抗心律失常中药温心颗粒靶基因的鉴定

摘要

温心颗粒(WXKL)是经批准用于治疗心血管疾病的中药。本研究旨在鉴定与WXKL抗心律失常疗效相关的WXKL靶向基因。利用中药系统药理学(TCMSP)技术平台筛选WXKL及WXKL靶向心律失常相关基因的活性化合物。采用球囊扩张左冠状动脉内皮，建立猪心肌缺血模型。猪分为模型组和WXKL组(n = 6). MI, QT interval, heart rate, and arrhythmia were recorded, and the mRNA expression of target genes in myocardial tissues was detected by PCR. Eleven active ingredients of WXKL and eight WXKL-targeting arrhythmia-related genes were screened. Five pathways were enriched, and an “ingredient-gene-path” network was constructed. WXKL markedly decreased the incidence of arrhythmia in the MI pig model ( )．与模型组比较，WXKL组QT间期明显缩短，心率减慢( )．此外，钠通道蛋白5型亚基α (SCN5A)和-2肾上腺素能受体(ADRB2)下调，而毒蕈碱乙酰胆碱受体M2 (CHRM2）在WXKL组上上调（ )．综上所述，WXKL可通过下调QT间期而缩短心率SCN5A和ADRB2和上调CHRM2这些发现为WXKL降低室性心律失常发生率的分子机制提供了新的见解。

1.介绍

心外膜冠状动脉急性闭塞导致心肌缺血(MI)，心电图不稳定(ECG)活动迅速出现，通常引起致死性室性心律失常[1］.温心颗粒是国家食品药品监督管理局批准的首个抗心律失常药物。一项荟萃分析显示，WXKL在治疗心血管疾病(心绞痛、心力衰竭和心律失常)方面是有效的，尽管需要更多高质量的证据来支持其在临床环境中的应用[2］.与单用西药治疗相比，联合应用WXKL可降低心率，减少心律失常(室性早搏、室性心动过速、室颤)的发生，改善心功能[3.，4］.此外，WXKL显著降低心肌梗死后室性心律失常[5］.此外，最近的一项研究报道，WXKL可以缓解近期发生的心房颤动，在男性和女性患者的疗效无显著差异[6］.

TCMS是口服制剂，需要通过吸收，分布，新陈代谢和排泄（ADME）过程来达到靶器官和组织。Adme进程在口服生物利用度（OB）和药物相似性（DL）中起作用，TCMS的两种药代动力学特征[7］.OB是指口服后药物进入血液循环的相对量和速度。DL是指该化合物与已知上市药物的相似性。OB≥30%和DL≥0.18的化合物被认为是潜在的活性化合物，可供进一步分析[8］.中药系统药理学(TCM Systems Pharmacology, TCMSP)技术平台包含499种中药及其29000种化学成分，提供每个化合物的ADME特性数据，如血脑屏障通透性、OB和Caco-2细胞通透性，以及潜在活性分子的靶标(包括DrugBank数据库中的6511个药物分子和3987个与已知化合物相互作用的蛋白质)和相关疾病信息[9，10.］.可以从平台中检索WXK1的活性组分和与心律失常相关的目标。然而，WXK1对MI后的心脏电活性的影响及WXK1的作用机制仍不清楚。

本研究旨在探讨WXKL对心肌梗死后心律失常及心电活动的影响，并利用TCMSP鉴定与心律失常相关的WXKL靶向基因。我们进一步在MI动物模型中证实了wxkl靶向基因。

2.方法

2．1.WXKL活性成分及靶标的筛选

筛选以“药名”为搜索项，包括五种中药成分:甘松Batal,Codonopsis.，三七，Ambrum、黄精;OB设置为“大于或等于30%”;DL设置为“大于或等于0.18”。

２.２.KEGG富集分析及“成分-基因-路径”网络的构建

利用DAVID(注释、可视化和集成发现数据库;https://david.ncifcrf.gov/) v6.8。将靶基因直接映射到途径上，基因数量与途径富集的意义成正比，将药物靶基因富集途径视为药物调控途径。通过Cytoscape 3.0软件构建相应成分、基因、通路网络图。

2.3。实验动物

所有动物手术均按照广东药科大学(中国广州)动物护理与使用委员会批准的方案进行。雄性小型猪(20 ~ 25 kg)由广东省医学实验动物中心提供，随机分为2组(n= 6):模型组和WXKL组。WXKL组术前给药3周，均购自山东步昌制药(8 g/kg, 1次/ d，混合在饲料中)。心肌梗死模型中，右颈总动脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，介入扩张左冠状动脉前降支(LAD)。然后,6F（1F = 0.33 mm) artery sheath tubes (Terumo Corporation, Japan) were introduced by guide wires through the iliac artery and placed in the left coronary artery under the C-arm X-ray machine (Artis zee III ceiling, Siemens, Germany). The balloon (Cordis; balloon : tube diameter = 1.3 : 1) entered the middle of the LAD via the guide wire and was inflated for 303.975 kPa for 30 s, repeated 3 times. The ECG monitor (Ruike Biotech, China) was used to continuously monitor the intraoperative and the postoperative electrocardiogram. The duration of QT, ST-T segment change, T-wave voltage, heart rate, and incidence of arrhythmia were recorded.

2.4。定量聚合酶链反应

处死猪，除去心肌组织并在液氮中迅速冷冻并储存在-70℃。使用Trizol试剂（Invitrogen）从组织中提取总RNA。使用RT试剂盒（DBI，USA）从RNA合成cDNA，使用PCR试剂盒（Genecopoopoeia，USA）和以下引物进行PCR：SCN5A GGATTGTAGCTCCTCTCTC和GGAAGGCATCACTCTTCTAC;kcnh2 gagatcgcattctaccggaaag和cttctccatcaccacactcaaag;CHRM2 GCCTGCTATGCACTTTGTAATG和TCCTCTTGACTACCTTCCTTCT;ADRB2 CTCTTCCATCGTGTCCTTCTAC和CCTCAGACTTGTCGATCTTTG;ADRB1 TCCGTCGTCTCCTTCTATGT和CGCAGCTGTCGATCTTCTT;Adra1d gcagacggtcaccaactatt和acctctagtggcagagaa;而GAPDH CAGGTTGTGTCCTGTGACTT和TTGACGAAGTGGTCGTTGAG。将靶基因的表达水平标准化为GAPDH并使用2-ΔΔCT方法计算。

2．5．统计分析

统计分析使用SPSS 21.0软件进行。曼 - 惠特尼U所有数据分析均采用检验。统计学意义定义为 ．

3.结果

3.1。WXKL活性成分的心律失常相关靶基因

基于OB和DL WXKL十一有效成份的提取。有关心律失常甲总共八个WXKL靶基因从检索TCMSP，包括钠通道蛋白5型亚基α（SCN5A），钾电压 - 门控通道亚家族H ^构件2（KCNH2)、β -1肾上腺素能受体(ADRB1)、-2肾上腺素能受体(ADRB2），α-1d肾上腺素能受体（ADRA1D)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M2 (CHRM2)、α - 2a肾上腺素能受体(ADRA2A)和缝隙连接α -1蛋白(GJA1)(表1)．

３．２．I-G-P网络构建与分析

基于I-G-P网络建设，我们在WXK1，八个靶标和六种富含KEGG途径的11个活性化合物中建立了相互作用。ADRB2和SCN5A是最成分的目标，和钙信号传导途径，神经活性配体 - 受体相互作用，在心肌细胞肾上腺素能信号传导，和cGMP-PKG信号通路是可介导WXKL的抗心律失常作用的最重要的信号传导途径（图1)．

3.3。WXKL电生理和抗心律失常作用

冠脉球囊扩张后出现st段异常(不同水平的t波低、倒转、st段抬高)，球囊扩张后3-6分钟猪均出现室性心动过速，扩张后5-7分钟猪均出现室颤。两组患者术后心率均明显升高 ),但与模型组相比，WXKL组中的心率明显较大（ )．手术前后QT间期差异无统计学意义，但模型组QT间期明显长于WXKL组( ）（桌子2)．WXKL组与模型组比较，心功能不全发生率显著降低( ）（桌子3.)．这些数据表明WXKL的抗心律失常作用。

3.4。WXKL调节心肌组织中靶标的表达

最后，我们选择了6个目标，并在动物模型中的心肌组织审查了它们的表达WXKL的影响。PCR分析表明，SCN5A和ADRB2mRNA水平显著较低，CHRM2WXKL组的mRNA水平明显高于模型组，KCNH2和ADRA1D表达比较，两组间无显著差异，而ADRB1两组均未表达(图2)．

4.讨论

ADRB1，ADRB2，ADRA1D， 和ADRA2A是g蛋白偶联的跨膜受体，通过结合儿茶酚胺、肾上腺素和去甲肾上腺素等神经递质介导交感神经系统活动[11.，12.］.CHRM2与乙酰胆碱结合，介导副交感神经系统的活性。心脏自主神经可以通过改变电生理特征直接或间接诱导或促进心律失常[13.，14.］.一个大的回顾性研究表明，β阻断剂和ACE抑制剂的患者改进的辅助存活相关入院存活室性心律失常[15.］.KCNH2介导延迟整流钾电流(IKr)的快速激活，这对正常的心室复极很重要[16.］.SCN5A编码电压门控钠通道1.5 (Nav1.5)，该通道介导向内钠电流(INa)并诱导快速去极化。SCN5A突变可损害Nav1.5的功能并诱发多种心律失常[17.］.心肌细胞间隙结是动作电位在心肌组织中扩散的结构基础，并在细胞电耦合和动作传输中起重要作用[18.］.心室肌细胞的主要差距交界处GJA1（连接蛋白43)．心脏病理状况影响缝隙连接的表达、易位和分布，干扰心肌细胞间的通讯，增加心脏电位去耦率，诱发心律失常[19.］.Wen等报道WXKL通过上调表达抑制心肌缺血-再灌注引起的室性心律失常连接蛋白43［5］.

QT间期代表心室的去极化和复极化时间，QT间期的延长对于恶性心律失常和心源性猝死很重要[20.］.在动物模型中，WXKL是预防心肌梗死后潜在致命性心律失常的有效替代[21.］.在本研究中，ECG显示WXKL可显著缩短QT间期，降低MI后心率，降低心律失常发生率，与近期综述的结果一致[22.］.

一项早期研究报道，WXKL通过选择性抑制钠电流发挥抗心律失常作用[23.］.SCN5A长QT综合征患者基因突变使钠通道关闭延迟，心肌细胞电位升高，动作电位2期平台延长，导致QT间期延长[24.］.这些结果提示WXKL可能导致表达下调SCN5A以及抑制钠向内流。

肾上腺素作用于心肌复极散度可能增加β2受体，引发心律失常[25.］.的使用β2受体拮抗剂显著降低心室颤动的发生率[26.］.与这些结果一致的是，在本研究中，我们发现WXKL选择性地降低了β2受体，其中WXK1可以通过下调MI后的心律失常发生率β2受体。激活或过度表达β2受体刺激l -钙通道，导致l -型钙显著增加²⁺电流。在冠状动脉闭塞后的几分钟内，静息时心电电位的持续时间和幅度开始下降。这是由于缺血引起的内向钠电流减少，同时内向钙电流升高，导致QT间期起初延长，最终缩短。此外，缺血区域和非缺血区域之间的一些“边界区域”会产生不同的不应期区域，再加上(由缺血引起的)酸中毒、“缝隙连接”损伤和传导受损，可能导致再进入回路，实际上，可能是缺血性心脏病最常见的临床相关心律失常的原因。确实，Wang等人发现WXKL可通过抑制l -钙电流和瞬时外向钾电流来减弱心肌缺血引起的心律失常[27.］.此外，QT间隔可通过抑制L-钙电流的影响[28.］.我们推测，在心肌缺血后，WXKL可能通过下调l型钙通道的表达来抑制l型钙通道β2受体，进而参与QT间期的调节。

心肌缺血时及时纠正心动过速对预防心律失常很重要，阻断乙酰胆碱M受体会导致心率加快[29.］.CHRM2参与心率的调节[30.］.我们的结果表明，WXK1显着增加了CHRM2的mRNA表达，表明WXK1通过上调CHRM2可以减缓心率。

综上所述，网络图显示，SCN5A和ADRB2是WXKL最有效成分的主要靶点，这与SCN5A和ADRB2在心功能调节中的重要作用是一致的。综上所述，我们筛选了WXKL活性成分通过TCMSP参与心律失常调节的潜在靶点，证实WXKL通过下调QT间期缩短、心率减慢SCN5A和ADRB2和上调CHRM2在mi期间。这些发现提供了对影响心脏电激活的WXK1潜在分子机制的新颖洞察。实际上还需要进一步调查，更好地定义WXK1在不同离子通道中的缺血引起的变化中的作用。

数据可用性

用于支持本研究结果的所有数据都可以根据要求提供相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

ZZ设计了实验。YY、TL、YL、RC、RZ进行了实验并分析了数据。所有作者阅读并批准了手稿。

致谢

广东省科技计划项目(No. 20140212);广东省中医药管理局项目(No. 20191203);广东省教育创新计划项目(No. 2017QTLXXM28);广东省教育厅(No. 2018JD028)和广东省教育厅(No. 2019KCXTD018)。

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