文摘
客观的。necroptosis Necrostatin-1 (Nec-1)抑制剂,据报道,防止心肌缺血再灌注(MI / R)受伤。然而,潜在的贡献antinecroptotic Nec-1对其梗死的影响限制和MI / R后心脏功能改善的影响没有被调查。方法。本研究调查了Nec-1对心肌梗死的影响大小,necroptosis,心脏功能恢复的老鼠受到心肌缺血再灌注(MI / R 30分钟/ 12、24、48、72小时)。结果。研究表明,Nec-1可能减少心肌细胞死亡和维护myoarchitectonic完整性,因此抑制反应性纤维化过程在大鼠心肌缺血/再灌注末。此外,管理Nec-1(0.6毫克/公斤)出现再灌注的差别显著降低肌酸激酶的释放和对这些自噬再灌注后24小时内,以及它们之间有显著的正相关关系。结论。这些结果表明,antinecroptosis治疗可能改善缺血性心脏病患者的临床结果。
1。介绍
缺血性心脏病是最严重的死亡原因在发达国家1]。早期再灌注后冠状动脉阻塞是最有效的手段限制缺血性心肌损伤。然而,大量证据表明再灌注可能会导致额外的细胞死亡称为再灌注损伤(2,3]。长期以来人们一直认为心肌细胞的损失,增加替代,和反应性纤维化导致疤痕形成导致心肌缺血再灌注后心脏功能障碍(MI / R) [4,5]。阻断信号转导导致细胞死亡显著减少再灌注后心肌梗塞面积,改善心肌功能恢复(4,6,7]。
越来越多的证据表明从动物实验和临床观察表明,心肌梗死缺血和再灌注后坏死造成的,传统的细胞死亡通路,gene-controlled程序性细胞死亡和细胞凋亡。虽然梗塞坏死的贡献大小是相当大的(8,9),细胞凋亡,细胞程序性死亡通常被认为比坏死更可控。最近,许多研究已经证实,细胞凋亡不是一个专门的程序性细胞死亡(10- - - - - -13]。例如,自噬细胞死亡作为necrosis-like细胞死亡已经确认小说程序性细胞死亡(称为II型程序性细胞死亡)11,12,14]。
II型程序性细胞死亡的特点是大量胞质自噬小体,它可以通过下调抑制自噬小体的形成(15]。自噬被认为是self-salvaged细胞机制以应对严重的情况下,在某个阈值具有保护作用。超过阈值将导致细胞死亡(16,17]。然而,最近的研究发现自噬细胞死亡引起的MI / R不能抑制通过阻断自噬通路(18- - - - - -20.]。因此,本研究认为一个上游的自噬机制在调节细胞死亡可能是一个关键事件在MI / R,但缺乏合适的工具有限公司进一步调查。
Degterev等人发现了一个小tryptophan-based分子称为Necrostatin-1 (Nec-1),可以专门抑制nonapoptosis通路从necrosis-termed necroptosis和保护大脑皮层缺血/再灌注(I / R)损伤。此外,他们表明necroptosis是一个延迟的过程,可以诱导自噬necroptosis脑I / R损伤(13]。一些研究已经发现,神经细胞、心肌细胞终末分化细胞,比其他类型的细胞自噬(更敏感21,22]。因此,Nec-1对心脏和大脑的影响可能是相似的,可能会有重要的治疗价值MI / R损伤。它最近被证明Nec-1心血管效应在2和4 h后再灌注心肌缺血30分钟(23,24]。这些结果强烈表明necroptosis发生缺血性/ reperfused心肌细胞可能导致心肌细胞死亡和减少Nec-1可能发挥其梗塞效应部分通过antiautophagic效应。然而,到目前为止,潜在的贡献antinecroptotic Nec-1对其梗死的影响限制,心脏功能改善心肌I / R后的效果没有直接调查。
因此,本实验的目的是(1)调查是否Nec-1总局necroptosis特定抑制剂,可以减少autophagy-like MI / R引起的细胞死亡,从而导致其减少梗塞和心肌再灌注后功能恢复在活的有机体内,如果是这样,(2)确定myoarchitectonic的影响与管理相关的必要的变化对antinecroptosis影响Nec-1设置的心肌缺血和再灌注。
2。材料和方法
2.1。动物实验协议
坚持的实验指导实验室动物保健和使用的协议,发表的《中华人民共和国(2004年6月3日发布)和动物保健机构委员会批准(伦理号码:2017 - 025(基础代谢率))。Sprague-Dawley老鼠在目前的研究中使用了从《动物农场》法案(四川绵阳,中国)。老鼠们被安置在无菌条件下约20°C和暴露在光周期12 h和12 h黑暗。他们喂养老鼠的食物和水随意在整个研究期间。提供至少一个星期的适应时间之前启动实验协议。
2.2。心肌I / R协议
男性Sprague-Dawley老鼠(200 - 285 g)和0.3克/公斤麻醉ip 10% chloraldurate与小动物呼吸机和通风。肢体领先第二的心电图记录。心肌缺血(MI)是由暂时具体化心脏在左胸切口和放置6 - 0丝绸缝合活结在冠状动脉左前降枝(小伙子)。MI后30分钟,活结被释放,和心肌reperfused (R) 12、24、48和72 h。老鼠被随机分配接受车辆(0.05% DMSO)或Necrostatin-1(0.6毫克/公斤,Sigma-Aldrich, Inc .)、美国)通过尾静脉出现再灌注。Sham-operated控制老鼠(虚假的MI / R)经历了相同的手术除了缝线置于左冠状动脉并不相关。最后R时期,心里迅速切除,I / R心脏组织分离和处理根据下面描述的过程。
2.3。测定心肌组织学
在再灌注后72 h,心肌样本固定在10%福尔马林和嵌入在石蜡和横向分段(5μ米)。马森的三色的染色(Sigma-Aldrich, Inc .)、美国)被用来跟踪的区域心肌梗死区和胶原沉积的程度和组织胶原原纤维的再灌注后在72 h。
再灌注后,样品在48 h在2.5%戊二醛固定在0.1 M磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)在4°C 2 h。标本被冲洗缓冲和后缀四氧化锇1%磷酸缓冲在4°C 2 h。脱水后的分级系列脱水丙酮、618年标本与环氧树脂渗透。超薄部分(50μ米厚度)是减少使用LKB超微切片机IV聚合后60°C,沾染了醋酸铀酰柠檬酸铅溶液,使用100 -残雪透射电子显微镜观察。相关计算公式 。
2.4。测定心脏功能损伤
MI / R-induced心脏功能障碍是监控缺血和0分钟前10分钟,12、24、48和72 h MI / R。左心室压力(LVD),包括左心室收缩压,舒张压,和舒张末期压力(LVDP LVSP,和LVEDP分别),是通过血流动力学分析数字化加工系统(PowerLab硬件,ADInstruments)。心率(HR)和最大的正面和负面的瞬时值的一阶导数LVP (+ dp / dtmax−dp / dtmax,分别)是来自计算机算法。缺血后恢复心脏功能被表示为一个百分比的preischemic价值。
2.5。血清肌酸激酶水平测定
从腹主动脉收集血液样本在不同时间点(12、24、48和72小时)从大鼠再灌注后对待Nec-1和离心机 10分钟。血清是储存在−70°C到使用。根据供应商的指令,血清肌酸激酶(CK)浓度测定使用诊断工具(南京建成,中国)。
2.6。免疫印迹分析
MAP-LC3的表达β(microtubule-associated蛋白轻链3β,LC3β)被免疫印迹检测。从组织匀浆蛋白分离通过sds - page和electroblotted硝基。这些墨迹被封锁在TBS 3% BSA(牛血清白蛋白),然后探测与兔子anti-LC3β抗血清(1:3000年,圣克鲁斯sc - 28266)在4°C一夜而激动。屁股都洗一次TBST (TBS 0.05%渐变20)和两次5分钟在TBS孵化1 h在室温下与HRP-conjugated山羊Anti-Rabbit IgG抗体(中山金桥1:3000年,中国)。5分钟的墨迹洗了三次TBST和发展化学发光检测设备(皮尔斯)。免疫印迹与惠普扫描仪的扫描,并吸干密度与Image-Pro + 5.0软件进行了分析。相关计算公式 。
2.7。统计数据
结果表示为一个 。使用双官能团的统计计算 - - - - - -测试(未配对,或双面)。两个变量之间的相关性进行了分析通过单一的线性回归分析SPSS 15.0统计软件。的值 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。年末Nec-1再灌注后心肌缺血的影响
histomorphological变化和再灌注后心肌梗塞大小在72 h检查确定的影响Nec-1后期大鼠心肌缺血和再灌注。在麻醉瓣的老鼠受到I / R协议,该Nec-1(0.6毫克/公斤)在再灌注的发病明显减少了反应性心内膜心肌纤维化的心外膜和梗塞大小 (汽车集团) ( ;图1),马森的三色的污渍5]。
(一)
(b)
(c)
通过观察LV组织再灌注后48 h时用透射电子显微镜,它是进一步发现,心肌超微结构组已经严重受损的车辆;心肌细胞解体,形成大液泡但几乎没有自噬小体。相反,Nec-1治疗能保持心肌超微结构的完整性和明显减少心肌细胞的损失。然而,有几个与弥散分布在一些心肌细胞自噬体(图2)。因此,Nec-1不仅可以救助左心室(LV)组织最终死亡,而且还抑制LV重构过程通过减少心肌细胞死亡。
(一)
(b)
3.2。心脏功能评估I / R后在不同的时间点在活的有机体内
与之前的研究一致,心肌缺血和再灌注导致心脏功能明显下降(图3)。如图3,LVEDP Nec-1治疗显著改善LVDP−dp / dtmax, + dp / dtmax(数据3(一个)- - - - - -3 (d))。具体来说,LVDP和LVEDP(每个12和再灌注后48 h)的老鼠接受Nec-1出现再灌注明显低于老鼠处理车辆(数字3(一个)和3 (b));−dp / dtmax和+ dp / dtmax(每12小时再灌注后出现再灌注的大鼠接受Nec-1明显高于老鼠的车辆(处理数据3 (c)和3 (d))。值得注意的是,增强LVDP和LVEDP汽车组的改变可能导致的心肌合规由于心肌梗死的面积较大。Nec-1治疗可以显著减少变更。
(一)
(b)
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(d)
3.3。LC3的变化β在不同时间点的白平衡试验
自噬是细胞退化过程负责的营业额不必要的或不正常的细胞器和细胞质蛋白质。在这个过程中,细胞质蛋白质或功能失调的细胞器被扣押在double-membrane-bound泡,称为自噬小体,运送到溶酶体融合作为自吞噬泡,然后退化(25]。LC3β在自噬体或局部自吞噬泡膜和自噬活动确定为一个优秀的标志(13,18- - - - - -20.,26]。通过确定心肌LC3的水平βI / R后在不同的时间点在活的有机体内,我们发现LC3的表达水平β在所有时间点后的I / R比对照组显著调节。治疗Nec-1导致LC3的表达水平明显下降β在12和24小时再灌注后但没有显著变化在再灌注后48和72 h,而相对汽车集团(数字4(一)和4 (b))。有趣的是,LC3的表达水平βNec-1组与车辆组相比均有显著调节在再灌注后48 h。这个结果可以解释为什么透射电子显微镜下观察到自噬小体的数量在再灌注后48 h Nec-1组高于相对汽车集团。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。与Nec-1 CK活性治疗后的结果
心肌损害的一个重要指标,血清CK水平监控I / R后在不同的时间点。Nec-1治疗显著降低血清CK水平12和24小时再灌注后,相比之下,相对汽车集团( 和 与 和 , 和 ,分别),CK水平在对照组 (图4 (c))。然而,Nec-1治疗不能减少血清CK水平48和72 h后再灌注;相反,血清CK水平Nec-1组的48 h后再灌注有明显增加,相比相对汽车集团( 与 , )。
因为免疫印迹的趋势显示血清CK水平惊人地相似,在Nec-1减少再灌注后的值小于12 h和延迟峰再灌注后48 h,它是决定研究它们之间的相关性。结果表明,虽然这些MI / R参数与个人间存在变异,MAP-LC3的表达β与血清CK水平显著相关( , ,图4 (d))。这些结果表明,necroptosis MI / R延迟autophagy-like引起的细胞死亡和MI / R中发挥了至关重要的作用。
4所示。讨论
这项研究表明,Nec-1(0.6毫克/公斤)可以保持心肌超微结构的完整性和明显减少心肌梗塞大小和反应性纤维化晚期再灌注后心肌梗死。此外,LVDP LVEDP, LV重构的基本决定因素,Nec-1组也显著低于车辆组。因此,我们证实Nec-1(0.6毫克/公斤)可以保护心肌对I / R损伤大鼠通过减少心肌细胞的损失和LV重构。此外,研究还发现,Nec-1更高浓度(1.8毫克/公斤)将增加大鼠的死亡率受到慢性心肌缺血(数据没有显示)。结果表明,Nec-1护心在低浓度,但有害的行为与浓度增加,这似乎与c . c . Smith的报道等。24]。
另一个有趣的工作的特点是确定necroptosis MI / R。自噬是一种高度保守的细胞机制的蛋白质回收,可能导致程序性细胞死亡(II型程序性细胞死亡)11,12,14,27]。因此,自噬作为细胞死亡途径中扮演着双重角色,一种内在的细胞死亡机制在某些情况下。终末分化细胞,心肌细胞被认为是更敏感比其他细胞自噬。一些研究表明,自噬是一种保护机制在慢性缺血20.,21,抑制自噬导致显著恶化I / R损伤的心肌细胞。相反,提高自噬具有潜在的保护性反应对I / R损伤心脏细胞(20.]。最近,在调节细胞自噬的影响生存和死亡在MI / R损伤仍然是有争议的26]。它被认为自噬的上游机制可能是一个关键事件在调节细胞生存和死亡在心脏缺血和再灌注期间。然而,自噬被认为是许多路径的结束(27,28];因此,很难判断哪些途径将至关重要。
2005年,l .燕等人发现了一个小分子称为Necrostatin-1 (Nec-1),可以抑制necroptosis nonapoptosis通路特点是自噬,自噬作为下游的后果necroptosis necroptotic细胞死亡,而不是一个因素在脑I / R损伤(18]。因为necroptosis和自噬是延迟缺血性脑损伤的机制,我们观察到LC3的改变β表达水平和血清CK水平,分别在12、24、48、72 h MI后再灌注,并发现政府的Nec-1出现再灌注的差别显著降低肌酸激酶的释放和对这些自噬在再灌注后12至24小时,但并不影响持续48和72 h后再灌注。肌酸激酶的释放之间存在相关性,自噬的表达。管理Nec-1正好与再灌注可以减少和延缓峰值再灌注后48 h。这些数据类似于赵et al .,谁表明,梗塞大小增加到峰值在再灌注24小时没有进一步增加48和72小时再灌注(29日),与自噬活动的高峰相一致。这证据提供了大力支持我们的假设necroptosis不仅是一个autophagy-like细胞死亡,但也是一个重要的贡献延迟心肌缺血后再灌注损伤。
本研究证实,Necrostatin-1心肌保护作用的大鼠心肌I / R损伤与自噬。然而,药物的有效剂量和相关的药理机制尚不清楚。为了进一步确定Nec-1的效果,进一步的研究可以探索最低有效剂量,药物的最佳治疗剂量和副作用,和Nec-1相关的分子生物学机制。
总之,这项研究表明,管理Nec-1抑制一个autophagy-like细胞死亡可能发挥重要作用在延迟心肌缺血后再灌注损伤,并显著提高心脏功能心肌缺血和再灌注后,表明antinecroptosis治疗可能改善缺血性心脏病患者的临床结果。然而,autophagy-like细胞死亡的机制需要进一步研究。因此,在接下来的研究中,Nec-1绑定目标的识别,和其它治疗策略探索减少心肌I / R损伤心肌细胞的死亡负责。
数据可用性
使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
王梁和雪白Lv的贡献同样工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金的赠款中国(号。30572084,30670835,30700276)。