Isoliquiritigenin抑制动脉粥样硬化通过阻断TRPC5通道表达

文摘

Isoliquiritigenin (ISL)是一种从甘草黄酮类孤立的主要植物,传统的中药。ISL表明抗癌,抗炎,抗氧化,抗糖尿病的活动。然而,制药ISL对动脉粥样硬化的影响很少探讨。在这项研究中,我们使用载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠模型和血管紧张素ⅱ- (Angⅱ)刺激血管平滑肌细胞(VSMCs)阐明ISL抑制动脉粥样硬化的药理机制。我们发现,在载脂蛋白e^−−/老鼠ISL可以减弱动脉粥样硬化病变,减少血清脂质水平,抑制TRPC5表达式。体外,ISL抑制Ang II-stimulated VSMCs扩散和抑制Ang II-induced TRPC5和PCNA表达剂量依赖性的方式。总之,我们的研究结果提供了新颖的见解ISL的药理作用,对动脉粥样硬化和表明ISL有益于心血管保护。

1。介绍

Isoliquiritigenin (ISL)是一种黄酮类化合物甘草glabra,中国传统的甘草植物草本[1]。研究表明,isoliquiritigenin有各种各样的活动,如抗癌(2),抗菌3),杀毒软件(4],antiasthma [5,抗炎6,抗糖尿病的7),和抗氧化活动(8]。此外,ISL可以减少低密度脂质(低密度脂蛋白)通过抗氧化活性9]。此外,ISL已表现出抑制增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡10- - - - - -13]。

血管平滑肌细胞(VSMCs)发挥重要作用维持血管张力和中模的基本生理功能。在动脉粥样硬化的发展,VSMCs肉瘤可以变换后表型intimae伤害和增加了增殖和迁移的能力14]。的表型变化VSMCs参与动脉粥样硬化斑块形成和加速的过程(15]。然而,ISL能否抑制扩散VSMCs仍然是模糊的。

作为一种重要的第二信使,Ca^{2 +}是由不同类型的Ca^{2 +}渠道和膜转运蛋白的VSMCs。其中,门店渠道(soc)可以激活早期反应基因的转录和影响扩散,迁移,和过度的细胞外基质的合成16]。瞬时受体电位规范5 (TRPC5)通道是soc的代表主要由IP VSMCs本地化和被激活₃(肌醇1 4 5-trisphosphate)诱导缓慢而连续钙流入(17]。有趣的是,最近的一项研究报道,ISL诱导血管舒张通过激活Ca^{2 +}激活K⁺渠道VSMCs [18]。因此,我们假设ISL可能调节TRPC5通道调整VSMCs扩散。在这项研究中,我们使用了载脂蛋白E(ApoE)模型和血管紧张素ⅱ- (Angⅱ)诱导VSMCs模型来阐明ISL抑制动脉粥样硬化的药理机制。

2。材料和方法

2.1。动物模型

所有动物实验动物保健和使用委员会批准滨州医科大学。C57BL / 6 j小鼠和载脂蛋白e基因敲除小鼠C57BL(男,6)购自北京大学实验动物中心(中国,北京)。老鼠培育和维护在屏障设施在24°C-26°C 12 h光/ 12 h暗周期。所有小鼠治疗后,中国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验动物。ApoE^−−/小鼠随机分为两组(n= 20):模型组和ISL组,再辅以常规食物饮食脂肪(21% + 0.15%胆固醇)。ISL组小鼠灌洗和ISL(20毫克/公斤/天)。C57BL / 6 j小鼠被选择为对照组(n= 20)被喂以普通食物。所有的老鼠被安乐死后12周。

2.2。试剂

ISL (MB2209,大连,中国)购买从甜瓜和溶解在二甲亚砜(DMSO)股票0.25 mol / l的解决方案。然后,最后是稀释浓度培养基,最后DMSO浓度< 0.1% (v / v),以避免其毒性作用细胞的生长。主要抗体TRPC5 MOMA-2来自Abcam,αsma抗体从bios(中国)、增殖细胞核抗原(PCNA)抗体亲和力,并从Epitomics GAPDH抗体。

2.3。血脂分析

retro-orbital丛方法被用来获得血液样本。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)通过使用商业酶测定方法与工具RX-30设备上(日本Denshi、东京、日本)。

2.4。组织学和形态学分析

主动脉根部被收集并存储在−80°C。样本切成25节(10μ米厚)。的部分都沾染了hematoxylin-eosin,斑块面积(PA),腔的区域(LA)和纠正斑块面积的百分比(PA / LA)测量使用Image-Pro +软件。此外,部分受到免疫组织化学(包含IHC)染色TRPC5和综合选择密度(IOD) TRPC5染色测定使用Image-Pro +软件。

2.5。细胞培养

VSMCs被隔绝C57BL / 6 j小鼠胸主动脉描述(Rodriguez et al ., 2007)。在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM) /高葡萄糖(美国HyClone)补充20%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)在潮湿的气氛中有5%的公司₂在37°C。VSMCs的特点是α肌动蛋白免疫细胞化学分析(bios,北京)。从第4 - 9代细胞用于实验。VSMCs被分成5组:对照组(2%的边后卫处理),Angⅱ10⁻⁶mol / l组(治疗与血管紧张素ⅱ在10⁻⁶10 mol / l), Angⅱ⁻⁶摩尔/l+ 10μ10 mol / l ISL集团和二世⁻⁶摩尔/l+ 20μ10 mol / l ISL集团和二世⁻⁶摩尔/l+ 40μmol / l ISL组和Angⅱ10⁻⁶摩尔/l+ 60μmol / l ISL组。

2.6。细胞增殖实验

VSMCs被播种在2000个细胞/一夜之间在96孔板。治疗后,细胞孵育10µl /毫升CCK8 4 h,然后使用一个读者在450 nm测定吸光度。

2.7。聚合酶链反应

从主动脉使用试剂盒提取的总RNA。实时PCR进行使用SYBR绿色Rotor-Gene 3000 StepOnePlus运行^™实时PCR系统(澳大利亚Corbett)。引物序列如下:TRPC5,向前5′-ACAAAAAGGTCAACTACTCACCG-3′,反向5′-CAGTGGCATAGTCCCCCTTCT-3′;GAPDH,向前5′-AACTGCTTAGCACCCCTGGC-3′,反向5′-ATGACCTTGCCCACACAGCCTT-3′。使用ΔΔCt方法和定量测量测定GAPDH是作为内部控制。

2.8。免疫印迹分析

蛋白质提取和40μg从每车道溶解产物加载10% SDS-polyacrylamide电泳凝胶电泳和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜被涂抹与特定的抗体TRPC5, PCNA, GAPDH一夜之间在4°C,然后用辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体1 h。免疫反应性通过使用增强化学发光检测(ECL)方法。蛋白质含量由微使用软件进行计算。

2.9。统计分析

所有数据提出了平均数±标准差和通过SPSS 13.0软件进行分析。组间比较,单向方差分析应用,其次是LSD检验。被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。ISL ApoE的健康状况改善^−−/老鼠

对照组的一般条件是最好的在所有的老鼠。ApoE^−−/小鼠作为模型组显示最低的增长和体重增加速度(数据1(一)和1 (b))。与模型组相比,载脂蛋白e^−−/老鼠在ISL组最好的身体质量指数(BMI)在(图12 - 18周1 (c), )。

3.2。ISL改善血脂和载脂蛋白e动脉粥样硬化病变^−−/老鼠

他染色表明,动脉粥样硬化模型组不稳定斑块扩散所有的主动脉腔,但他们改善ISL组(图2(一个))。血清TC、TG、低密度最高,而高密度脂蛋白胆固醇是动脉粥样硬化模型组的最低水平。TC、TG和低密度脂蛋白胆固醇水平明显下降,高密度脂蛋白胆固醇水平增加ISL组与模型组相比(图2 (b))。模型组的主动脉内膜增厚,斑块形成,管腔狭窄,更多的脂质池,微薄的斑块纤维帽内观察模型组。相比之下,这些病变轻微,斑块区域小,脂质池是薄,和更少的泡沫细胞和炎症细胞被发现在ISL集团和斑块面积减少(数字2 (c)- - - - - -2 (e))。

3.3。ISL抑制TRPC5表达在动脉粥样硬化小鼠模型

免疫组织化学分析表明,TRPC5坐落在中模和VSMCs迁移到动脉内膜(数字3(一个)和3 (b))。TRPC5染色明显更强在模型组与对照组相比明显弱ISL组相比,模型组(图3 (c))。PCR分析证实,相对TRPC5 mRNA水平明显高于模型组与对照组相比,但显著降低ISL组相比,模型组(图3 (d))。

3.4。ISL抑制Ang II-Induced VSMCs扩散

我们孤立VSMCs C57BL / 6 j小鼠主动脉和免疫细胞化学识别VSMCs(图确认4(一))。CCK8试验表明,VSMCs扩散激活血管紧张素ⅱ。然而,Ang II-stimulated VSMCs扩散浓度的方式被ISL抑制(图4 (b))。

3.5。ISL抑制TRPC5和PCNA表达Ang II-Stimulated VSMCs

实时PCR表明Angⅱ明显诱导VSMCs TRPC5 mRNA的表达,但ISL减少Ang II-stimulated TRPC5 mRNA表达(图5(一个))。免疫印迹分析表明,Angⅱ明显诱导VSMCs TRPC5蛋白质的表达,但ISL减少Ang II-stimulated TRPC5蛋白表达(数字5 (b)和5 (c))。此外,Angⅱ明显诱导VSMCs PCNA蛋白的表达,但ISL减少Ang II-stimulated PCNA蛋白表达(图5 (d))。

4所示。讨论

甘草glabra(甘草)是一种传统草药广泛应用与许多药物效应(19]。ISL是这种植物的黄酮类化合物分离和有各种各样的活动20.]。然而,配药学的ISL对动脉粥样硬化的影响没有被探索。因此,在这项研究中,我们选择的载脂蛋白e基因敲除小鼠作为动脉粥样硬化模型探讨anti-atherosclerosis ISL的影响。

在目前的研究中,我们发现ISL可以调节血脂的载脂蛋白e^−−/老鼠。先前的研究表明,甘草黄酮石油可以调节脂质代谢相关基因的表达来改善C57BL / 6 j小鼠高脂血症(21]。我们的研究结果表明,ISL显著提高ApoE的重量和血脂^−−/与高脂肪饮食的老鼠。此外,ISL可以抑制TRPC5表达式不仅在高脂肪食源性动脉粥样硬化模型,还在初级VSMCs刺激血管紧张素ⅱ。

众所周知,表型的变化(VSMCs促进动脉粥样硬化的形成22,23]。增殖和迁移VSMCs为动脉粥样硬化斑块形成和发展至关重要。TRPC5是主要的亚型门店渠道可以激活在主动脉和肌醇1,4,5-triphosphate (IP3),导致连续钙流入(17]。TRPC5可以调节的功能VSMCs [24,25]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),加速动脉粥样硬化的风险因素,发现促进VSMCs扩散和迁移,TRPC5渠道是敏感的抗氧化剂(26]。在载脂蛋白e^−−/老鼠,血液脂质沉积在动脉内膜增加ox-LDL刺激TRPC5超表达。体外、血管紧张素ⅱ诱导VSMCs扩散和内部Ca^{2 +}可以直接刺激TRPC5频道(27]。在我们目前的研究中,我们发现ISL显著下调TRPC5和PCNA表达剂量依赖性的方式。因此,我们推测,ISL可能抑制VSMCs扩散通过下调TRPC5。然而,我们的研究有一定的局限性,我们没有进一步研究信号通路可能是负责协调对言论TRPC5 ISL的抑制效应。

有趣的是,据报道,ISL可以抑制NF -κB和增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路28]。已经证实,NF -的激活κB和MAPK途径加速动脉粥样硬化进程和促进VSMCs增殖和迁移29日]。氧化应激和钙流入也会影响TRPC5表达式。因此,还需要进一步的研究来揭示ISL的机制调节TRPC5表达和抑制动脉粥样硬化。

总之,我们证明ISL抑制TRPC5超表达不仅在高脂肪食源性动脉粥样硬化小鼠模型还在初级VSMCs刺激血管紧张素ⅱ。此外,ISL改善动脉粥样硬化小鼠模型和抑制主要VSMCs扩散。这些发现提供了新颖的见解ISL的药理作用,对动脉粥样硬化和表明ISL有益于心血管保护。

数据可用性

所有数据都可以要求从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

杰齐,崔建国的贡献同样这项工作。

确认

本研究得到了国家自然科学基金(没有。81401625)和初始滨州医科大学(BY2009KYQD05)的基础。

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