文摘

目标。观察av的效果β3单链DNA (ss)对血管平滑肌细胞的增殖和迁移(VSMCs)和其潜在的机制。背景。才需要安排心导管是目前经皮穿冠状血管成形术治疗冠心病的首选方法。然而,PTCA治疗后血管再狭窄仍然发生,严重影响PTCA的临床疗效。整合素avβ3,广泛表达于多种细胞表面,起着重要的作用在VSMCs的增殖和迁移。方法。在这个实验中,我们使用指数富集配体的系统进化(SELEX)屏幕avβ3 ssDNA,具有较高的亲和力和特异性avβ3蛋白质。MTT、Transwell和细胞划痕进行化验检查av的效果β3 ssDNA VSMCs的增殖和迁移。流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期进程。av的影响β3 ssDNA Ras-phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinase /增殖蛋白激酶(PI3K / MAPK)信号通路被评估定量逆转录聚合酶链反应和免疫印迹。结果。在目前的研究中,我们发现avβ3 ssDNA大大减少骨桥蛋白的表达,粘着斑激酶,Ras, p-PI3K, p-MAPK mRNA和蛋白水平( )。Avβ3 ssDNA也抑制VSMC增殖和迁移而促进细胞凋亡( ),演示的upregulation proapoptotic蛋白质伯灵顿和活跃的半胱天冬酶3 ( )。结论。研究结果表明,avβ3 ssDNA抑制增殖和迁移VSMCs通过抑制Ras-PI3K / MAPK信号的激活。

1。介绍

冠心病是一种高风险条件在心血管疾病和全球死亡率最高的国家之一。据报道,心血管疾病占超过40%的居民与疾病相关的死亡在2017年在中国(1),远高于肿瘤和其他疾病的发病率。冠心病心肌缺血,缺氧、坏死引起的冠状动脉狭窄和阻塞。才需要安排心导管是经皮穿冠状血管成形术的主要方法之一冠心病的临床治疗,但治疗后血管再狭窄仍然发生,严重限制了PTCA疗效的临床实践。血管平滑肌细胞的增殖和迁移(VSMCs)一直被视为post-PTCA再狭窄的主要原因(2,3]。因此,发展的方法来抑制VSMC迁移和扩散在心血管研究已经成为一个紧迫的问题。

整合素avβ3,与细胞外基质结合蛋白质配体,广泛表达于内皮细胞表面,血小板,单核细胞和其他细胞。胚胎发育密切相关,血管生成,肿瘤细胞的浸润和转移,炎症(4,5]。Avβ3是破骨细胞中高度表达,是最重要的整合素调节破骨细胞功能,参与破骨细胞分化、迁移、粘附,形成封闭的区域(6]。相反,avβ3是不成熟的血管内皮细胞表达,但激活血管内皮细胞中高度表达。它搭建起扩散、迁移和血管内皮细胞的粘附,生存信号传递到细胞,抑制细胞凋亡(7]。

作为明星分子靶向治疗,核酸适体药物已经用于多种临床应用,包括癌症(8,9),新血管形成10),急性冠脉综合征(11]。寡核苷酸适配子具体绑定到目标蛋白质发挥其疗效。研究表明,寡核苷酸适配子限制细胞增殖和迁移通过抑制翻译和阻止细胞粘附12,13]。Cerchia发现寡核苷酸适配子不仅绑定到目标蛋白质,还阻止下游靶蛋白的信号,导致细胞和分子的变化(14]。Kimoto等人发现Raf-1寡核苷酸适配子可以绑定的Ras域Raf-1蛋白质,使其无法被Ras激活信号转导[15]。虽然有越来越多的研究在寡核苷酸适配子,据我们所知,很少有研究进行了开发特定的适体,直接绑定到avβ3蛋白质。

我们假设av的堵塞β3蛋白质激活可能是一个治疗post-PTCA血管再狭窄的治疗目标。在这项研究中,我们单链(ssDNA)寡核苷酸适配子筛选高亲和力和特异性avβ3蛋白使用指数富集配体的系统进化(SELEX),研究了影响和av的具体机制β3的增殖、迁移和细胞凋亡VSMCs。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

十Sprague-Dawley老鼠(specific-pathogen-free, 250 - 270克)是湖北省疾病控制中心提供的没有。211002300042744)。麻醉后,主动脉胸和主动脉ventralis提取,内膜和外膜被移除,维管组织的中间层是放在预冷磷酸盐洗去残留的血。组织切成1毫米³件和孵化T25烧瓶在37°C的大气中含有5%有限公司₂6小时2.5毫升的营养液含有97%平滑肌细胞培养基(美国ScienCell SMCM, 1101), 2%的胎牛血清(的边后卫),和1%的平滑肌细胞生长补充。媒介是每72小时更换一次。所有协议和程序都按照美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验室动物和动物保健和使用委员会批准,武汉Myhalic生物技术有限公司(hlk - 20180920 - 01)。

识别孤立VSMCs,提取细胞的形状进行了分析。这些细胞被染色α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)和平滑肌蛋白22α(SM22α),用荧光显微镜观察。

2.2。体外av的选择β3 ssDNA寡核苷酸适配子

根据以前报道的方法(16,17),我们建立了一个随机寡核苷酸库和选定的avβ3 ssDNA寡核苷酸适配子(从人类,无标号)体外。图书馆的随机寡核苷酸序列CCCGCTGTAACCTGAAA-N40-AGTTCCCAGTCAGCGAG和avβ3序列5′-CCCGCTGTAACCTGAAA-3′(向前)和5′-CTCGCTGACTGGGAACT-3′(反向)。双链DNA得到使用ssDNA作为模板通过对称聚合酶链反应(PCR)扩增,和获得的双链DNA作为模板,通过不对称PCR扩增获得ssDNA。PCR扩增反应体系如表所示1。PCR条件如下:变性在94°C 3分钟,其次是35周期在94°C的变性40年代,退火X°C (X代表53,53.8,55.3,57.6,60.3,62.6,64.1,30年代和65年),在72°C扩展45 s。PCR产品确定4%琼脂糖凝胶电泳。随后,每一轮的亲和力和特异性ssDNA被ELISA试验,直到确认绑定率和亲和力并没有显著增加。

合适的寡核苷酸适配子筛选从第12轮SELEX和转化大肠杆菌DH5α净化后菌株。质粒DNA分离出单个克隆、测序和分析。寡核苷酸适配子的二级结构进行了分析使用Dnaman 5.29软件(Lynnon Corp .)、魁北克、QC、加拿大)。

2.3。Co-Immunoprecipitation

样本收集,和适量的预冷细胞裂解缓冲了。30分钟后冰溶解,离心进行30分钟,1μ克的整合素avβ3抗体被添加到每个样本和孵化一夜之间在4°C。10毫升的蛋白琼脂糖珠洗了三次裂解缓冲和离心机3000 rpm三次3分钟。然后,蛋白琼脂糖珠与样品混合,在4°C培养4 h,离心机在3000转3分钟。浮在表面的丢弃,和琼脂糖珠洗3次,1毫升的热解缓冲区。最后,15μl (2 x添加十二烷基硫酸钠样品缓冲,并通过免疫印迹样品进行了分析。

2.4。转染的avβ3蛋白质

Avβ3蛋白转染根据谅解备忘录等的方法。18]。我们设计的引物β3,指人类整合蛋白的全长cDNA序列β3发布的基因库:P1, 5′-ATTATTCTACGGAC-GAGATGCGAGC-3′;P4 5′-GGGCTCGAGTTATA-CAGTGGG-TTGTT-3′。然后,他们被转染进pBluescript II SK(+)整合素β3(中国KALANG KL1892)质粒。此后,开放阅读框的β3单元放大pBluescript II SK(+)整合素β3质粒转染到真核表达载体pcDNA 3.1 / V5-His-TOPO(美国热费希尔K480001)构建pcDNA3.1 -β3向量。pcDNA3.1 -β3向量与pcDNA3-av然后cotransfected到VSMCs向量(美国Addgene 13032)根据指令Lipofectamine 2000工具包(美国英杰公司11668 - 027年)。VSMCs被随机分为六组:VSMC(没有治疗),VSMC +血小板源生长因子(PDGF) 4 ng / ml, VSMC + PDGF + avβ3 ssDNA 20μg / ml, VSMC + PDGF + avβ3 ssDNA 40μg / ml, VSMC + PDGF + avβ3 ssDNA 80μg / ml, VSMC + PDGF + cilengitide(积极的控制)。

2.5。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定

的扩散VSMCs使用MTT检测设备(PAB180013 Bioswamp)根据制造商的指示。我们收集细胞对数生长期,调整细胞浓度5×10³细胞/在一个96孔板,并增加了20倍μl (MTT每个解决方案。37°C的细胞被孵化有限公司5%₂孵化器一夜之间,和150年μl(二甲亚砜(D2650σ)添加到每个。光密度测量在490 nm标(Multiskan FC,热)。

2.6。Transwell化验

细胞培养的无血清SMCM实验前24小时和resuspended SMCM含有1%在1×10的边后卫⁵细胞/毫升。然后,细胞接种到Transwell钱伯斯和0.75毫升SMCM含有10%的边后卫24-well板被添加到低。细胞培养在5%的股份有限公司₂在37°C 48 h。然后,1毫升4%甲醛溶液添加到每个好,和细胞固定在室温下放置10分钟。与0.5%结晶紫染色后的解决方案(PAB180004 Bioswamp) 30分钟,细胞在显微镜下观察。

2.7。流式细胞术

细胞凋亡和细胞周期的进展VSMCs使用流式细胞仪分析了根据制造商的指示。细胞的内容在每个阶段的细胞周期和细胞凋亡的比例衡量,使用CytExpert软件和数据进行了分析。

2.8。免疫印迹

蛋白质从细胞中提取,其浓度测量使用bicinchoninic酸蛋白质分析工具包(Beyotime,中国)。总蛋白分离的8%或12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到聚偏二氟乙烯膜。使用以下主要抗体:骨桥蛋白(OPN, 1: 1000年,PB0589,博士德),粘着斑激酶(FAK 1: 500年,BM4303,博士德),p-FAK(1: 500年,BM4426博士德),Ras(1: 400年,BM4281博士德),增殖蛋白激酶(MAPK 1: 1000年,BM4439,博士德),p-MAPK(1: 2000年,P00176博士德)、磷脂酰肌醇3-kinase (BM5187 PI3K, 1: 1000年,博士德),p-PI3K(1: 1000年,ab182651 Abcam)和GAPDH(1: 1000年,PAB36264 Bioswamp)。与磷酸盐/渐变20三洗后,细胞膜与辣根peroxidase-conjugated二次孵化山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 20000年,PAB160011 Bioswamp)。蛋白质乐队被增强化学发光颜色可视化检测(TANON TANON - 5200)和分析使用AlphaEase FC凝胶图像分析软件。

2.9。定量逆转录聚合酶链反应(存在)

整个RNA从细胞中提取样本使用试剂盒试剂根据制造商的程序,并使用逆转录酶互补脱氧核糖核酸合成装备(美国豆类)。执行中存在使用一个实时系统(Bio-Rad)使用SYBR绿色PCR试剂盒(KM4101 KAPA生物系统公司)。每个反应是在重复执行,结果分析2^−△△Ct方法。引物的设计和配置由南京金丝利生物技术有限公司有限公司(表2)。

2.10。统计分析

所有数据提出了均值±标准差。SPSS 19.0软件被用于统计分析,和5.0 GraphPad棱镜用于准备数据。的数据进行评估统计学意义用单向方差分析。建立了统计学意义 。

3所示。结果

3.1。隔离的高亲和性avβ3蛋白质寡核苷酸适配子

在这项研究中,avβ3蛋白质被选为目标和一个随机ssDNA图书馆用作筛选配体。12轮筛选后,得到了不同的寡核苷酸适配子使用SELEX。如数据所示1(一)- - - - - -1 (c),对称PCR反应的最适退火温度是58°C。间接不对称PCR是可行的制备大量ssDNA,底漆稀释比例是100:1。然后我们决定av的结合率和亲和力β3 ssDNA avβ3蛋白质在每一轮ELISA。结果表明,在第11轮,ssDNA av绑定最高速率和亲和力β3(表3和4)。我们进一步对av进行免疫沉淀反应β3蛋白质,发现乐队出现在预期的位置,这证实了筛选(图的准确性2(一个))。

五个适配子个体克隆获得和测序,所有适配器的二级结构预测是使用DNAMAN 5.29软件(Lynnon corp .)(图2 (b))。二级结构的后续实验的适配器是图所示2 (c),剩下的四个适配器的二级结构是作为补充材料(可提供在这里)。结果表明,av的结合位点β3蛋白质可能位于茎环结构(数据的结束2 (b)和2 (c))。

3.2。隔离和VSMCs的识别

确定主要VSMCs,我们表明,附着VSMCs种植密度高,细胞被安排在一个轴或包的形状(图3(一个))。我们也评估主要VSMCs的纯度检测的绿色荧光αsma和SM22α使用荧光显微镜(200 x)。结果在图3 (b)和3 (c)表明,孤立的细胞VSMCs,可用于后续实验。

3.3。avβ3 ssDNA抑制VSMC增殖和迁移

PDGF的增加显著增加VSMCs扩散。与VSMC + PDGF组相比,细胞增殖与av VSMCs治疗β3 ssDNA降低浓度的方式(图4(一))。检测av的效果β3 ssDNA细胞迁移,我们进行了一次Transwell化验(图4 (b))。与VSMC + PDGF组相比,添加cilengitide或avβ3 ssDNA (20μ40 g / ml,μg / ml,或80年μg / ml)减少VSMC迁移,减少呈正相关,av的浓度β3 ssDNA。我们进一步研究了OPN和FAK的表达,与VSMC增殖和迁移。相对蛋白质(图4 (c)),信使rna(图4 (d)OPN的表达和p-FAK / FAK VSMCs接受PDGF和avβ3 ssDNA显著低于VSMC PDGF处理( )。

3.4。avβ3 ssDNA促进VSMC凋亡

流式细胞仪是用来检测av的效果β3 ssDNA VSMC凋亡。结果在图5(一个)和5 (b)透露,avβ3 ssDNA增加细胞凋亡的程度相比,在VSMCs PDGF处理( )。av的增加β3 ssDNA浓度、细胞凋亡逐渐增加。数据5 (c)和5 (d)表明,avβ3 ssDNA显著增加的比例和G2期细胞PDGF相比治疗。我们进一步测量了apoptosis-related蛋白质伯灵顿和活跃的半胱天冬酶3(图5 (e)av)和证明他们的内容β3组ssDNA远远高于VSMC + PDGF集团( )。

3.5。av的影响β3 ssDNA VSMCs Ras-PI3K / MAPK通路

av的影响进行调查β3 ssDNA VSMCs Ras-PI3K-MAPK信号,我们测量Ras的表情,p-MAPK, p-PI3K使用中存在和免疫印迹(数字6(一)和6 (b))。我们注意到,相比之下,VSMC + PDGF集团Ras的蛋白表达,p-MAPK / MAPK和p-PI3K / PI3K和Ras的mRNA表达,MAPK和PI3K显著减少了avβ3 ssDNA浓度( )。Avβ3 ssDNA在80μg / ml所有av中有最大的影响β3 ssDNA组。

4所示。讨论

研究表明,VSMCs的增殖和迁移是血管损伤的程度(直接成比例19]。因此,抑制增殖和迁移VSMCs PTCA后在再狭窄可能发挥治疗作用。整合蛋白是细胞粘附的一个重要组成部分,主要是调节细胞间粘附和双向信号转导和细胞外基质。整合素avβ3可以表达多种细胞和具有重要功能在细胞增殖、迁移,入侵,炎症、伤口愈合。研究表明,avβ3起着至关重要的作用在各种各样的疾病。例如,Camorani等人发现表皮生长因子receptor-integrin aptamer-mediated障碍αvβ3复杂抑制vasculogenic模仿和三阴性乳腺癌的增长20.]。苏等人发现avβ3促进成骨细胞的增殖和分化激活细胞外signal-regulated激酶(Erk)途径治疗骨质疏松症21]。此外,avβ3功能通过TGF心肌纤维化β信号通路,展示其在各种疾病的影响通过多种途径。伯爵等人观察到avβ3参与血管重建过程的监管和动脉粥样硬化的形成(22]。Sajid等人使用avβ3抑制剂干预8血管损伤的动物模型,发现抑制avβ3活动抑制VSMC增殖和迁移23]。我们之前的研究表明,Ras ssDNA寡核苷酸适配子抑制VSMC增殖和迁移通过MAPK和PI3K通路(10],Illario等人发现avβ3介导fibronectin-induced甲状腺细胞的增殖通过Ras / Raf Mek / Erk和Ca2 + / CaMKII信号(24]。这些结果共同表明抑制av的活动β3蛋白质可以降低VSMCs的增殖和迁移。

本研究的结果表明,av的效果β3 ssDNA VSMC增殖和迁移是直接与它的浓度成正比。在蛋白质影响细胞增殖和迁移25- - - - - -27],OPN是广泛分布于各种组织和细胞,促进细胞粘附通过绑定到多个整合素受体在细胞表面依靠RGD序列(αvβ1,αvβ3,αvβ5,αvβ1,α8β1)和独立RGD序列(α4β1,α9β1)。OPN可以促进破骨细胞等多种细胞的迁移成纤维细胞和平滑肌细胞28),粘附在血管的主要监管机构。张等人发现,小檗碱抑制钙化的VSMCs通过抑制OPN的表达(29日]。FAK是一个重要的成员integrin-mediated信号转导通路,影响细胞粘附、增殖和迁移。抑制FAK活动可以显著影响细胞增殖和促进细胞凋亡30.]。谢等人发现graphene-induced骨形成促进OPN的表达,FAK和其他蛋白质(31日]。我们进一步检测OPN的表达水平和p-FAK的变化,发现他们与av的增加表达下调β3 ssDNA浓度。流式细胞术显示,avβ3 ssDNA促进VSMC凋亡和阻塞的年代和G2期细胞周期。Kassab和哈桑观察到抑制细胞增殖抑制作用造成的FAK活动主要是反映在G2期细胞的比例的增加和减少,S期(30.]。在这个实验中,在年代和G2期细胞比例增加,这表明avβ通过多个目标3 ssDNA可能抑制细胞增殖。Ras-PI3K / MAPK信号通路中起着重要作用的增长,扩散和迁移VSMCs [10,32]。失活Ras-PI3K / MAPK信号可以抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的线粒体途径(33]。下游Ras-PI3K / MAPK信号通路介导的胰岛素受体(34]。研究表明,MAPKs激活胰岛素样生长因子受体细胞分化的关键调节因素。MAPK信号密切相关,细胞生长和增殖35]。陆等人表明nesfatin-1提升VSMCs的扩散和迁移增强PI3K / AKT的活动/ mTOR [36]。Vaspin抑制高glucose-induced增殖和迁移VSMCs诱导通过抑制MAPK和PI3K / AKT信号37]。Lv等人发现SM22α抑制lamellipodium形成和迁移通过Ras-Arp2/3信号合成VSMCs [38]。我们表明,avβ3 ssDNA显著降低Ras的表达,p-PI3K p-MAPK,表明avβ3 ssDNA可能发挥其抑制细胞增殖和迁移的影响函数Ras-PI3K-MAPK信号通路。

总之,我们的研究表明,avβ3 ssDNA减毒细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡的机制可能与Ras-PI3K / MAPK通路。因此,我们建议选择投票制β3 ssDNA可能是一个有效的代理post-PTCA再狭窄的治疗。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的科研项目的卫生和计划生育委员会湖北(WJ2017M020)。

补充材料

二级结构的其余四个适配器。(补充材料)