1。介绍
Isoliquiritigenin (ISL)是一种黄酮类化合物
甘草glabra,中国传统的甘草植物草本[
1]。研究表明,isoliquiritigenin有各种各样的活动,如抗癌(
2),抗菌
3),杀毒软件(
4],antiasthma [
5,抗炎
6,抗糖尿病的
7),和抗氧化活动(
8]。此外,ISL可以减少低密度脂质(低密度脂蛋白)通过抗氧化活性
9]。此外,ISL已表现出抑制增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡
10- - - - - -
13]。
血管平滑肌细胞(VSMCs)发挥重要作用维持血管张力和中模的基本生理功能。在动脉粥样硬化的发展,VSMCs肉瘤可以变换后表型intimae伤害和增加了增殖和迁移的能力
14]。的表型变化VSMCs参与动脉粥样硬化斑块形成和加速的过程(
15]。然而,ISL能否抑制扩散VSMCs仍然是模糊的。
作为一种重要的第二信使,Ca2 +是由不同类型的Ca2 +渠道和膜转运蛋白的VSMCs。其中,门店渠道(soc)可以激活早期反应基因的转录和影响扩散,迁移,和过度的细胞外基质的合成
16]。瞬时受体电位规范5 (TRPC5)通道是soc的代表主要由IP VSMCs本地化和被激活3(肌醇1 4 5-trisphosphate)诱导缓慢而连续钙流入(
17]。有趣的是,最近的一项研究报道,ISL诱导血管舒张通过激活Ca2 +激活K+渠道VSMCs [
18]。因此,我们假设ISL可能调节TRPC5通道调整VSMCs扩散。在这项研究中,我们使用了载脂蛋白
E(ApoE)模型和血管紧张素ⅱ- (Angⅱ)诱导VSMCs模型来阐明ISL抑制动脉粥样硬化的药理机制。
2。材料和方法
2.1。动物模型
所有动物实验动物保健和使用委员会批准滨州医科大学。C57BL / 6 j小鼠和载脂蛋白e基因敲除小鼠C57BL(男,6)购自北京大学实验动物中心(中国,北京)。老鼠培育和维护在屏障设施在24°C-26°C 12 h光/ 12 h暗周期。所有小鼠治疗后,中国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验动物。ApoE−−/小鼠随机分为两组(
n= 20):模型组和ISL组,再辅以常规食物饮食脂肪(21% + 0.15%胆固醇)。ISL组小鼠灌洗和ISL(20毫克/公斤/天)。C57BL / 6 j小鼠被选择为对照组(
n= 20)被喂以普通食物。所有的老鼠被安乐死后12周。
2.2。试剂
ISL (MB2209,大连,中国)购买从甜瓜和溶解在二甲亚砜(DMSO)股票0.25 mol / l的解决方案。然后,最后是稀释浓度培养基,最后DMSO浓度< 0.1% (v / v),以避免其毒性作用细胞的生长。主要抗体TRPC5 MOMA-2来自Abcam,
αsma抗体从bios(中国)、增殖细胞核抗原(PCNA)抗体亲和力,并从Epitomics GAPDH抗体。
2.3。血脂分析
retro-orbital丛方法被用来获得血液样本。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)通过使用商业酶测定方法与工具RX-30设备上(日本Denshi、东京、日本)。
2.4。组织学和形态学分析
主动脉根部被收集并存储在−80°C。样本切成25节(10
μ米厚)。的部分都沾染了hematoxylin-eosin,斑块面积(PA),腔的区域(LA)和纠正斑块面积的百分比(PA / LA)测量使用Image-Pro +软件。此外,部分受到免疫组织化学(包含IHC)染色TRPC5和综合选择密度(IOD) TRPC5染色测定使用Image-Pro +软件。
2.5。细胞培养
VSMCs被隔绝C57BL / 6 j小鼠胸主动脉描述(Rodriguez et al ., 2007)。在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM) /高葡萄糖(美国HyClone)补充20%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)在潮湿的气氛中有5%的公司2在37°C。VSMCs的特点是
α肌动蛋白免疫细胞化学分析(bios,北京)。从第4 - 9代细胞用于实验。VSMCs被分成5组:对照组(2%的边后卫处理),Angⅱ10−6mol / l组(治疗与血管紧张素ⅱ在10−610 mol / l), Angⅱ−6摩尔/
l+ 10
μ10 mol / l ISL集团和二世−6摩尔/
l+ 20
μ10 mol / l ISL集团和二世−6摩尔/
l+ 40
μmol / l ISL组和Angⅱ10−6摩尔/
l+ 60
μmol / l ISL组。
2.6。细胞增殖实验
VSMCs被播种在2000个细胞/一夜之间在96孔板。治疗后,细胞孵育10
µl /毫升CCK8 4 h,然后使用一个读者在450 nm测定吸光度。
2.7。聚合酶链反应
从主动脉使用试剂盒提取的总RNA。实时PCR进行使用SYBR绿色Rotor-Gene 3000 StepOnePlus运行™实时PCR系统(澳大利亚Corbett)。引物序列如下:TRPC5,向前5′-ACAAAAAGGTCAACTACTCACCG-3′,反向5′-CAGTGGCATAGTCCCCCTTCT-3′;GAPDH,向前5′-AACTGCTTAGCACCCCTGGC-3′,反向5′-ATGACCTTGCCCACACAGCCTT-3′。使用ΔΔCt方法和定量测量测定GAPDH是作为内部控制。
2.8。免疫印迹分析
蛋白质提取和40
μg从每车道溶解产物加载10% SDS-polyacrylamide电泳凝胶电泳和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜被涂抹与特定的抗体TRPC5, PCNA, GAPDH一夜之间在4°C,然后用辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体1 h。免疫反应性通过使用增强化学发光检测(ECL)方法。蛋白质含量由微使用软件进行计算。
2.9。统计分析
所有数据提出了平均数±标准差和通过SPSS 13.0软件进行分析。组间比较,单向方差分析应用,其次是LSD检验。
P
<
0.05
被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。ISL的健康状况改善的载脂蛋白e <一口>−/−< /一口>老鼠
对照组的一般条件是最好的在所有的老鼠。ApoE−−/小鼠作为模型组显示最低的增长和体重增加速度(数据
1(一)和
1 (b))。与模型组相比,载脂蛋白e−−/老鼠在ISL组最好的身体质量指数(BMI)在(图12 - 18周
1 (c),
P
<
0.05
)。
小鼠的体重和长度和身体质量指数在三组(
n= 20)。(一)不同年龄不同组小鼠的体重。(b)体长在不同年龄的不同组的老鼠。(c)身体质量指数(BMI)在不同年龄的不同组的老鼠。控制:控制小组;:动脉粥样硬化组;ISL: isoliquiritigenin组。
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P
<
0.05
相比,12岁,14日,16日和18周。
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3.2。ISL改善血脂与动脉粥样硬化病变的载脂蛋白e <一口>−−/ < /一口>老鼠
他染色表明,动脉粥样硬化模型组不稳定斑块扩散所有的主动脉腔,但他们改善ISL组(图
2(一个))。血清TC、TG、低密度最高,而高密度脂蛋白胆固醇是动脉粥样硬化模型组的最低水平。TC、TG和低密度脂蛋白胆固醇水平明显下降,高密度脂蛋白胆固醇水平增加ISL组与模型组相比(图
2 (b))。模型组的主动脉内膜增厚,斑块形成,管腔狭窄,更多的脂质池,微薄的斑块纤维帽内观察模型组。相比之下,这些病变轻微,斑块区域小,脂质池是薄,和更少的泡沫细胞和炎症细胞被发现在ISL集团和斑块面积减少(数字
2 (c)- - - - - -
2 (e))。
动脉粥样硬化病变的组织学和形态学分析(
n= 20)。(一)他染色主动脉组织(×40)。没有明显的主动脉病变在对照组观察。组显示不稳定斑块扩散所有的主动脉腔,但他们改善ISL组。(b)的血脂水平在不同的团体(单位为毫米)。(c)腔的面积的比较(洛杉矶,单位为毫米2)和ISL团体。(d)斑块面积的比较(PA,单位为毫米2)和ISL团体。(e)的比率比较PA / LA和ISL团体。
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0.01
,
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0.001
与对照组相比,
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0.01
相比,集团。控制:控制小组;:动脉粥样硬化组;ISL: isoliquiritigenin组。
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3.3。ISL抑制TRPC5表达在动脉粥样硬化小鼠模型
免疫组织化学分析表明,TRPC5坐落在中模和VSMCs迁移到动脉内膜(数字
3(一个)和
3 (b))。TRPC5染色明显更强在模型组与对照组相比明显弱ISL组相比,模型组(图
3 (c))。PCR分析证实,相对TRPC5 mRNA水平明显高于模型组与对照组相比,但显著降低ISL组相比,模型组(图
3 (d))。
在三组小鼠TRPC5表达式。(一)TRPC5染色在每组主动脉(×40)。染色区域箭头所示。每组(b) TRPC5染色的主动脉(×400)。染色区域箭头所示。(c)的比较TRPC5染色强度在不同的组。(d)的比较TRPC5 mRNA水平在不同的组。
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∗
P
<
0.01
与对照组相比,
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P
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0.01
相比,集团。控制:控制小组;:动脉粥样硬化组;ISL: isoliquiritigenin组。
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3.4。ISL抑制Ang II-Induced VSMCs扩散
我们孤立VSMCs C57BL / 6 j小鼠主动脉和免疫细胞化学识别VSMCs(图确认
4(一))。CCK8试验表明,VSMCs扩散激活血管紧张素ⅱ。然而,Ang II-stimulated VSMCs扩散浓度的方式被ISL抑制(图
4 (b))。
ISL抑制VSMCs扩散。(一)识别VSMCs隔绝C57BL / 6 j小鼠主动脉(染色×400)。(b) CCK8 VSMCs扩散的分析。值表示为意味着±SD (
n= 5)。控制:控制小组;Angⅱ:Angⅱ组;10 isl: Angⅱ10−6摩尔/
l+ 10
μmol / l ISL组;20 isl: Angⅱ10−6摩尔/
l+ 20
μmol / l ISL组;40 isl: Angⅱ10−6摩尔/
l+ 40
μmol / l ISL组;60 isl: Angⅱ10−6摩尔/
l+ 60
μmol / l ISL组。
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3.5。ISL抑制TRPC5和PCNA表达Ang II-Stimulated VSMCs
实时PCR表明Angⅱ明显诱导VSMCs TRPC5 mRNA的表达,但ISL减少Ang II-stimulated TRPC5 mRNA表达(图
5(一个))。免疫印迹分析表明,Angⅱ明显诱导VSMCs TRPC5蛋白质的表达,但ISL减少Ang II-stimulated TRPC5蛋白表达(数字
5 (b)和
5 (c))。此外,Angⅱ明显诱导VSMCs PCNA蛋白的表达,但ISL减少Ang II-stimulated PCNA蛋白表达(图
5 (d))。
在VSMCs ISL抑制TRPC5和PCNA的表达。(a)的mRNA水平TRPC5在不同的组。(b) TRPC5和PCNA的蛋白质含量测定免疫印迹分析。GAPDH是加载控制。代表图像显示从5独立执行测试。(c)微密度分析TRPC5蛋白表达。(d)微PCNA蛋白表达分析。值表示为意味着±SD (
n= 5)。
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∗
P
<
0.01
与对照组相比,
#
#
P
<
0.01
相比,Angⅱ组。控制:控制小组;Angⅱ:Angⅱ组;10 isl: Angⅱ10−6摩尔/
l+ 10
μmol / l ISL组;20 isl: Angⅱ10−6摩尔/
l+ 20
μmol / l ISL组;40 isl: Angⅱ10−6摩尔/
l+ 40
μmol / l ISL组;60 isl: Angⅱ10−6摩尔/
l+ 60
μmol / l ISL组。
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4所示。讨论
甘草glabra(甘草)是一种传统草药广泛应用与许多药物效应(
19]。ISL是这种植物的黄酮类化合物分离和有各种各样的活动
20.]。然而,配药学的ISL对动脉粥样硬化的影响没有被探索。因此,在这项研究中,我们选择的载脂蛋白e基因敲除小鼠作为动脉粥样硬化模型探讨anti-atherosclerosis ISL的影响。
在目前的研究中,我们发现ISL可以调节血脂的载脂蛋白e−−/老鼠。先前的研究表明,甘草黄酮石油可以调节脂质代谢相关基因的表达来改善C57BL / 6 j小鼠高脂血症(
21]。我们的研究结果表明,ISL显著提高ApoE的重量和血脂−−/与高脂肪饮食的老鼠。此外,ISL可以抑制TRPC5表达式不仅在高脂肪食源性动脉粥样硬化模型,还在初级VSMCs刺激血管紧张素ⅱ。
众所周知,表型的变化(VSMCs促进动脉粥样硬化的形成
22,
23]。增殖和迁移VSMCs为动脉粥样硬化斑块形成和发展至关重要。TRPC5是主要的亚型门店渠道可以激活在主动脉和肌醇1,4,5-triphosphate (IP3),导致连续钙流入(
17]。TRPC5可以调节的功能VSMCs [
24,
25]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),加速动脉粥样硬化的风险因素,发现促进VSMCs扩散和迁移,TRPC5渠道是敏感的抗氧化剂(
26]。在载脂蛋白e−−/老鼠,血液脂质沉积在动脉内膜增加ox-LDL刺激TRPC5超表达。体外、血管紧张素ⅱ诱导VSMCs扩散和内部Ca2 +可以直接刺激TRPC5频道(
27]。在我们目前的研究中,我们发现ISL显著下调TRPC5和PCNA表达剂量依赖性的方式。因此,我们推测,ISL可能抑制VSMCs扩散通过下调TRPC5。然而,我们的研究有一定的局限性,我们没有进一步研究信号通路可能是负责协调对言论TRPC5 ISL的抑制效应。
有趣的是,据报道,ISL可以抑制NF -
κB和增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路
28]。已经证实,NF -的激活
κB和MAPK途径加速动脉粥样硬化进程和促进VSMCs增殖和迁移
29日]。氧化应激和钙流入也会影响TRPC5表达式。因此,还需要进一步的研究来揭示ISL的机制调节TRPC5表达和抑制动脉粥样硬化。
总之,我们证明ISL抑制TRPC5超表达不仅在高脂肪食源性动脉粥样硬化小鼠模型还在初级VSMCs刺激血管紧张素ⅱ。此外,ISL改善动脉粥样硬化小鼠模型和抑制主要VSMCs扩散。这些发现提供了新颖的见解ISL的药理作用,对动脉粥样硬化和表明ISL有益于心血管保护。