文摘
背景。心肌梗死(MI)是心脏组织坏死引起的急性和持续性缺血缺氧的冠状动脉。本研究旨在调查长非编码RNA的表达(lncRNA) LINC00261 MI及其对心肌细胞的影响。方法。中存在的表达水平进行检测LINC00261, mir - 522 - 3 - p, TNRC6A在正常细胞和心肌梗死。免疫印迹分析检测TNRC6A蛋白的表达。生存能力和细胞凋亡在心肌梗死后心肌细胞的淘汰赛LINC00261或TNRC6A被检测到。mir - 522 - 3 - p之间的关系,LINC00261, TNRC6A心肌细胞使用双荧光素酶报告基因分析进行评估。缺氧预处理在正常细胞被用来构建一个模拟的MI环境调查的影响LINC00261心肌细胞的凋亡。结果。LINC00261和TNRC6A调节,mir - 522 - 3 - p在冠心病和心肌梗死组织表达下调。淘汰赛LINC00261可以增加心肌细胞的生存能力和抑制细胞凋亡。LINC00261目标mir - 522 - 3 - p在心肌细胞。此外,mir - 522 - 3 - p目标TNRC6A在心肌细胞。TNRC6A调节细胞生存和凋亡的心肌梗死后心肌细胞,可以抵消和TNRC6A-induced MI过度mir - 522 - 3 - p。结论。LINC00261下调mir - 522 - 3 - p在心肌梗死后心肌细胞通过直接针对mir - 522 - 3 - p。的直接目标是TNRC6A mir - 522 - 3 - p。我们的研究结果表明,LINC00261可能作为治疗心肌梗死的治疗目标。
1。介绍
心肌梗死(MI)是心脏组织坏死引起的急性和持续性缺血缺氧的冠状动脉1]。它是死亡的主要原因之一,有一个很大的人口每年新诊断为心肌梗死情况下(2- - - - - -5]。急性心肌梗死的预后密切相关的大小梗死大小、并发症和治疗(6]。大多数死亡发生在第一个星期内,更糟糕的是,在1到2小时后症状开始(7- - - - - -9]。因此,相当数量的病人在住院之前死于心室纤维性颤动。除了严重的心律失常,心肌梗死也可能会导致心原性休克、心力衰竭,甚至心脏破裂后住院治疗(10,11]。因此,寻找新的目标治疗心肌梗死的重要性。
长非编码rna (lncRNAs)广泛参与细胞代谢等生物过程,信号转导,增殖,分化,细胞凋亡,细胞死亡和具有重要意义对心血管疾病的发生和发展12]。lncRNA是一种RNA超过200元,没有翻译功能(13]。高通量测序技术的快速发展和微阵列技术,各种lncRNAs已确定在心脏病(发挥重要的生理功能14]。一项研究表明,损失函数LINC00261导致心血管发育障碍(15]。然而,在MI lncRNAs的监管机制仍然难以捉摸。
内生非编码单股的小分子核糖核酸(microrna)通常存在于真核生物和可以调节多个基因表达(16]。microrna是nt长(年龄在18岁至25岁之间17]。microrna能具体地识别并绑定到3 - - - - - -翻译区(3 - - - - - -UTR)的目标基因,导致退化的mrna或抑制翻译有针对性的mrna,从而发挥负面的监管作用,参与细胞增殖、分化、免疫调节和细胞凋亡18]。最近的一项研究表明,过度LINC00261可能与mir - 522 - 3 - p [19]。我们初步的生物信息学分析结果显示,LINC00261可以结合mir - 522 - 3 - p。三核苷酸repeat-containing基因6 (TNRC6A)是miRNA-mediated Argonaute-navigator蛋白质基因沉默在细胞核20.]。改变表达式TNRC6a和miR-21 MI报道(21]。我们的生物信息学分析结果表明,mir - 522 - 3 - p可能与TNRC6A [19]。因此,我们调查了LINC00261之间的交互,mir - 522 - 3 - p, TNRC6A MI。
2。方法
2.1。小鼠心肌梗死模型
共有100名男性C57B /社会应激小鼠年龄在8 - 10周大,体重年龄在18岁至25岁之间的g买来第一附属医院,蚌埠医学院动物研究所。腹腔内注射的小鼠麻醉手术前三溴乙醇溶液,在仰卧位固定鼠标板。MI组包括80只老鼠,虚假的20国集团包括老鼠。通风机是结扎左冠状动脉前降支的3 - 4毫米(如前所述)(22]。然后,手术后3 d、5老鼠死于心肌梗死组和不到老鼠死在虚假的组。10只小鼠的心肌组织的MI组和假组收获。在接下来的4周,10 MI组小鼠死亡,其余被安置为育种以下实验。本研究动物伦理委员会批准的第三附属医院、广州中医药大学。后所有程序涉及动物进行实验动物的使用指南。
2.2。细胞和MI感应
心肌细胞H9c2由希伯来文名字,中国。细胞在DMEM孵化与100 U /毫升青霉素、链霉素0.1毫克/毫升,10%的边后卫在37°C公司为5%2。缺血冠状动脉疾病的MI-acute在体外模型成立。模拟MI H9c2心肌细胞建立了执行环境缺氧预处理30分钟。干扰实验进行心肌梗死后心肌细胞恢复95% O2%和5%股份有限公司230分钟。
2.3。细胞转染
基因的超表达6 (TNRC6A)包含三核苷酸通过使转染pcDNA3.1-TNRC6A向量(美国表达载体)。mir - 522 - 3 - p模仿,mir - 522 - 3 - p抑制剂,si-RNA LINC00261和TNRC6A合成了GenePharma(上海,中国)。小干扰rna(中国上海)商业化寡核苷酸作为负控制(数控)。使转染实验使用Lipofectamine 3000(表达载体,卡尔斯巴德,加州,美国)。发现细胞的荧光强度在24 h posttransfection荧光显微镜下测量细胞转染率。
2.4。重组腺相关病毒9 - (rAAV9)介导的基因传递的心
操作的老鼠被随机选中,分成5组( )包括虚假的集团,MI组、rAAV9-PCDNA-LINC00261组(PCDNA-LINC00261) rAAV9-pcDNA-TNRC6A集团(pcDNA-TNRC6A),合并后的集团(表达PCDNA-LINC00261, mir - 522 - 3 - p,和pcDNA-TNRC6A)。接下来,20μl rAAV9向量包含 基因组拷贝(GC)被注入在左心室在五个随机选择的网站。老鼠的骗局和MI组注射rAAV9向量。LINC00261的表达水平,mir - 522 - 3 - p,和TNRC6A测量心肌注射后1周。
2.5。RNA原位杂交(ISH)和荧光原位杂交(FISH)
原位检测LINC00261转录都使用了RNAscope工具包(美国先进细胞诊断,海沃德,CA)。辣根peroxidase-based信号放大系统是用于目标探针杂交,紧随其后的是颜色开发3、3 - - - - - -diaminobenzidine。阳性染色是由褐色点状的点在细胞核和细胞质。如前所述(执行RNA-FISH23]。
2.6。RT-qPCR
总rna提取试剂盒(美国表达载体)。TIANScript II RT工具包(Tiangen北京)用于反向转录rna的互补。RT-qPCR反应是准备使用RealMastcrMix (SYBR绿色、天健生物科技有限公司,北京,中国)。的相对表达水平LINC00261和TNRC6A规范化的内部参考GAPDH使用2- - - - - -ΔΔCt方法,而mir - 522 - 3的表达水平- p U6-snRNA规范化。在这项研究中使用的引物序列表中列出1。
2.7。Dual-Luciferase化验
3的片段 - - - - - -UTR LINC00261和TNRC6A合成和融合pmiRRB-REPORORTTM向量(Libobio,中国)构建LINC00261和TNRC6A 3 - - - - - -UTR变异向量。H9c2细胞培养24 h与向量cotransfected (LINC00261 / TNRC6A宽类型(WT)或突变体(MT)),和荧光素酶报告基因质粒,mir - 522 - 3 - p模仿转染使用FugeneHD转染试剂(美国WI Promega,麦迪逊)48 h。洗后与80年与PBS和溶解μl(裂解缓冲,收集细胞检测荧光素酶强度分别由萤火虫荧光素酶和海参荧光素酶底物。荧光素酶强度是衡量标仪(美国热费希尔科学)。
2.8。MTT试验
转染心肌细胞培养在6-well板块为0,24、48和72 h,然后处理20μl MTT (Servicebio,中国)和5%的公司2在37°C 4 h。解决方案是吸气,通过与100瓶μ美国l二甲亚砜(σ),轻轻混合10分钟溶解晶体。光密度值(OD)与吸光度测量使用微型板块570海里。细胞存活率被记录。
2.9。流式细胞术
心肌梗死后心肌细胞与胰蛋白酶消化72 h posttransfection,其次是在1000转离心5分钟。细胞被清洗两次,在1000转离心5分钟。收集到的细胞被固定为1毫升乙醇在一夜之间在4°C。然后,100年μl的核糖核酸酶(Solarbio,中国)添加到孵化在37°C细胞在黑暗中30分钟。Propidium碘(50μl)随后补充道。在黑暗中孵化1 h后,细胞被流式细胞仪检测。
2.10。西方墨点法
里帕(Beyotime中国)被用来从H9c2细胞中提取的蛋白质。蛋白质浓度测定用BCA (BioTeke,中国)。在sds - page分离之后,蛋白质被转移到一个聚偏二氟乙烯膜(PDVF)。然后膜采用了5%脱脂奶1 h。然后,膜与anti-TNRC6A孵化(Abcam 1: 500年,美国),anticleaved caspase-3 (Abcam 1: 500年,美国),anti-BCL2 (Abcam 1: 1000年,美国),anti-Bax (Abcam 1: 1000年,美国),anti-cyclinD1 (Abcam 1: 1000年,美国),和GAPDH anti-cyclinD1 (Abcam 1: 1000年,美国)在4°C一夜之间,其次是进一步孵化山羊anti-rabbit免疫球蛋白g H和L-HRP (Abcam 1: 5000年,美国)。SuperECL (Applygen,中国)是用于检测膜结合免疫复合物。GAPDH是作为内部控制。
2.11。统计分析
使用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据表示为 (SD)。比较两组独立样本进行使用 - - - - - -测试。三个复制进行比较。单向方差分析测试随后Bonferroni事后测试进行分析多个组之间的差异。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。LINC00261和TNRC6A调节,mir - 522 - 3 - p在冠心病心肌梗死后组织表达下调
LINC00261的表达水平,mir - 522 - 3 - p, TNRC6A MI和正常细胞被RT-qPCR评估。结果表明,与正常细胞相比,LINC00261的表达水平明显增加心肌梗死后心肌组织,而mir - 522 - 3的表达水平- p明显下降( )(数据1(一)和1 (c))。此外,与正常细胞相比,TNRC6A显著调节细胞中MI后( )(图1 (b))。TNRC6A也是诱发心肌梗死后(图1 (d))。这些结果表明,在MI后细胞,LINC00261和TNRC6A调节,mir - 522 - 3 - p是表达下调。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。击倒LINC00261可以增加心肌细胞的生存能力和抑制细胞凋亡
RT-qPCR结果表明与si-LINC00261转染后,LINC00261的表达显著抑制( )(图2(一个))。与si-LINC00261转染后,心肌细胞的生存能力大大增强后1天( ),2天,3天( )(图2 (b))。此外,流式细胞术结果显示心肌细胞凋亡显著抑制与si-LINC00261转染后( )(图2 (c))。此外,si-LINC00261组显著减少心肌细胞G0 / G1比si-NC集团( ),虽然si-LINC00261组显著增加心肌细胞G2 / M ( )(图2 (d))。这些结果表明,击倒LINC00261增加心肌细胞的生存通过抑制细胞凋亡、促进细胞周期阶段的变化。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。LINC00261目标mir - 522 - 3 - p在心肌细胞
之间的绑定序列LINC00261和mir - 522 - 3 - p如图3(一个)。荧光素酶报告实验结果表明cotransfection mir - 522 - 3 p模仿和LINC00261野生型导致最低的荧光素酶活动( )在所有治疗(图3 (b))。此外,RT-qPCR结果表明击倒LINC00261导致mir - 522 - 3的表达水平增加- p在心肌细胞( )(图3 (c)),这表明LINC00261可以结合mir - 522 - 3 - p在心肌梗死后心肌细胞。
(一)
(b)
(c)
3.4。mir - 522 - 3 - p目标TNRC6A在心肌细胞
绑定序列mir - 522 - 3 - p和TNRC6A如图4(一)。荧光素酶报告实验结果表明,与NC组相比,荧光素酶的比例cotransfected mir - 522 - 3 - p模仿和WT TNRC6A较低( ),虽然TNRC6A突变(没有区别 )(图4 (b))。荧光素酶报告实验结果表明,结合位点的mir - 522 - 3 - p TNRC6A是独一无二的。免疫印迹分析识别mir - 522 - 3 - p之间的关系和TNRC6A在体外。在cotransfection mir - 522 - 3 p模仿和TNRC6A TNRC6A的表达水平与数控( )(数据4 (c)和4 (d))。这些结果表明,mir - 522 - 3 - p可以抑制TNRC6A的表达体外。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。TNRC6A调节细胞生存能力和心肌梗死后心肌细胞的凋亡
RT-qPCR结果表明TNRC6A的表达显著抑制si-TNRC6A治疗后,和TNRC6A的表达诱导pcDNA3.1-TNRC6A转染后( )(图5(一个))。si-TNRC6A转染后,心肌细胞的生存能力大大增强后1天( ),2天,3天( )(图5 (b))。PcDNA3.1-TNRC6A治疗可以显著抑制细胞生存能力后1天( ),2天,3天( )(图5 (b))。流式细胞术结果显示与NC组相比,没有明显的细胞凋亡率差异mir - 522 - 3 - p模仿+ pcDNA3.1-TNRC6A集团( )(图5 (c))。然而,在四组,si-TNRC6A组凋亡率最低( ),和pcDNA3.1-TNRC6A组凋亡率最高( )(图5 (c))。此外,si-TNRC6A心肌细胞G0 / G1组明显少于NC组( ),虽然si-TNRC6A组,G2 / M心肌细胞有显著增加( )(图5 (c))。但pcDNA3.1-TNRC6A可以逮捕在G0 / G1期细胞阶段( )(图5 (c))。与NC组相比,G0 / G1期pcDNA3.1-TNRC6A组心肌细胞被封锁(图6(一))。检查是否相反的效应是由于之间的直接绑定TNRC6A LINC00261,荧光素酶的记者进行了试验检测TNRC6A之间可能的绑定和LINC00261;结果表明它们之间没有约束力的潜力(图6 (b))。总之,mir - 522 - 3 - p模仿有效逆转心肌细胞的生存能力或细胞凋亡诱导pcDNA3.1-TNRC6A MI后,和LINC00261逆转效应是独立的。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
3.6。LINC00261可以调节心肌细胞和细胞凋亡的可行性在活的有机体内
识别LINC00261的功能在活的有机体内,RNA是用来探测范围的表达LINC00261 mi原位,结果表明,LINC00261主要是心肌细胞表达但不是上皮细胞(图7(一))。此外,AAV-si LINC00261也交到MI的老鼠。符合在体外结果,免疫印迹结果apoptosis-related标记表明si-LINC00261减毒细胞凋亡(图7 (b))。AAV-PCDNA-LINC00261也交到MI老鼠,提高了细胞凋亡和细胞周期G0 / G1心肌细胞也被捕(图S1)。
(一)
(b)
3.7。linc00261 - mir - 522 - 3 - p / TNRC6A轴调节心肌细胞凋亡在心肌梗死模型
确定的角色linc00261 - mir - 522 - 3 - p / TNRC6A轴MI保护的过程中,一系列的心pcDNA-LINC00261过度集团pcDNA-LINC00261 + PCDNA-TNRC6A集团,pcDNA-LINC00261 + PCDNA-TNRC6A + mir - 522 - 3 - p模仿组MI后准备。此外,流式细胞术测定进行检测细胞的凋亡率(图在上面的组8)。这些结果表明,细胞凋亡是提高LINC00261的过度表达,增强TNRC6A但获救mir - 522 - 3 - p。
(一)
(b)
4所示。讨论
先前的研究已经建立的角色等lncRNAs lncRNA MIAT [24),lncRNA KCNQ1OT1 [25],lncRNA CAIF [26在MI)。这些研究表明lncRNAs广泛参与信号传输和影响细胞代谢,生长、分化、凋亡和死亡(27,28]。他们也扮演了一个重要的角色在心血管疾病的发生和发展29日,30.]。我们的研究调查在MI LINC00261样本的表达水平。我们发现LINC00261的表达水平明显增加心肌梗死后心肌组织中。此外,心肌细胞的可行性与si-LINC00261转染后明显增强。心肌凋亡细胞明显抑制与si-LINC00261转染后。第一次,我们在这里报道,LINC00261的表达在心肌梗死后心肌细胞,调节和击倒LINC00261可以增加心肌细胞的生存能力和抑制细胞凋亡。
mir - 522 - 3 - p是证明发挥助长的作用在不同类型的人类癌症或肿瘤抑制作用,如结肠直肠癌(31日)和肺癌(19]。然而,心脏疾病,非常有限的信息披露。在我们的研究中,我们发现mir - 522 - 3 - p的表达水平明显降低心肌梗死细胞和组织的价格相比正常的细胞和组织。最近的一项研究报道了针对LINC00261之间的影响和mir - 522 - 3 - p (19]。在我们的研究中,生物信息学分析和荧光素酶记者分析表明LINC00261可以目标mir - 522 - 3 - p。RT-qPCR LINC00261导致的结果表明,击倒mir - 522 - 3的表达水平增加- p在心肌细胞。与之前的研究一致,我们发现LINC00261目标mir - 522 - 3 - p MI后的心肌。
人类TNRC6A的c端域是miRNA-mediated Argonaute-navigator蛋白质基因沉默在细胞核20.]。最近的一项研究报道,TNRC6A特异表达在MI的表达(21]。此外,一些microrna能结合TNRC6A发挥组合效应在不同的细胞(20.,21]。在我们的研究中,我们发现TNRC6A MI后显著调节细胞与正常细胞。此外,荧光素酶活性和免疫印迹结果证实,mir - 522 - 3 - p可以结合TNRC6A在心肌细胞。我们所知,我们是第一个报告,mir - 522 - 3 - p目标TNRC6A在心肌细胞和绑定mir - 522 - 3 - p和TNRC6A TNRC6A的差别导致了对这些心肌细胞。
TNRC6 microrna的函数的显示为一个主监管机构在MI (32]。沉默TNRC6a导致低氧诱导upregulation miR-15b, miR-21, miR-26, miR-34a, mir - 140,而不是他们的差别反映出对这些目标蛋白(32]。在我们的研究中,我们发现,心肌细胞的可行性si-TNRC6A转染后明显增强。TNRC6A的治疗可以显著抑制细胞的可行性。此外,si-TNRC6A组显著减少G0 / G1心肌细胞,而si-TNRC6A组显著增加G2 / M NC组心肌细胞。TNRC6A调节细胞生存和凋亡的心肌梗死后心肌细胞,和mir - 522 - 3 - p有效逆转可行性或TNRC6A引起的心肌梗死后心肌细胞的凋亡。
5。结论
LINC00261下调mir - 522 - 3 - p,和TNRC6A直接mir - 522 - 3 - p的目标。我们的研究结果表明,LINC00261可以作为治疗剂治疗心肌梗死。
缩写
| 鱼: | 荧光原位杂交 |
| GC: | 基因组拷贝 |
| 伊什: | 原位杂交 |
| lncRNA: | 长非编码RNA |
| microrna: | 小分子核糖核酸 |
| 小姐: | 心肌梗死 |
| NC: | 消极的控制 |
| TNRC6A: | 三核苷酸repeat-containing基因6 |
| 3 - - - - - -UTR: | 3 - - - - - -未翻译。 |
数据可用性
生成的数据集和/或分析在当前研究由于研究设计不公开但可从相应的作者以合理的要求。
伦理批准
本研究动物伦理委员会批准的第三附属医院、广州中医药大学。所有程序中执行研究涉及动物进行实验根据指南的使用在中国实验动物。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
补充材料
补充图1:LINC00261对心肌梗死后心肌细胞凋亡和细胞周期。(A)细胞凋亡检测pcDNA和PCDNA-LINC00261 MI后转染H9C2细胞。(B)相变与pcDNA转染或pcDNA MI后LINC00261。与pcDNA组相比, 。(补充材料)