabsystems）测量nm。

2.1.5.克隆形成试验

将原始和工程化4T1BR5细胞接种在6孔板（1.0）中 × 10^3.每个井的单元数）2 mL培养基。在电镀后72小时，使用血液细胞仪手动计数每个孔中的菌落数。

2.2. 体内研究

2.2.1。实验性乳腺癌脑转移模型

根据加拿大动物保护委员会的标准和西安大略大学动物保护委员会批准的协议(协议号:2014-026)对动物进行护理。将mpio标记的4T1BR5或4T1BR5-氟- gfp细胞2.0 × 10导入大脑^4.细胞注入雌性BALB/c小鼠左心室( ;6-7周大；美国马萨诸塞州威尔明顿查尔斯河实验室）。细胞悬浮在0.1 使用Vevo 2100超声系统（加拿大多伦多FUJIFILM VisualSonics Inc.）向左心室注射1毫升HBSS和图像引导注射.在心脏内注射后第0天和第14天对所有16只小鼠进行MRI检查。此外，接受4T1BR5 FLuc GFP细胞的小鼠在心脏内注射后第0天和第14天进行BLI检查。

2.２.２.核磁共振成像

所有MRI扫描均在3T GE临床MR扫描仪（通用电气）上进行，使用定制梯度线圈和定制螺线管鼠脑射频线圈[7.,13］.小鼠用异氟醚(2%，100%氧气)麻醉，使用3D平衡稳态自由进动(bSSFP)成像序列(GE系统稳态快速成像(FIESTA))获得图像，该序列此前已为铁检测优化[14］.第0天图像的扫描参数为重复时间(TR) = 8 ms，回波时间(TE) = 4 ms，带宽(BW) = 41.7 kHz，翻转角度(FA) = 35°，平均(NEX) = 2，相位周期= 4，矩阵= 150 × 150。总扫描时间为每只鼠标15分钟。对于第14天的图像，肿瘤检测需要较长的扫描时间，成像参数为TR = 10 ms, TE = 5 ms, BW = 12.5 kHz, FA = 35°，NEX = 2，相周期= 8,matrix = 150 × 150。总扫描时间为每只鼠标35分钟。

2.2.3。BLI

BLI使用混合光学/ x射线扫描仪(IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System, PerkinElmer)进行。小鼠用异氟烷(2%，100%氧)麻醉，并接受150μL腹腔注射d -荧光素(30 mg/mL;Syd Labs, Inc.， MA, USA)，并在注射后拍摄BLI图像长达35分钟。

2.2.4。图像分析

MRI图像使用OsiriX软件(Pixmeo, SARL, Bernex, Switzerland)进行分析。第0天的图像通过人工计数信号空洞(代表整个大脑的铁标记细胞)来分析。在第14天的图像中，人工追踪脑转移瘤，并使用OsiriX体积算法重建三维肿瘤体积。在体外使用PerkinElmer软件对BLI信号进行感兴趣区域(ROI)分析。在每个井周围绘制ROI，以及平均亮度(光子/秒/厘米)^2./球面度)测量。

2.2.5.组织学

在终点，用戊巴比妥过量处死小鼠，灌注4%多聚甲醛固定。小鼠大脑被取出并在蔗糖浓度(10、20和30% w/v)的蒸馏水中冷冻至少1小时。将大脑浸泡在最佳切割温度(OCT)化合物中，在与MRI平行的切面上定向，并使用液氮进行冷冻。冻结部分(10μm)，用苏木精和伊红(H&E)染色观察肿瘤形态。

2.2.6.统计

功率分析使用G∗Power软件用于确定本研究的适当样本量。所有统计数据均使用GraphPad Prism 4进行计算。一名学生的双尾未配对T-该试验用于比较试验条件在体外实验以及动物组之间的实验。名义上的小于0.05的值被认为具有统计学意义。

3.结果

慢病毒转导后，发现4.3%的细胞为GFP阳性，对这些细胞进行分选、扩增，再进行二次分选(图)1（a）)．在第二次筛选中，我们发现86.6%的细胞是GFP阳性的。从这一群体中，我们通过FACS分离出最亮的GFP细胞(8.2%)，并将其扩大培养，获得接近100% GFP阳性的4t1br5 - flc -GFP细胞群体(图)1（b）)．在体外荧光显微镜检测GFP表达(图)1（c）)和FLuc与BLI(补充数字1（a）)．为了确定报告基因的稳定性，我们进行了在体外对4t1br5 - flc - gfp细胞进行BLI检测，并发现多代培养中荧光素酶活性无显著差异(图)1（d）)．同样，使用FACS，我们发现在10个细胞传代后，平均GFP信号强度没有显著差异(补充图)1（c）).接下来，我们通过进行碘化丙啶细胞周期阻滞试验来确定原始细胞和工程细胞之间是否存在细胞周期差异。如图所示1（f），我们观察到S期细胞数量减少，S期细胞数量增加G₀/G_1.对于工程化4T1BR5细胞，与原始细胞相比（图1（e）).我们使用MTT法评估了四天时间内，天真的4T1BR5和4T1BR5 FLuc GFP细胞之间的细胞增殖差异，发现在任何时间点，细胞生长均无显著差异（图1 (g)).我们还进行了克隆形成试验，以评估每个细胞群体形成菌落的能力差异，并发现原始和工程4T1BR5细胞之间形成的菌落数量没有显著差异（补充图1（b）)．

心内注射第0天的MRI和BLI数据如图所示2.．使用Perl普鲁士蓝染色显示4T1BR5和4T1BR5-氟- gfp细胞在心内注射前均被MPIO有效标记(>90%)(图)2（a）).铁标记细胞在MR图像中显示为分散的信号空洞，分布在小鼠大脑中（图2（b）).在第0天接受4T1BR5 FLuc GFP细胞的小鼠的大脑和身体中检测到BLI信号（图2（c）)．重要的是，在第0天，接受4T1BR5细胞(379±42个空洞)的小鼠大脑中离散信号空洞的数量显著高于接受4T1BR5- fluc - gfp细胞(98±10个空洞; ）,尽管小鼠在心脏内接受相同数量的细胞（图2（d）)．

第14天，脑转移瘤在MR图像中表现为高信号区。图形3（a）显示了来自每组代表性小鼠大脑的MR切片，白色箭头指向转移。本研究中的所有小鼠，无论是注射的细胞系（原始还是工程），在终点都有MR可检测到的转移。图3 (b)显示了带有4t1br5 - flc - gfp肿瘤的小鼠的全身BLI图像。所有接受4t1br5 - flc - gfp细胞的小鼠在大脑和身体其他部位都有BLI检测到的转移。在第14天的MR图像中，人工计数整个小鼠大脑中的肿瘤。此外，手工跟踪肿瘤边界，使用OsiriX体积算法确定三维肿瘤体积。MR图像分析显示，接受4T1BR5细胞的小鼠发生脑转移的数量(34±4个肿瘤)明显高于接受4T1BR5- flc - gfp细胞的小鼠(7±2个肿瘤; )（图3 (c))我们还发现，接受4T1BR5细胞的小鼠的总脑瘤体积显著增加（8.27%） ± 1.15 嗯^3.)与接受4T1BR5 FLuc GFP细胞的小鼠相比（1.03 ± 0.28 嗯^3.; )（图3 (d))．我们还评估了两组之间形成的肿瘤的相对数量是否与最初在大脑中生长的细胞数量有关。为此，我们评估了端点肿瘤数量与第0天空洞初始数量的比率，发现在两个小鼠队列之间没有显著差异(图)3 (e))．最后，苏木精和伊红(H&E)染色也证实了肿瘤的存在。定性地说，与4t1b3r5 -氟- gfp肿瘤的小鼠相比，接受4T1BR5细胞的小鼠有更多的脑转移(图)4.)．

4.讨论

在这项研究中，我们使用解剖和细胞MRI来描述体内在已建立的脑转移临床前模型中，三阴性乳腺癌细胞与稳定表达荧光和生物发光报告基因的细胞之间的单个癌细胞停滞和生长差异。在这里，我们报告了接受原始4T1BR5细胞的小鼠比接受工程化4T1BR5 FLuc GFP细胞的小鼠有显著更多的脑转移和显著更高的总脑肿瘤负担。此外，通过使用基于铁的细胞MRI，我们能够确定，与接受我们的工程细胞系的小鼠相比，接受原始细胞系的小鼠在心内注射当天大脑中也有明显更多的离散信号空隙（代表铁标记细胞）。这突出表明，工程细胞和原始细胞之间转移性肿瘤负担的差异可能不仅仅是由于基因表达的差异体内其他人建议的工程细胞生长率[9–12但也可能在转移过程的早期通过改变器官播种效率而出现。

转移级联的一个重要步骤是循环肿瘤细胞的初始停止。我们的研究结果指出，工程化癌细胞的抑制减少可能是端点肿瘤数量和负担差异的解释。在目前的研究中，我们发现4T1BR5细胞系的工程化导致了细胞数量的增加G₀/G_1.在体外.细胞阻滞的改变可能是多种可能性的结果，包括选择阻滞能力降低的细胞子集，使用整合到基因组中的慢病毒载体导致对归巢和阻滞重要的基因表达改变，或对特定转基因（如GFP或荧光素酶）的早期免疫反应Baklaushev等人建议对荧光素酶的早期免疫反应可能限制转移细胞在血管中作为单个细胞迁移时的扩散。因为免疫能力的小鼠模型和报告基因成像同样是研究癌症进展的无价工具，科学家应该开始考虑新的方法。不良反应（例如，使用或开发免疫原性较低的报告者）.如果生长差异主要归因于细胞停滞，而这是由荧光素酶或GFP表达引起的，那么缓解这种差异的一种潜在方法是使用可诱导启动子，使报告者在细胞正常停滞后才打开。

另外，在本研究中，我们的初始转导效率很低，需要考虑潜在的克隆优势。先前的研究表明，实体肿瘤块的大部分来自单个细胞，而不是以相似的速率增殖产生异质肿瘤的各种细胞[15]。通过在工程过程中选择相对较小的细胞子集，所产生的细胞系可能比初始细胞系的脑营养性或侵袭性/转移性更低，从而显著降低这些动物的脑肿瘤负担。此外，我们幼稚的4T1BR5细胞系确实“幼稚”，因此，我们无法像我们的工程细胞系那样，根据报告基因表达模拟排序和扩展它们。那些使用工程细胞系进行报告基因成像的人应该提供一个完整的解释，说明细胞是如何被工程化来表达这些报告基因的。选择过程中使用的载体，以及细胞的纯度，都将提供所产生的细胞系在多大程度上代表初始群体的信息。

先前的研究表明，报告基因成像所必需的基因操作类型或培养条件的变化有可能改变细胞的行为在体外和体内[12］.许多研究小组也表明，工程细胞可以有与naïve细胞相似的生长速度在体外但报告显示增长速度明显放缓体内与幼稚细胞相比[9,12,16，这些差异可能与特定报道者的表达有关。在Tiffen等人的一项研究中，表达GFP- p2a -luc(荧光素酶)的B16-F10肿瘤的生长速度明显慢于只表达GFP的肿瘤。类似地，以前的工作已经显示了工程细胞中报告表达的数量和对生长的影响程度之间的联系。Brutkiewicz等人发现，高水平的荧光素酶表达可严重抑制体内肿瘤生长，而低水平的表达显示类似于naïve细胞的肿瘤生长[10］.然而，争夺较低水平的报告表达将限制癌细胞的检测能力体内这对于评估下游器官中少量细胞阻滞或微转移发育的研究具有重要价值。相比之下，其他组没有发现显著差异体内荧光素酶工程后的肿瘤生长[11,12]先前的研究还表明，与注射幼稚细胞的动物相比，表达荧光素酶的工程细胞可以提高动物的存活率，这表明荧光素酶的表达可能会降低细胞的侵袭性/转移性[9］.这些研究中的许多都将差异归因于荧光素酶本身的表达，而忽略了工程过程中可能影响的其他变量体内生长，例如从初始群体中设计了多少个细胞，以避免选择一个取向改变的亚群体，或对报告基因整合的潜在影响，这可能会影响基因表达或其他混杂变量。

5.结论

总之，本研究描述了应用细胞和分子成像工具来表征体内在已建立的实验性乳腺癌脑转移小鼠模型中，天然细胞系和工程细胞系之间的生长差异。通过使用细胞MRI，我们首次证明，细胞工程可以对大脑中的细胞阻滞产生显著影响。这表明用报告基因工程癌细胞可能会改变它们对特定器官的倾向性，在为癌细胞群和可能的非癌细胞群的报告基因成像设计细胞时，应小心。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项研究得到了加拿大癌症协会(P.J. Foster)、加拿大自然科学和工程研究委员会(J.A. Ronald)和加拿大乳腺癌协会(K.M. Parkins)的支持。

补充材料

补充图1.细胞系的体外表征：进行生物发光成像以评估萤火虫荧光素酶基因在工程化4T1BR5细胞中的功能（a）。进行克隆形成试验以确定每个细胞系形成菌落的能力差异（b）流式细胞术用于确定多次传代的平均GFP荧光强度的差异（c）。(补充材料)

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