文摘
背景。心脏肥厚是心血管系统最初的障碍之一,可以诱发心力衰竭。氧化应激是一个心脏肥大的重要病理生理机制。汉黄芩素(疾病),一个重要的类黄酮素的根中提取出来的黄芩具有抗氧化特性的生化特性。方法。一个在体外通过刺激H9C2模型建立了心脏肥大细胞和新生大鼠心肌细胞(医疗保险)和血管紧张素ⅱ(AngII)。心肌肥厚和氧化应激相关指标检测。一个在活的有机体内模型的心脏肥大引起的横向主缢痕C57BL / 6小鼠(TAC)。由胸超声心动图心脏功能监测,肥大指数测量。然后老鼠牺牲组织学分析,信使rna和蛋白质检测。进一步探索核转录因子的作用——(erythroid-derived 2 -) 2 (Nrf-2)在调节病菌的抗氧化作用在心脏肥大,核进行了分析。结果。我们的研究结果表明,外国佬显著改善AngII-induced心肌细胞肥大H9C2细胞通过抑制氧化应激和医疗保险。此外,疾病治疗防止氧化应激和改善心脏肥大的老鼠接受了TAC。使用gene-specific siRNANrf-2这些抗氧化的影响,我们发现的病菌通过Nrf-2归纳。结论。我们的研究结果提供进一步证据的潜在使用外国佬作为抗氧化剂用于治疗心脏肥大,而且Nrf-2可能作为治疗目标治疗心脏肥大。
1。介绍
心脏肥大是心肌的异常增大和心血管系统的严重障碍。它是一种适应性反应的心几乎所有形式的心脏疾病包括高血压、机械负载、心肌梗死、心律失常(1,2]。许多先前的研究表明血管紧张素ⅱ(AngII)特异表达,肾素-血管紧张素系统的主要分子,在心脏肥大的发展起着重要的作用[3,4]。然而,更好地了解心脏肥大和发病机理的基本治疗方法的研究是迫切需要的。
AngII调节中起着重要作用的血管功能和结构已经建立,导致心血管疾病的发病机制的诱导氧化应激(5,6]。通过刺激其1型受体,AngII显示与胞质蛋白的过度参与NAD (P) H氧化酶的活化,导致心脏功能障碍和细胞肥大(7]。在我们的研究中,一个在体外模型的心脏肥大是由刺激大鼠心肌细胞(H9C2 AngII (1)μ米)。氧化应激在心血管疾病的关键作用表明具有抗氧化特性的生化分子可能提高治疗效果。
汉黄芩素(5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone(疾病))是一个重要的类黄酮素的根中提取出来的黄芩(8]。它有一个广泛的药理作用,包括抗氧化剂(9,抗炎10,抗肿瘤11[],和心血管保护12,13]。然而,是否和外国佬减弱心脏肥大尚不清楚。许多疾病的保护作用在很大程度上依赖于它的抗氧化性(14- - - - - -16]。因此,我们推测,外国佬的antioxidant-like效果防止心脏肥大可能是一个关键。
核因子- (erythroid-derived 2 -) 2 (Nrf-2)是一种抗氧化系统的调节器和移植的表达血红素oxygenase-1 (HO-1)和NADPH奎宁oxidoreductase-1 (NQO-1)减少氧化应激17]。Nrf-2被认为是一个重要的潜在目标治疗某些心血管疾病如心肌肥大(18,19]。在这项研究中,我们旨在确定疾病预防心脏肥大和探索底层机制。实验结果使用AngII-induced肥厚性心肌细胞证实,病菌通过Nrf-2-mediated抗氧化剂抑制氧化应激反应,改善心肌细胞肥大。我们体内数据显示,小鼠主动脉横缢痕——(TAC)诱导肥大心脏大小,增加心脏重量与体重的比例,和氧化应激水平,抑制病菌。此外,使用特定的核Nrf-2,我们发现,通过Nrf-2-mediated疾病预防肥厚性心肌细胞抗氧化反应。
2。材料和方法
2.1。材料
从Sigma-Aldrich AngII购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。外国佬是购自南京春天和秋天生物工程(中国南京)和溶解在二甲亚砜对体外实验。Anti-myosin重型chain-beta (MyHC -β)和anti-Nrf-2获得Abcam(美国Cambridge, MA)。Anti-Keap-1、anti-Tubulin anti-GAPDH,二级抗体购自细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。Dihydroethidium(她)染色,丙二醛(MDA)的装备,和超氧化物歧化酶(SOD)设备买来Beyotime生物技术研究所(海门,中国)。若丹明phalloidin获得SolarBio(中国,北京)。实时rt - pcr试剂从豆类购买公司(中国大连)。所有细胞培养试剂购自Gibco(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。
2.2。动物实验
从嘉兴大学获得C57BL / 6小鼠动物中心。动物们被安置在在18到22岁的°C的房间温度与相对湿度40 - 60%,与正常照明条件和用一个标准的啮齿动物的饮食。所有动物保健和实验程序依法进行实验动物保健和使用指南(美国国立卫生研究院)。动物保健和实验性的协议通过动物保健和使用委员会嘉兴大学第二附属医院(嘉兴,中国;没有批准。jxey - 2020 jx061)。小鼠随机分为四组( )如下:骗局,病菌、TAC和 。TAC操作程序进行如前所述[20.,21]。sham-operated组接受相同的过程没有主动脉结扎。老鼠接受外国佬(单胃内的疾病管理(10毫克/公斤/天))(22,23]。TAC八周后,小鼠的心脏功能评估超声心动图,Vevo 2100高分辨率成像系统(VisualSonics Inc .)低于1%异氟烷麻醉。超声心动图测量后,老鼠被牺牲的腹腔内注射过量戊巴比妥钠(200毫克/公斤)和心脏进行进一步评估。
2.3。细胞培养和治疗
鼠心肌细胞(H9C2)来自上海生物科学研究所、中国科学院和培养high-glucose heat-inactivated DMEM和10%胎牛血清(的边后卫)补充100 U /毫升青霉素和100 g / mL链霉素,37°C在空中95% / 5%有限公司2孵化器。细胞转染2000使用Lipofectamine siRNA试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。Gene-specific核(5 - - - - - -GGGUAAGUCGAGAAGUGUUTT-3 )为Nrf-2和消极的控制核从GenePharma购买(上海,中国)。RNA击倒的转染效率估计48 h posttransfection西方墨点法。
新生大鼠心肌细胞(3)隔绝Sprague-Dawley (SD)老鼠如前所述24]。短暂,老鼠的心脏被切成碎片,用冰冷的汉克斯平衡盐溶液(hbs)三次,和孵化0.125% trypsin-EDTA 15分钟34°C总共五次。然后,医疗保险是通过微分附件离心机技术那么播种密度six-well文化板块 细胞每口井。孤立的医疗保险是生长在DMEM含有15%的边后卫补充与100 U / mL青霉素和链霉素100克/毫升,在95%的空气/ 37°C公司5%2孵化器。
2.4。细胞生存能力分析
细胞生存能力是由CCK8细胞毒性试验。简单,细胞被播种在5000细胞/ 96孔板和病菌在不同处理浓度(1、2.5、5、10、20、40、60岁和80年μ米)48 h。细胞被孵化CCK8 (10μ信用证)为1 - 4 h 37°C,然后spectrophotometrically量化在450 - 490海里。细胞生存能力计算如下:细胞 。
2.5。Phalloidin f -肌动蛋白纤维的染色
简单,细胞和4%多聚甲醛固定,洋溢着Triton x - 100 0.1%,沾FITC-labeled phalloidin 30分钟的集中100海里。细胞核染色在赫斯特解决方案1的浓度μ克/毫升10分钟。免疫荧光被使用荧光显微镜(Axio成像仪,德国)。细胞表面积决定后细胞染色和显微镜的成像。表面积是由成像量化完整的30单个细胞/边界条件使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)。
2.6。细胞内活性氧测量
Dihydroethidium(她)染色法测定细胞内超氧化物阴离子的水平。细胞暴露于AngII有或没有外国佬预处理。培养细胞孵化了10μ她30分钟。细胞被荧光显微镜观察。
2.7。测定丙二醛和超氧化物歧化酶的水平
SOD和MDA的活动确定使用商用工具根据制造商的指示(Beyotime生物技术研究所、海门、中国)。总之,细胞被播种到6-well盘子和如上所述。然后中被丢弃,收集细胞成管状,提取试剂添加比例1毫升试剂/ 细胞。MDA的检测活动,加入其他试剂,混合物被储存在100°C 15分钟和离心机10000克后10分钟冷却。检测了450海里。MDA的活动表示为nmol /毫克的蛋白质。检测SOD活性,混合物被放置在一个在37°C水浴30分钟测量吸光度值在450海里。SOD的活性被表示为U /毫升。
2.8。实时定量聚合酶链反应
从心脏组织和H9C2细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的指示。根据指令实时rt - PCR进行PCR工具包(豆类)。Mastercycler(埃普多夫,汉堡,德国)是用于qPCR分析。引物获得热费希尔科学(引物序列表中列出1)。信使rna是规范化目标β肌动蛋白。
2.9。免疫印迹分析
心脏组织和H9C2细胞均质里帕裂解缓冲(Beyotime生物技术研究所、海门、中国)30分钟在冰上。蛋白质浓度计算使用bicinchoninic酸(BCA)方法。蛋白质(30μg)是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。每个膜被1.5 h和3%牛血清白蛋白(BSA)在室温和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。洗后,膜被孵化HRP-conjugated二级抗体和可视化使用增强化学发光(Bio-Rad)。蛋白量进行了分析使用ImageJ软件(版本1.38 e)和归一化各自的控制。
2.10。统计分析
实验随机和盲法。数据了 ,和个人数据点在数据绘制。组织是由未配对的学生之间的统计学意义 - - - - - -测试或单向方差分析在GraphPad Pro5.0 (GraphPad、圣地亚哥、钙、美国)。 被认为是显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。外国佬阻止AngII-Induced心肌细胞肥大
我们首先确定疾病治疗后H9C2细胞的可行性。H9C2细胞治疗与不同剂量的病菌(1 - 80μ米)48 h,和细胞生存能力评估使用CCK8可行性分析。疾病治疗减少细胞生存能力只有在40或80μM(图1(一))。基于这些结果,我们选择20μM外国佬来确定对AngII-induced细胞损伤的影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
AngII被用来建立体外模型心脏肥大的研究(25,26]。如数据所示1 (b)和1 (c)和补充图1,AngII MyHC肥厚性标记的表达——增加引起的β在H9C2细胞和医疗保险。然而,疾病可能会减弱MyHC——的表达β,这表明它抑制心肌细胞肥大。此外,外国佬减少AngII-induced细胞大小增加,证实了罗丹明phalloidin染色(数字1 (d)和1 (e)和补充图1 b和1 d)。
3.2。病菌抑制氧化应激和II-Induced心肌细胞
大量研究已经证实氧化应激与多种心血管并发症的发病,尤其是心脏肥大(27- - - - - -29日]。因此,我们的下一个目标是确定疾病提供预防AngII-induced H9C2细胞ROS生成和医疗保险。我们检查了ROS水平生产细胞暴露于AngII有或没有外国佬。细胞进行预处理与病菌接触AngII前2 h。治疗后,我们使用三个化验分析H9C2细胞氧化应激和医疗保险。首先,我们染色的细胞治疗她(数字2(一个)和2 (b)和补充图1 c和1 e)。第二,我们研究了AngII-induced改变H9C2疾病治疗后MDA水平的细胞(图2 (c))和医疗保险(补充图1 f)。第三,我们进一步衡量疾病的影响的表达水平的总SOD(图2 (d)和补充图1克)。所有三个化验建议AngII显著增加H9C2细胞的氧化应激水平和医疗保险。然而,疾病的治疗减毒AngII-induced H9C2细胞ROS生成和氧化应激和医疗保险。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
接下来,我们研究了抗氧化酶包括Nrf-2 HO-1, NQO-1。Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap-1),负Nrf-2调节器,Nrf-2-mediated抗氧化反应中起着重要的作用。我们发现相比AngII集团 组织促进了蛋白质和mRNA水平Nrf-2(数字2 (e),2(我),2 (j))和显著降低Keap-1(数字2 (h),2(我),2 (k))。激活Nrf-2, mRNA水平Ho-1(图2 (f)),Nqo-1(图2 (g))也被调节与外国佬AngII-challenged细胞进行预处理。
3.3。外国佬的心血管效应激活Nrf-2-Mediated抗氧化反应
进一步证实Nrf-2的作用在调节病菌的抗氧化效果AngII-challenged H9C2细胞,我们撞倒Nrf-2 AngII之前曝光的表达。与Ctrl相比,转染的细胞与特定的siRNA Nrf-2降低蛋白质含量> 70%(图3(一个))。疾病治疗明显调节Ho-1(图3 (b)),Nqo-1(图3 (c))AngII-challenged mRNA水平细胞,而外国佬没能引起这些基因在Nrf-2-knockdown H9C2细胞受到AngII相比 组。此外,治疗siNrf-2无法抑制O2−代(数据3 (d)和3 (e)),在AngII-stimulated Nrf2-knockdown H9C2细胞相比 组。H9C2细胞面积量化细胞表现出明显增加AngII组相比Ctrl组。外国佬组能显著降低细胞面积相比AngII组。然而,Nrf-2击倒H9C2细胞无法抑制相对增大细胞表面积(数字3 (f)和3 (g))。这些结果表明,疾病预防AngII-induced氧化应激和心脏肥大Nrf-2-dependent机制。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.4。疾病预防TAC-Induced体内心脏肥大和障碍
心脏肥大是一种适应性细胞反应类型的生物力学应力或超载,在心脏细胞的大小和厚度增加(30.]。阐明疾病的体内效应在肥厚性心,我们建立了一个心脏肥大模型通过使用TAC。TAC八周后,心肌功能是使用超声心动图评估。如数据所示4(一)和4 (b)与TAC组相比,疾病治疗(10毫克/公斤/天)组显示明显抑制TAC-induced减少射血分数(EF) %和部分缩短(FS) %。进一步,而虚假的集团TAC组显示,心脏舒张期心室间隔增加维度(IVSd)、心室间隔维度收缩(静脉注射),左心室舒张末期后壁厚度(LVPWd),左心室收缩期后壁厚度(LVPWs),左心室内部直径结束舒张(LVIDd)和左心室内部直径收缩(LVIDs)结束。治疗疾病可以显著扭转这种现象(表2)。此外,超声心动图左心室的图像使用M-mode表明TAC组相比, 组恢复心脏功能(图4 (c))。苏木精和伊红())和麦胚凝集素(WGA)染色组织学部分进一步证实了心肌细胞的大小显著扩大,而病菌抑制这些病理变化(数据4 (d)- - - - - -4 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
如图4 (g)虚假的组动物相比,那些在TAC组心脏大小显示一个明显的增加。相比之下,外国佬治疗缓解心脏肥大。此外,我们发现,与虚假的过程相比,TAC操作的比率显著提高心脏重量/体重(HW / BW);这种效应被外国佬减毒治疗(图4 (h))。此外,与虚假的组相比,TAC在mRNA的表达显著增加,心脏肥厚性标记的心房利钠肽(Anp),脑利钠肽(法国巴黎),Myhc-β。疾病治疗的TAC小鼠心肌肥厚的减毒这些参数(数字4(我)- - - - - -4 (k))。
3.5。外国佬的心血管效应的调制Nrf-2-Mediated体内抗氧化反应
一致的结果AngII模型,信使rna表达水平Nrf-2,Ho-1,Nqo-1由RT-qPCR体内模型的测量。如数据所示5 (c)- - - - - -5 (c)的mRNA水平Nrf-2,Ho-1,Nqo-1也被调节的吗 组与TAC组。接下来,我们评估的表达Keap-1 TAC-challenged心脏组织和确定是否心血管疾病。我们的数据表明,Keap-1染色TAC组和蛋白质浓度显著增加,但与疾病治疗(数据恢复到基线5 (d)- - - - - -5 (g))。基于上述结果,我们认为疾病是一种很有前途的天然剂,防止心脏肥大的激活Nrf-2-mediated抗氧化反应。(图5 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
4所示。讨论
在这项研究中,心脏肥大的体外模型建立了刺激与AngII H9C2细胞,导致大量心肌细胞肥大和氧化应激水平增加。疾病治疗显著地抑制氧化应激和改善心脏肥大。此外,C57BL / 6小鼠体内结果引起TAC是完全与在体外实验中获得的结果一致。我们发现这些病菌的抗氧化作用是通过Keap-1 / Nrf-2通路介导的。因此,疾病的潜在治疗价值心肌肥厚和Keap-1 / Nrf-2通路可能作为治疗目标治疗心脏肥大。
心脏肥大,最初的心血管系统疾病之一,众所周知,诱发心力衰竭(31日]。心脏肥大,包括生理和病理肥大,通常是被细胞大小的增加(32]。尽管这对发病机制的理解,为心脏肥大是无效的和有限的治疗方案。因此,新方法治疗心脏肥大,重塑,心力衰竭仍然需要被开发。我们的研究结果表明,外国佬显著减毒AngII-induced心肌细胞肥大和氧化应激的细胞H9C2(数字1和2)。我们建立了体内的心脏肥大模型使用TAC,发现疾病的治疗可以显著预防心脏肥大和功能障碍(图4)。此外,病菌抑制TAC-induced氧化应激和诱导抗氧化反应蛋白(数据的表达5(一个)- - - - - -5 (c)),同意从体外模型的结果。因此,我们可以得出这样的结论:这些抗氧化剂的影响疾病预防和治疗的关键心脏肥大。
众所周知,Nrf-2是无处不在的主转录因子上调一些抗氧化的酶如HO-1 NQO-1, SOD,氧化酶(33]。这种途径是被证明是与许多心血管疾病包括肥大有关。重要的是,Nrf-2被认为是一个重要的潜在目标治疗心脏肥大,心脏衰竭(34]。确认疾病预防心脏肥大通过激活Nrf-2-mediated抗氧化剂反应,我们使用特定的核Nrf-2。我们发现,疾病不能诱导HO-1 NQO-1或抑制ROS的生成和肥大的AngII-stimulated Nrf-2-knockdown H9C2细胞(图3)。Keap-1是一种内源性抑制剂和Nrf-2调节器。通常,Nrf-2存在于细胞质中通过绑定到其抑制剂Keap-1。在氧化应激条件下,Nrf-2从Keap-1分离出来,转移到细胞核,促进其下游抗氧化基因的表达等Ho-1和Nqo-1。我们进一步确定疾病是否可以激活Nrf-2抗氧化途径通过调制Keap-1 / Nrf-2途径。如数据所示5 (d)- - - - - -5 (g),Keap-1染色和蛋白质浓度显著增加TAC组和恢复疾病治疗。病菌可能调节Keap-1 / Nrf-2通路,促进抗氧化反应由Nrf-2的表达。因此,我们可以得出结论,外国佬的心血管效应涉及调制Keap-1 / Nrf-2通路。
5。结论
总的来说,这些结果表明,病菌的主要黄酮类黄芩,防止心脏肥大通过激活Nrf-2通路。这些发现为未来的研究提供支持和潜在使用外国佬来提高治疗心脏肥大(图5 (h))。虽然我们的研究结果是有前途的,我们的研究有一些局限性。还需要进一步的研究来确认病菌特别针对Nrf-2促进下游抗氧化基因的表达Ho-1和Nqo-1心脏肥大和变弱氧化应激。
缩写
| 疾病: | 汉黄芩素 |
| AngII: | 血管紧张素ⅱ |
| 医疗保险: | 新生大鼠心肌细胞 |
| TAC: | 横向主缢痕 |
| Nrf-2: | 核因子- (erythroid-derived 2 -) 2 |
| HO-1: | 血红素oxygenase-1 |
| NQO-1: | NADPH奎宁oxidoreductase-1 |
| H9C2: | 大鼠心肌细胞 |
| Keap-1: | Kelch-like ECH-associated蛋白1 |
| MDA: | 丙二醛 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| 她: | Dihydroethidium |
| BCA: | Bicinchoninic酸 |
| sds - page: | 钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳 |
| PVDF: | 聚乙二烯二氟化物 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| 英孚: | 射血分数 |
| FS: | 部分缩短 |
| IVSd: | 在心脏舒张期心室间隔尺寸 |
| 静脉注射: | 在收缩心室间隔尺寸 |
| LVPWd: | 左心室舒张末期后壁厚度 |
| LVPWs: | 左心室收缩期后壁厚度 |
| LVIDd: | 左心室内部直径心脏舒张期结束 |
| LVIDs: | 左心室内部直径收缩 |
| ): | 苏木精和伊红 |
| 编剧: | 麦胚凝集素 |
| HW / BW: | 心脏重量/体重 |
| ANP: | 心房利钠肽 |
| 法国巴黎: | 脑利钠肽 |
| MyHC -β: | 肌凝蛋白重chain-beta。 |
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。
伦理批准
这项研究是通过动物保健和使用委员会嘉兴大学第二附属医院(嘉兴,中国;没有批准。jxey - 2020 jx061)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
X.S.,B.Z., Z.C., and J.H. performed the research. J.H., X.S., B.H., and B.Z. designed the research study. X.S., B.Z., B.H., Z.C., and P.H. contributed essential reagents or tools. X.Z. and P.H. analyzed the data. X.S. and J.H. wrote the paper. Xiaowen Shi, Bin Zhang, and Zhenliang Chu contributed equally to this work.
确认
我们感谢我们的团队的成员的帮助,鼓励,和共享的试剂。这项工作得到了资助的科技局嘉兴城市,浙江,中国(没有。2019 ay32019 2020 ad30114 2021 ay30012 2018 ad32049, 2019 ad32084)。
补充材料
如补充图1所示,疾病预防AngII-induced肥大和氧化应激在基本医疗保险。(补充材料)