TRIM29逆转铂电阻的P53突变结肠癌细胞

文摘

背景。铂是首选晚期结肠癌患者的化疗方法。然而,许多病人的阻力导致治疗失败。在我们的实验中,我们的目标是阐明TRIM29蛋白质之间的关联,P53基因突变,抗结肠癌细胞铂。方法。HCT116 HT-29细胞培养和转染质粒pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag。利用免疫印迹和实时存在检查被蛋白质和mRNA的表达TRIM29和其他相关标记,分别。MTT分析是用来确定细胞生长速度和生成抑制曲线。连续文化低浓度铂进行构造oxaliplatin-resistant细胞系。coimmunoprecipitation方法和免疫荧光检测是用来检查TRIM29之间的交互和突变型P53蛋白在HT29细胞。结果。我们成功转染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag HCT116和HT29细胞,利用在整个实验。TRIM29 P53突变的敏感性明显增加结肠癌细胞HT29铂。P53突变的oxaliplatin-resistant模型结肠癌细胞HT29成功构建。TRIM29身体束缚与突变型P53和保留它从细胞核,细胞质中抑制其凋亡等下游基因的转录功能。此外,TRIM29成功逆转的阻力HT29-OX铂耐药细胞模型。结论。在突变型P53结肠癌细胞HT29 TRIM29大大增加的敏感性HT29铂和铂电阻。底层机制是TRIM29可能增加的敏感性HT29铂,阻断突变型P53的转录功能,而抑制其凋亡等下游基因的转录功能。

1。介绍

近年来,结直肠癌患者的人口逐渐增加(1]。大多数病人患有严重的症状,如肠梗阻和出血的诊断,导致远程转移和肿瘤晚期阶段(阶段III和IV) [2]。系统性化疗之前或之后对不可切除的病人推荐手术减少肿瘤复发和转移,以及提高五年生存率(2,3]。铂是高危复发患者的首选化疗方法和淋巴结转移4,5]。它作用于DNA通过生成水化衍生品形成链内的和跨链交叉连接(6]。DNA轭合物的形成可以启动细胞的DNA损伤反应,导致细胞凋亡来实现其抗肿瘤效应(7,8]。

由于化疗药物在肿瘤细胞耐药性,许多肿瘤患者不可避免的几种有效化疗后复发和转移(9,10]。这样的化疗抵抗的地方大障碍结肠癌患者恢复或生存。在结肠癌患者中,有超过60%的人P53突变(11- - - - - -13]。人们普遍认为P53突变表明贫穷的临床分期、预后和抗结肠癌14- - - - - -16]。P53-deficient细胞能损伤dna药物高度敏感,而P53突变细胞是高度耐研究者用(17]。临床研究还表明P53突变会增加结直肠癌患者化疗的电阻(15,18,19]。P53基因突变是结肠癌化疗耐药性的重要因素之一,这促使我们去探索更有效的方法来改善治疗结果。

TRIM29基因主要存在于细胞的细胞质和各种细胞骨架结合蛋白。发现TRIM29可以绑定到P53,可能负面的核转录调节P53和阻止其功能20.]。此外,TRIM29提高体内肿瘤的生长和转移,是高度表达,在许多肿瘤,并可能促进肿瘤生长,如结肠癌和前列腺癌(21- - - - - -23]。它通常被认为是一个促进因素。然而,TRIM29表达下调是在其他肿瘤如乳腺癌和前列腺癌23- - - - - -26]。作为肿瘤生长TRIM29作为一把双刃剑,它仍然发挥重要作用在肿瘤的发生和发展。

先前的研究人员证实TRIM29显示,P53突变Saos-2细胞(肿瘤抑制效果27)和bt - 549细胞(27)和肿瘤促进作用在P53野生型结肠癌细胞系(RKO22]和HEK93 [21]。TRIM29与野生型P53和P53突变有关。我们推测,其双重作用可能与P53肿瘤细胞的状态。因此,我们的目标是阐明TRIM29蛋白质之间的关联,P53基因突变,抗结肠癌细胞铂的实验。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

HCT116 HT-29细胞(Cellbank、上海生命科学院、中国科学院)在1640年培养介质含有10%灭活胎牛血清(热费希尔科学、中国上海)在孵化器37°C,湿度和5%股份₂。HCT116细胞对数生长期被播种在96 -文化板块2×10³细胞每200年μL体积。坚持24 h后,质粒pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag (HG-HO101913 HonorGene)和pIRES2-ZsGreen1 (# 632478, Clontech)转染成HCT116细胞。HT29细胞被播种在96 -文化板块2×10³细胞每200年μL体积。坚持24 h后,质粒pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag和pIRES2-ZsGreen1使转染入HT29细胞。

2.2。细胞转染

pCDNA3.1-TRIM29-flag和pCMV-HA-p53-R273H从HonorGene购买(长沙,中国)。根据不同的治疗方法,实验分为(1)HT29细胞组:HT29细胞自然状态;(2)HT29-NC组:与pIRES2-ZsGreen1 HT29细胞转染质粒;(3)HT29-TRIM29组:ZsGreen1-TRIM29质粒转染pIRES2——HT29细胞;(4)HCT116组:HCT116细胞自然状态;(5)HCT116-NC组:与pIRES2-ZsGreen1 HCT116细胞转染质粒;(6)HCT116-TRIM29组:与TRIM29质粒转染pIRES2-ZsGreen1——HIM116细胞。(HT29细胞或HCT116)与质粒转染pIRES2-ZsGreen1 (HT29-NC或HCT116-NC)或pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag (HT29-TRIM29或HCT116-TRIM29)根据以上组。

2.3。免疫印迹

HT29细胞细胞溶解和离心机。蛋白质含量测定采用BCA工具包(Beyotime生物技术研究所、江苏、中国),和浓度计算。进行了sds - page电泳和蛋白质转移到硝酸纤维素。膜然后沾2%朱红色染料溶液。洗后,膜是被屏蔽的。然后,主要抗体TRIM29 (ab108627, 1: 5000年,Abcam)凋亡(ab170904, 1: 2000年,Abcam) P53 (60283 - 2 - ig 1: 5000年,Proteintech), HA (ab1424, 1: 7000年,Abcam),国旗(ab205606, 1: 10000年,Abcam),和β肌动蛋白(66009 - 1 -搞笑,1:5000年,Proteintech)补充说,培养时间为2 - 4小时在室温下。洗后,辣根peroxidase-labeled二级抗体HRP-goat anti-mouse免疫球蛋白(SA00001-1, 1: 5000年,Proteintech)或HRP-goat anti-rabbit免疫球蛋白(SA00001-2, 1: 6000年,Proteintech)补充道,在室温下的孵化时间1小时。发射极耦合逻辑化学发光是用于可视化。

2.4。实时定量逆转录聚合酶链反应(实时存在)

试剂盒是用来从目标细胞中提取总RNA。使用互补dna作为模板,目标和内部参考GAPDH基因片段被放大,分别。实时PCR用于量化目标基因的mRNA水平在每个组的细胞。实验使用的引物如下:P53-f: 5′-CCACCATCCACTACAACTACAT-3′P53-r: 5′-CCCAGGACAGGCACAAAC-3′MDR1-f: 5′-CAACGGAAGCCAGAACAT-3′MDR1-r: 5′-AATCAGCCTCACCACAGA-3′TRIM29-f: 5′-GCATAGCATCAGCGACTC-3′TRIM29-r: 5′-GTTCCTCTCAATGAAGTTACG-3′GAPDH-f: 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′GAPDH-r: 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′

2.5。MTT实验步骤

20μl MTT每口井的解决方案(5毫克/毫升)被添加到从每组细胞,与4 h的潜伏期37°C, 5%的股份有限公司₂孵化器。文化的上层清液小心地避免吸气吸气紫色水晶。150年μl DMSO溶液添加到每个好,摇下10分钟完全溶解晶体。490纳米的光吸收是利用测量结果。细胞生长曲线的绘制时间为横坐标,吸光度为纵坐标。

2.6。抑制曲线的测定

孵化后37°C公司5%₂孵化器48小时,铂是添加在序列的最终浓度为0μmol / L, 25岁μmol / L, 50μmol / L, 100年μmol / L, 200年μmol / L和400μmol / L。培养48小时后,MTT用于检测OD值。每组的抑制率等于1-OD价值被铂(25μmol / L, 50μmol / L, 100年μmol / L, 200年μmol / L和400μmol / L) /铂OD值(0μmol / L)。与铂浓度抑制曲线是横坐标和纵坐标上的抑制率。

2.7。Coimmunoprecipitation方法

coimmunoprecipitation方法被用来研究TRIM29之间的互动和突变型P53蛋白在HT29细胞。简单地说,800年μl IP裂解的解决方案是首先添加到细胞颗粒溶解30分钟。这是离心机在12000 rpm 15分钟4°C。离心机的上层清液被转移到一个新的1.5毫升离心管,加上2μg正常老鼠lgG (B900620 Proteintech), 2μg正常兔lgG (B900610 Proteintech) mouse-derived P53抗体,rabbit-derived TRIM29抗体。混合物是孵化一夜之间在4°C。20μl蛋白A / G琼脂糖珠与200年被添加和混合μl IP溶解产物。细胞溶解产物添加和孵化抗体在一夜之间使用蛋白质A / G琼脂糖珠。coimmunoprecipitation后,混合物被离心机在3000转3分钟在4°C。上层清液小心移除,并放置在一个新的1.5毫升离心管。琼脂糖珠洗了400μl IP溶解溶液4次。收集沉淀。浮在表面的保留。

2.8。免疫荧光检测

免疫荧光检测进行了探讨TRIM29之间的交互和突变型P53蛋白在HT29细胞转染pCDNA3.1-TRIM29-flag或pCMV-HA-p53-R273H。细胞被分成3组:(1)数控组:HT-29细胞cotransfected pCDNA3.1(+)和pCMV-HA质粒;(2)p53组:HT-29细胞cotransfected pCDNA3.1(+)和pCMV-HA-p53-R273H质粒;和(3)53 + TRIM29组:HT-29细胞cotransfected pCDNA3.1-TRIM29-flag和pCMV-HA-p53-R273H质粒。转染48小时后,免疫荧光检测。简而言之,包含10%的细胞在DMEM培养基培养灭活胎牛血清含37%饱和湿度和5%孵化器有限公司₂。0.4%与4%多聚甲醛固定后,特里同100年通过膜渗透15分钟。主要的抗体(兔子anti-HA抗体,鼠标anti-Flag抗体)一夜之间添加和孵化在4度。第三天,盐水洗两次。二次抗体用FITC标记和TRITC (1: 50, TRITC-anti-mouse;FITC-anti-rabbit KPL)补充道,在室温下孵化2 h。利用激光共焦显微镜拍摄照片。

2.9。统计方法

利用SPSS 19.0进行独立样本t以及。使用SPSS19 IC50的计算进行了回归分析。耐药细胞的耐药指数= IC50 / IC50亲代细胞。数据在多个组比较采用单向方差分析(方差分析)其次是图基的事后测试。数据偏斜分布在多个团体是由非参数测试的克鲁斯卡尔-沃利斯H测试。小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-Flag成功转染

图1证明我们成功转染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag HCT116和HT29细胞。图1(一)显示的mRNA表达TRIM29 HCT116、HT29细胞pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag质粒的转染后显著增加。数据1 (b)和1 (c)说明TRIM29 HCT116和HT29细胞蛋白表达增加与pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag质粒转染后。上述结果表明,我们成功转染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag HCT116和HT29细胞,可用于以下实验。

3.2。TRIM29 P53突变的敏感性明显增加结肠癌细胞HT29铂

数据2(一个)和2 (b)显示pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag质粒转染后的细胞生长曲线。从第四天HCT116增长更快。第七天,转染组细胞的数量大约是1.4倍数量的细胞在父组。数据2 (c)和2 (d)显示不同浓度的抑制曲线HT29和HCT116铂治疗组。很明显,TRIM29升高的抑制率HT29铂,虽然在HCT116细胞的影响微乎其微。数据2 (e)和2 (f)展示了IC50变化在不同的组。pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag质粒转染后,铂的IC50 HCT116增加从34.89μ47.26 mol / Lμmol / L。耐药指数为1.35。的敏感性HCT116铂是略有减少。对HT29铂IC50从11.54下降μ0.98 mol / Lμmol / L,耐药指数为0.08。的敏感性HT29铂明显改善。总之,TRIM29 P53突变的敏感性明显增加结肠癌细胞HT29铂。

3.3。P53突变的Oxaliplatin-Resistant模型结肠癌细胞HT29成功构建

接下来,我们成功构建P53突变结肠癌细胞HT29-oxaliplatin-resistant模型。图3(一个)显示了抑制HT29曲线,HT29-4μmol / L铂,HT29-8μmol / L铂,HT29-12μmol / L铂。浓度较高的铂,HT29细胞显示更好的抑制效果。图3 (b)说明了父母的IC50和三个耐药细胞系。随着耐药的浓度的增加,耐药细胞的IC50相应增加。的IC50父母和三个耐药细胞株分别为11.5±0.1μ摩尔/升,74.4±1.3μ摩尔/升,136.5±5.8μmol / L和188.9±6.2μ分别mol / L。数据3 (c)- - - - - -3 (e)证明在三耐药细胞凋亡的表达与耐药浓度的增加逐渐增加。HT29-OX-12的mRNA水平μmol / L增加到4.3倍的父(图3 (e)),蛋白质含量增加到父(数字的2倍3 (c)和3 (d))。这些结果显示我们的成功建设oxaliplatin-resistant P53突变大肠癌HT29细胞模型。

3.4。TRIM29身体结合突变型P53防止突变型P53将细胞质细胞核和转录

发现TRIM29可以绑定到野生型p53和不直接调节p53的转录28]。TRIM29是一种细胞质蛋白,使p53蛋白核出口,从而抑制p53的功能调节下游靶基因的转录20.]。如补充图所示1,TRIM29与氨基酸结合320 - 393年的p53 tetramerization域(春节),和p53与氨基酸结合TRIM29 1 - 200。我们检测到P53的表达变化和TRIM29 HT29与不同浓度的铂电阻后pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag质粒的转染。数据4(一)- - - - - -4 (c)显示相对mRNA水平、TRIM29和P53蛋白表达。与电阻的增加不同浓度的铂,TRIM29的表达逐渐减少和P53的表达逐渐增加。HT29-OX-12后μ与pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag mol / L细胞转染质粒,P53和凋亡表达的变化被发现(数字4 (d)和4 (e))。TRIM29质粒,转染后TRIM29的表达增加,没有明显变化的耐药菌株P53的表达,而表达凋亡降低了。上述结果表明,TRIM29可能防止下游突变型p53基因转录。

然后,我们的目标是探索的内在机制TRIM29 HT29逆转耐药性的铂。图4 (f)显示免疫沉淀反应的方法来检测TRIM29之间的交互和突变型P53蛋白在HT29细胞。更重要的是,我们发现国旗标签和HA标记表达式pCDNA3.1-TRIM29-flag和pCMV-HA-p53-R273H质粒转染HCT116和HT29细胞免疫印迹。见补充数据2和3结果表明,pCDNA3.1-TRIM29-flag和pCMV-HA-p53-R273H成功转染。与pCDNA3.1-TRIM29-flag质粒转染后,国旗在HCT116和HT29细胞的蛋白表达增加。与pCMV-HA-p53-R273H质粒转染后,HA HCT116、HT29细胞的蛋白表达也增加。然后,图4 (g)证明了免疫荧光检测TRIM29之间的交互和突变型P53蛋白在HT29细胞。在P53突变结肠癌细胞HT29 TRIM29和突变型P53蛋白互相结合。至少一部分p53突变从胞浆进入细胞核,从而消除p53突变转录功能和耐药性的变化。

3.5。TRIM29成功逆转的阻力HT29-OX铂耐药细胞模型

图5(一个)显示了抑制曲线在HT29-OX-12铂μmol / L与pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag质粒转染前后细胞MTT法。图5 (b)演示的变化在HT29-OX-12 IC50μmol / L细胞转染前后pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag质粒。与TRIM29转染后,耐药菌株HT29-12μmol / L铂大大提高铂的敏感性,而IC50降低了从188.9±6.2μ22.6±6.7 mol / Lμmol / L。从上面的结果,我们可以得出这样的结论:TRIM29成功逆转的阻力HT29-OX铂耐药细胞模型。

4所示。讨论

减少蛋白质家族包括三个特征锌结合域,包括一个环形结构,1型变数寄存器,和2型变数寄存器结构,其次是卷曲螺旋区域(29日- - - - - -31日]。虽然减少蛋白质的生物功能领域尚未完全阐明,削减一些蛋白质扮演重要角色在病毒复制,信号,开发,和人类疾病,特别是肿瘤(32]。然而,没有证据表明TRIM29可以直接抑制或激活转录。先前的研究发现,TRIM29与P53[高度相关20.]。在我们的研究中,我们发现TRIM29细胞质蛋白质可以绑定到p53突变,这有助于防止突变型p53将细胞质细胞核。这种物理绑定可以阻止突变型p53在核转录的作用,减少凋亡等下游基因的表达,从而导致铂电阻。我们的研究结果与以前的研究一致TRIM29之间的交互和野生型p53 p53-related铂电阻,并提供新的见解。

在这项研究中,我们选择HT29和HCT116结肠癌细胞系。HT29和HCT116结肠癌细胞株是两种类型的细胞具有不同程度的同化。HT29中度分化,可以诱导分化成肠道上皮细胞,而HCT116是一个高度侵袭性结肠癌细胞系处于未分化状态(33- - - - - -35]。HT29细胞是人类肠道上皮细胞产生的免疫球蛋白分泌组件(IgA)和癌胚抗原(CEA)。HT29细胞用于tumourigenicity研究[36,37]。HCT116细胞已被广泛应用于恶性肿瘤细胞的生物学特性的研究,抗癌药物的机理,以及抗癌药物的筛选。最近的研究表明,大多数HCT116细胞肿瘤干细胞的特点,可以作为理想的肿瘤干细胞的研究对象38,39]。

TRIM29促进聚合在β连环蛋白细胞通过β连环蛋白/ TCF途径[21]。TRIM29高度表达,在许多肿瘤和促进肿瘤生长21- - - - - -23]。然而,TRIM29是抑制某些肿瘤的表达24,40- - - - - -42]。例如,TRIM29有时过表达,有时表达下调特别是前列腺癌。在乳腺癌中,TRIM29也展品肿瘤抑制效果(25],TRIM29表达式的抑制与某些肿瘤恶性表型(27]。在我们的实验中,我们发现,这种双重功能的TRIM29可能与P53肿瘤细胞的状态。在野生型P53肿瘤,TRIM29似乎促进癌症发展。在p53突变的肿瘤类型,TRIM29显示癌症抑制效果。我们的研究结果表明,TRIM29 HT29略表示,但不是在HCT116蛋白质水平。pIRES2-ZsGreen1-TRIM29-flag质粒的转染后,两组的细胞是高度mRNA和蛋白表达水平,这表明成功转染质粒。

在P53突变结肠癌细胞系HT29 TRIM29抑制HT29的生长,显著增加的敏感性HT29铂。TRIM29可能结合不仅野生型P53突变P53蛋白。突变型P53肿瘤药物抗性密切相关(43),特别是在铂药物的耐化学性。突变型P53目前参与几乎所有已知的耐药机制,如促进药物流出(44),DNA修复的损失函数(43),抗细胞凋亡(45,46)、生存信号激活和微环境电阻(47- - - - - -49]。从我们的实验结果,HT29结肠癌细胞的敏感性铂TRIM29转染后大大增加,这表明TRIM29可能增加的敏感性HT29铂通过阻断突变型P53的功能。然而,TRIM29转染后,防止野生型P53的功能并没有显著增加的阻力HCT116铂,这表明铂通过P53不仅导致肿瘤细胞凋亡细胞凋亡通路(50- - - - - -52]。

野生型p53是一个著名的肿瘤抑制基因和转录因子,促进一系列肿瘤抑制基因的表达。p53基因的突变会导致其肿瘤抑制功能的丧失,甚至获得促进癌症的增益函数的函数。基于我们的实验中,突变型p53施加其功能与依赖的规定其凋亡等下游基因的表达。p53的预测状态和相关分子的表达可能有助于为病人选择更合适的化疗。我们的研究可以使精密医学和个性化的治疗结肠癌患者。在未来的工作中,我们将继续研究p53突变的潜在工作机制和其主要信号通路。

5。结论

在结肠癌,TRIM29显示肿瘤生长的促进作用细胞表达野生型P53 (HCT116)和肿瘤抑制作用的细胞突变型P53表达(HT29)。的双重效应TRIM29 p53状态有关。TRIM29可以绑定两个野生型p53突变型p53,防止他们的核转录功能。在突变型p53结肠癌细胞,TRIM29防止突变型p53的转录功能,如下游基因凋亡,逆转药物抗性的突变型p53结肠癌。

数据可用性

所有的数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

伦理批准

人类和动物实验是没有参与这项研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Guoqiong Lei Sushun刘,杨欣,曹国伟他设计的研究中,进行了研究,分析数据和写论文。

确认

作者要感谢实验室动物第二湘雅医院,中南大学,他们的技术援助。这项研究是由湖南省自然科学基金(没有。2017 jj3448)。

补充材料

补充图1:TRIM29和p53的结合位点。补充图2:与pCDNA3.1-TRIM29-flag质粒转染后,免疫印迹检测国旗HCT116、HT29细胞的蛋白表达。 。补充图3:与pCMV-HA-p53-R273H质粒转染后,免疫印迹检测的HA蛋白表达HCT116和HT29细胞。 。(补充材料)

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