文摘
介绍。在动物模型中,预处理是一种强大的武器对缺血性损伤。为什么不能免受人类心脏缺血性预处理的影响尚不清楚。有假设人类是由缺乏预处理相伴dyslipoproteinemia和动脉硬化等疾病。本研究调查是否dyslipoproteinemia以及由此导致动脉硬化可引起小鼠的心脏的先决条件的影响。方法。缺少的低密度脂蛋白受体的老鼠们注入了长期(14 - 16周)脂肪粥样硬化饮食诱发动脉硬化。动脉硬化被发现通过组织学检查和血管收缩测试。LDLR - / -和野生型小鼠被随机分配给anesthetic-induced,远程缺血预处理。所有的老鼠受到45分钟的冠状动脉闭塞和再灌注的180分钟。在风险和梗塞面积大小是由伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑染色。结果。组织病理学检查显示,高脂肪硬化的动脉粥样硬化美联储LDLR - / -小鼠血管放松能力是野生型小鼠相比显著降低。野生型,正如所料,梗塞大小被预处理控制相比显著降低。LDLR - / -小鼠,梗塞大小被预处理控制相比显著降低。令人惊讶的是,LDLR—/—对照组也有明显减少梗塞大小比野生型对照组。结论。我们能够证明高脂肪饮食形态和功能触发LDLR - / -小鼠动脉粥样硬化。有趣的是,LDLR - / -小鼠患饮食小梗塞大小与野生型小鼠相比。此外,另外预处理降低心肌梗塞大小LDLR - / -小鼠。长期高脂肪粥样硬化饮食和预处理似乎导致添加剂在LDLR - / -小鼠心脏保护。
1。介绍
急性心肌梗死(AMI)是全球死亡率和发病率的主要原因。有一个广泛的寻找心血管治疗降低心肌缺血再灌注(IR)损伤。缺血预处理是一个有趣的现象,短暂的缺血,因此,不会引起组织坏死,而不是呈现组织和器官抗持续缺血性的侮辱。第一份报告后,聪聪等人的预处理,以防止缺血再灌注损伤(IRI),人们进行了无数次研究[1]。在接下来的几年里,许多体外和体内的研究为预处理的infarct-sparing潜力提供了强有力的证据,是脑缺血(IPC),远程缺血(RIPC),或anesthetic-induced (APC)预处理。预处理的整体效果在动物实验带来了希望寻找一个infarct-sparing干预在临床设置。然而,大型随机前瞻性研究的数据令人失望(2]。
IPC与重复的情节在一个血管床短暂缺血保护器官(如心肌)随后长时间的缺血在同一血管床(3]。第一个被穆雷,IPC技术目前主要用于实验设置。在RIPC,缺血刺激是应用于一个器官远程目标器官。例如,短暂的缺血下肢,冠状动脉阻塞,减少梗塞大小在一只兔子模型(4]。神经和体液组件参与信号传递从外围刺激网站目标器官,作为保护介质(5]。这些介质也可以由麻醉剂没有预处理缺血期(6]。几个条件可能占减轻预处理效果的临床研究。很多因素可以减轻预处理,包括老年和女性性,以及高血糖β肾上腺素的拮抗剂(7- - - - - -10]。此外,建议与伴随动脉粥样硬化内皮功能障碍抑制预处理。这项研究的作者已经证明了此前anesthetic-induced预处理缺席在以挪士基因敲除小鼠与内皮功能障碍(11]。预处理的报道在动脉粥样硬化的动物是不一致的。在兔子和老鼠,高脂血症和动脉硬化可以废除预处理[12,13]。然而,其他研究报告成功的IPC或RIPC hyperlipidemic和动脉粥样硬化的动物14]。在孤立的动脉粥样硬化小鼠的心脏,预处理据报道是有效的(15]。动脉粥样硬化是否废除预处理小鼠体内没有被调查。因此,我们通过高脂饮食诱导动脉粥样硬化LDLR - / -小鼠和这些动物体内进行心肌梗死有或没有anesthetic-induced和远程缺血预处理。
2。材料和方法
2.1。动物
本研究中使用的所有实验程序和协议进行审核和批准由政府较低的法兰克尼亚(巴伐利亚,德国)动物保健和使用委员会(54 - 2532.1 18/14)。所有实验符合美国生理学会动物保健和使用的指导原则,并按照指南的护理和使用实验动物(16]。
八周大的雄性C57BL / 6 (WT)小鼠和LDLR - / -(背景C57BL / 6) (LDLR - / -)小鼠用于所有实验(查尔斯河实验室,Sulzfeld,德国)。动物们被安置在控制条件下(22°C,湿度55 - 65%,12 h光暗周期),被允许免费使用自来水。一周驯化后,LDLR - / -小鼠喂养高脂肪饮食(SM M-Z粥样硬化,+ 1%胆固醇、基础V1124) (ssniff Spezialdiaten GmbH是一家,所以,德国)14 - 16周。野生型吃普通食物的同类老鼠。所有的老鼠受到实验22至26周的年龄。
2.2。外科手术
戊巴比妥钠用于麻醉诱导(60毫克/公斤体重i.p)和维护(10 mg / kg / h i.p。)。老鼠放在一个温控加热表(RT Effenberg,慕尼黑,德国)直肠温度计探头连接到一个热反馈控制器来维持体温在36.5°C (37.5°C。麻醉诱导后,老鼠被固定在仰卧位,上、下肢表附加到可移动的磁带。气管手术暴露,钝聚乙烯套管(Insyte 22 g, Beckton Dickinson)插入气管通过气管切开术。所有老鼠机械通风50:50空气/氧气混合使用啮齿动物呼吸机(SAR 830 /美联社CWE Inc .,表现杰出,PA,美国)。一个3-lead needle-probe心电图(ECG)是连接到正确的颈总动脉,和一个盐水填充PE-10导管插入正确的颈静脉。血流动力学参数,即心率(HR)、平均动脉压(MAP)和温度,测量结束时(MEM15记忆阶段 ),结束时冠状动脉闭塞(曹)和再灌注后60分钟(REP60 )。
小鼠被随机分配到6组( 每组)。对照组小鼠没有收到曹前time-matched时期进一步治疗。七氟醚(APC预先处理组小鼠与1.0 MAC Sevorane®,雅培,威斯巴登,德国;曹(之前3.4卷- %)17]。七氟醚是管理15分钟通过呼吸器曹(前30分钟18]。RIPC组小鼠受到15分钟前左下肢动脉闭塞冠状动脉闭塞使用止血带。所有协议进行WT和LDLR - / -小鼠。Anesthetic-induced和远程缺血预处理是紧随其后的是一个记忆阶段前15分钟- COA。这个实验协议如图1。
在所有组,冠状动脉闭塞正直的解剖显微镜下进行(蔡司奥林巴斯SZX12,耶拿,德国)。左前开胸后,暴露心脏,心包和解剖,左冠状动脉(LCA)视觉识别。LCA的结扎在的网站出现在左心房,导致大量心肌梗塞包括前、后,心脏的顶端区域(18]。一旦视觉识别,一个8 - 0尼龙缝线(缝线,Ethicon、Norderstedt、德国)放置在LCA。曹执行使用悬挂物体系统(19]:简而言之,LCA缝线穿过一小片blunt-edged塑料管(PE-10油管),和两个小重量(1 g)两端。当自由重量挂,LCA立即被阻挡。LCA闭塞终止一旦权重支持。成功证实了LCA阻塞立即改变容器的颜色(从光红色暗紫色),颜色的变化提供的心肌血管(从鲜红到白色),心电图和圣海拔的存在。再灌注期间,颜色的变化立刻消失当悬挂重物,LCA reperfused支持。在整个过程中,心脏一直湿用一块潮湿的药棉。
2.3。测量风险和心肌梗死面积的大小
心肌梗塞大小(是)和地区(AAR)确定风险描述Redel et al。18):再灌注后,小伙子reoccluded, 1毫升伊文思蓝(0.1 g / mL;Sigma-Aldrich Taufkirchen、德国)和在慢慢注入颈动脉描绘AAR。后致死剂量注射戊巴比妥(150μg / g i.p。),心脏被迅速删除。左心室是切割,切成8横片1毫米厚使用丙烯酸心矩阵(Aster产业,McCandles, PA,美国)。片都是孵化与2%氯化三苯基四氮唑(TTC、Sigma-Aldrich Taufkirchen,德国),固定在10%福尔马林,体重,和数字拍摄(富士Finepix S3 Pro,东京,日本)。这些照片进行分析与图像分析软件(Adobe Photoshop CS 8.0.1;Adobe Systems Inc .)圣何塞、钙、美国)和梗塞的面积(IA), AAR,和正常区域(新西兰)被一名调查员量化盲治疗协议。IA的结果分数,AAR和新西兰的每片的重量乘以片。梗塞大小是由下列公式计算: 。老鼠的AAR不到20%的左心室被排除在进一步分析。
2.4。组织学分析主动脉根
验证动脉粥样硬化脂肪/患美联储LDLR - / -小鼠,hematoxylin-eosin——(他)主动脉的彩色部分是定性研究,与野生型小鼠相比。主动脉根是孤立的,嵌入Tissue-Tek (T.O.C.化合物,樱花好技术,东京,日本),和液氮快速冻结。OCT-embedded样本连续切成截面(5μ米厚),hematoxylin-eosin染色根据制造商的说明进行。使用显微镜(徕卡,位于德国,40 x放大),动脉硬化的典型形态(泡沫细胞、内膜厚度和纤维帽)是定量分析。
2.5。血管收缩Myography
安乐死老鼠后,灌注血管系统和肠系膜血管系统解剖。两个分支的肠系膜上动脉被用于实验。这些船段夹两个毛细血管之间的肌动描记器(111 p, DMT、奥尔胡斯、丹麦)灌注和氧合克雷布斯振铃器解决方案(37°C; )。腔和血管的壁厚测量与校准视频系统在三个不同的位置。平衡时间后,去甲肾上腺素(NA)或乙酰胆碱的浓度(Ach)从10910 mol / L4mol / L。每一步引入一种新的浓度与克雷布斯被一个40分钟的本事相分离的解决方案。接下来,一个不可逆转的没有合酶抑制剂L-NAME(20分钟的孵化时间)在集中管理105mol / L。与10 precontraction后5mol / L去甲肾上腺素,乙酰胆碱是管理增加浓度(10-10年到104mol / L),并在每个浓度,扩张血管腔的测量。
2.6。统计数据
意味着±SEM和展示数据统计分析使用Mann-Whitney测试和克鲁斯卡尔-沃利斯检验。25 IBM SPSS统计软件SPSS Inc .,阿蒙克,纽约,美国)是用于统计分析。< 0.05的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
67年分配给老鼠实验协议,19个被排除在研究由于心搏停止考试结束前或因技术问题。24额外老鼠用于组织学HE-staining动脉和myographic血管收缩测试。总共91只老鼠被用于这个调查。
3.1。他对主动脉根染色
他在野生型染色显示,正常饮食的老鼠,血管壁明显分层,内膜光滑,不增厚,没有脂质沉积在内皮细胞,平滑肌细胞在媒体上被安排在一个有序的方式。LDLR - / -小鼠喂养12周高脂饮食,内膜下有明显的斑块形成。斑块中泡沫细胞胆固醇晶体和存款,内膜明显增厚,平滑肌细胞中模被扰乱了。(图2)。动脉硬化的蜕变是存在于所有LDLR - / -小鼠但没有野生型老鼠。
3.2。体重、温度、和血流动力学参数
没有显著差异的小鼠的体温。高脂肪饮食的体重LDLR - / -小鼠相比,对照组明显高于WT的老鼠( g vs。 克, )。在APC和RICP组,LDLR—/—一个患饮食的老鼠体重也有显著提高(表1)。
心率明显高于,地图在WT显著降低小鼠LDLR - / -小鼠相比,在控制和APC组在整个实验协议(表2)。
RIPC组,只有MEM15地图在WT显著降低小鼠相比LDLR - / -小鼠( 毫米汞柱vs。 毫米汞柱, )。没有其他血流动力学参数的显著差异(表2)。
3.3。面积(AAR)和梗塞风险大小(是)
风险没有显著差异在该地区的社会团体内部的比较测试WT和LDLR—/—组织(图3)。LDLR—/—组织往往有更大的比WT老鼠AAR,尽管在成对比较的案子,APC,和RIPC组,只有CON LDLR - / -小鼠相比明显增大AAR CON WT ( % vs。 %, )。
梗死体积明显减少LDLR - / -小鼠相比WT (CON LDLR - / -小鼠( )与反对WT ( ), ;APC LDL - / - ( %)与APC WT ( %), ;和RICP LDLR - / - ( %)与RIPC WT ( %), )(图4)。在野生型小鼠,anesthetic-induced预处理( %; 与WT CON)和远程缺血预处理( %; 与WT CON)与对照组相比明显减少梗塞大小( %)。LDLR - / -小鼠,anesthetic-induced预处理( %; 与LDLR - / - CON)和远程缺血预处理( %; 与LDLR - / - CON)相比显著降低梗塞大小控制LDLR - / -小鼠(图4)。
3.4。血管收缩Myography
AMS的放松能力显著降低LDLR - / -小鼠相比WT老鼠( % vs。 %; )。不可逆以挪士抑制剂L-NAME减少的放松能力AMS LDLR - / -小鼠 %, % ( )在WT老鼠 %, % ( )。
4所示。讨论
的主要治疗心肌梗死(MI)是立即闭塞静脉的血管再生。然而,突然再灌注缺血组织的血管并不是没有风险。从缺血主要组织损伤后,随后再灌注导致进一步组织损伤(20.]。这种效应被称为缺血再灌注损伤(IRI)。数据表明,自由基和炎症反应可能导致这种IRI效应(21,22]。通过重复亚致死的缺血性预处理时间或药物可以使细胞更耐IRI (1]。人们进行了无数次研究在过去三十年中阐明的潜在机制和临床适用性预处理[23];这种治疗诱发转录和转译细胞修改(6,24]。在实验研究中,心肌预处理的影响是巨大的。令人失望的是,在临床研究中,心肌预处理的效果不太普遍,甚至缺席(2]。
并发症和年龄,至少部分解释这些预处理在临床研究的好处有限。预处理的效果已被证明是减轻存在不同的并发症如artherosclerosis [10,25]。动脉硬化会损害内皮号功能,在eNOS-deficient老鼠,预处理[缺席11,26]。然而,报道称,预处理在动脉粥样硬化动物是不一致的12,15]。本研究的目的是使用一个体内小鼠动脉粥样硬化模型,调查如果远程和anesthetic-induced预处理是这些动物受损。令人惊讶的是,在我们的实验中,预处理与dietary-induced缺少保存在低密度脂蛋白受体的老鼠们注入了动脉硬化。
在我们的研究中,我们使用了一个建立动脉粥样硬化动物模型和美联储LDLR-deficient小鼠高脂饮食(27]。动脉粥样硬化的发展验证了主动脉横截面的组织学检查证实动脉硬化性改变主动脉内膜中层的老鼠。而血管动脉硬化影响所有作为一种全身性疾病(28,29日),动脉粥样硬化不进步线性和表现模式的船只是不均匀的。动脉硬化的发展是一个复杂的过程,尤其是在初始阶段。组织学的变化可以早期发现动脉,而小型船舶以后可能发生的变化(30.,31日]。因为我们没有冠状动脉进行组织学检查,我们不能排除动脉粥样硬化和冠状动脉的内皮功能障碍的早期阶段在我们的实验。有趣的是,另一个研究孤立的老鼠心脏仍然保存预处理[报道严重动脉粥样硬化15]。缺血性预处理可能是介导以旁分泌的方式,而远程预处理只能由系统性的使者。确切的机制还没有完全阐明,目前还不清楚如果小鼠动脉粥样硬化冠状动脉的阶段是任何关系的保存预处理效果我们报告。
除了形态调查,我们进行了实验测试和检查功能的动脉粥样硬化的放松小型船舶使用肌动描记器(SMA)部分。即使有一些残留eNOS-mediated在动脉粥样硬化血管松弛LDLR - / -小鼠,LDLR的响应- / -小鼠血管放松整体下降。这些数据提供了证据表明,动脉粥样硬化内皮功能障碍在系统性开发水平在我们的实验模型。然而,由于预处理介导至少部分由内皮没有合酶(11),我们预期我们的模型显示至少减少梗塞大小通过预处理即使剩余以挪士活动。完全保存预处理的效果不能确切解释我们的发现。很明显,健壮的心血管效应独立于预处理被激活在小鼠用于我们的实验中,由于心肌梗塞大小减少高脂肪的美联储LDLR - / -小鼠相比WT在控制条件下小鼠。假设高脂肪饮食在LDLR - / -小鼠心脏保护支持导致数据从et al .,吉伦特报道,更长的hypercholesterolemic饮食LDLR - / -小鼠导致减少IRI损伤(32]。
令人惊讶的是,预处理不仅是保存在动脉粥样硬化LDLR - / -小鼠,但它确实增加了否则诱导心脏保护。一个可能的解释可能的相互作用以挪士,谷胱甘肽。在他们的研究中,吉伦特等人能够证明心肌谷胱甘肽含量增加LDLR - / -小鼠hypercholesterolemic饮食(32]。谷胱甘肽是一个激进的食腐动物,因此在缺血再灌注损伤中起着重要的作用。如果增加谷胱甘肽水平确实由于长期高胆固醇血症调节心血管效应,这与预处理研究未来的研究。
5。结论
综上所述,长期高脂肪硬化的饮食和预处理(APC / RIPC)似乎是一种添加剂在LDLR - / -小鼠心脏保护。跨物种声明关于影响因素前提能力似乎并不可能。
数据可用性
本研究的数据都可以在作者的要求。
伦理批准
下的研究进行伦理委员会参考号码“54 - 2532.1 18/14。”
信息披露
作者声明,他们同意并负责数据提出了研究。这个手稿尚未发表,不考虑其他地方出版。
的利益冲突
我们声明,没有竞争的金融,专业或个人利益可能影响性能或演示本手稿中描述的工作。
作者的贡献
沃尔特Petermichl和安德烈亚斯Redel构想提出的想法。沃尔特Petermichl和安德烈亚斯Redel发达的理论。凯瑟琳Eglmeier迈克尔•格鲁伯和黑森州h进行计算。沃尔特Petermichl写的手稿Andreas Redel的支持。Andreas Redel监督这个项目。安德烈Bredthauer回顾和评论的手稿。所有作者讨论了结果,导致最后的手稿。
确认
我们感谢Gabriele Bollwein评论大大改善了手稿。本研究使用部门执行研究经费。