通过抑制CD4，重组人脑利钠肽衰减心肌缺血再灌注损伤⁺通过PI3K/AKT/mTOR通路激活T细胞增殖

摘要

炎症在心肌缺血再灌注(IR)损伤的发生发展中起着重要作用。重组人脑利钠肽(rhBNP)是一种人工合成的肽，在心力衰竭时升高，在各种组织中显示出抗炎作用。但其在心肌IR损伤中的作用尚不清楚。在本研究中，我们证明了rhBNP对小鼠心肌IR损伤有保护作用，表现为梗死面积减小，心肌保存良好，炎症浸润减弱，CD4减少⁺T细胞增殖功能，抑制促炎相关基因的表达。此外，机械研究表明，RHBNP通过促进PI3K / AKT / mTOR磷酸化抑制Jurkat T增殖。集体，我们的数据表明，IR损伤期间的RHBNP给药可以扩大我们对RHBNP心脏保护作用的理解。

1.介绍

心肌缺血-再灌注损伤是冠心病发病率和死亡率的主要因素。IR损伤可导致进行性坏死和凋亡细胞死亡，损害心脏收缩力和电生理功能[1]．如何在缺血心肌组织血供重建与减少或避免IR损伤之间取得平衡，是临床实践中仍然存在的一个关键问题。

PI3K / AKT / MTOR信号通路对于控制CD4是必不可少的⁺哺乳动物细胞中T细胞的发育、功能和稳定性[2]．大量证据表明，IR通过引起内皮细胞、小管上皮细胞和肾实质细胞以及白细胞的变化而影响免疫稳态[3.，4]．对IR损伤的主要先天免疫反应包括缺血后心脏T细胞的激活和积累[5- - - - - -7]．CD4枯竭⁺动物模型中的T细胞足以减少心肌红外损伤[8]．此外,传统的CD4⁺T细胞，包括Th1和Th17，在IR损伤的发展中起着重要作用[9]．在一项研究中，通过使用淋巴细胞缺陷的Rag1敲除（KO）小鼠免受免受IR损伤的影响来消除T细胞[10.]．在另一项研究中，CD4缺失的小鼠⁺T细胞，但不是CD8⁺与野生型小鼠相比，T细胞有明显较小的梗死[7]．因此，进一步了解其潜在的分子机制将有助于CD4的发展⁺T基于细胞的策略，以防止心肌红外损伤。

脑利钠肽(又称b型利钠肽或BNP)是哺乳动物心肌中主要的利钠肽。BNP作为一种主要由心室肌细胞产生的心脏激素，已成为心力衰竭的生物标志物[11.，12.]．血清BNP浓度测定对心力衰竭诊断具有较高的敏感性和特异性[13.]．几项研究表明，BNP可能会减少心肌红外损伤[14.- - - - - -16.]．此外，最近的一项研究表明，BNP用作抗炎，可保护心脏从多重并发症中的抗炎14.]．重组人BNP (rhBNP)是一种人工肽，通过基因工程开发，广泛用于治疗急性未补偿充血性心力衰竭患者[12.]．最近，RHBNP还静脉内给药，以引导液治疗，并预测急性疾病的结果，包括IR损伤在关键护理单位[17.]．然而，rhBNP对心肌IR损伤的作用及其机制尚不清楚。因此，我们旨在确定rhBNP是否通过调节CD4发挥其对IR损伤的保护作用⁺T细胞的稳态，并确定其机制。

2。材料和方法

2．1．试剂

rhBNP购自中国成都诺迪康生物制药有限公司。抗体来自美国Danvers的Cell Signaling Technology公司。

2.2。细胞系和动物

成年C57BL/6小鼠(8-10周龄，体重20-25 g)购自上海西普bk实验动物有限公司(中国上海)，饲养于 并带有12小时光/暗循环。水和食物可用随意．所有的实验都是按照美国国立卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》进行的。本实验经河北省沧州市中心医院医学伦理委员会批准。

Jurkat T细胞(人T细胞系)取自中国科学院上海细胞生物学研究所(Shanghai, China)，在rmi -1640(10%)中培养。 ）FBS (Hyclone，美国)，50 U/mL青霉素，50μg/mL链霉素(完全培养基)，置于含5% CO的湿室中₂在37°C。

２．３．组和治疗

60只小鼠被分为三组( : sham +磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、IR + PBS、IR + rhBNP，与之前的文献一致[17.，18.]．在进行IR手术后，每隔一天接受每隔一天的0.035mg rhBNP或异构蛋白PBS的小鼠。

将Jurkat T细胞分为两组:对照组和rhBNP (0.1μm），如前所述[19.]．

２.４.模型建立

小鼠术前禁食12小时，然后用1-2%异氟醚麻醉，然后诱导IR，如别处所述[6]．简而言之，通过将左侧前后下降冠状动脉围绕左侧胸切口放置丝缝线（6-0）滑动，暂时诱导心肌缺血。在心肌梗死后40分钟释放了Splknot，然后再灌注心肌。在24小时后，在手术后，在收集在-80℃下收集上清液血清之前收集血液样品并离心（3,500×g）15分钟。

2．5．梗塞尺寸测量

用2,3,5-三苯基四唑鎓氯化物（TTC）染色测量心肌梗塞尺寸。通过宫颈脱位处死小鼠，并且在-20℃下收获的心脏组织在-20℃下储存40分钟。将每个心脏垂直于垂直轴切成5个均匀部分。将2mm厚的部分在37℃下在1％TTC溶液中在黑暗中孵育30分钟，然后将在4％多聚甲醛中浸入过夜。梗塞区域由计算机化的平面图确定，所计算的面积百分比确定。

2.6。心肌标记酶与心肌肌钙蛋白T

再灌注后180 min采血，4℃离心(3000转/分)10 min，血清取微管-20℃保存至检测。血浆肌酸激酶(CK，中升北孔，北京，中国)、乳酸脱氢酶(LDH，中升北孔，北京，中国)、肌钙蛋白T (TnT，罗氏诊断，纽约，美国)浓度按照购买试剂盒提供的说明书进行测定。

2.7。组织病理学

石蜡包埋的组织标本经红外扫描后，连续切片3-5份μ在用苏木精 - 曙红（HE）染色之前，脱蜡，脱己和脱水，并在光学显微镜（Leica MicroSystems，德国）下观察。

2.8。流仪结果

为了从鼠标心脏中分离单个细胞，我们使用了先前描述的协议[20.]．简单地说，将小鼠心内灌注50ml含肝素的冰汉克平衡盐溶液(HBSS)以排除血细胞。左心室解剖，用细剪刀切碎，用胶原酶型和蛋白酶XIV型(Sigma Aldrich, USA)消化，并通过40过滤μm细胞滤器(Merck Millipore，美国)。

将细胞标记为下列抗小鼠ABS的表面表达：抗CD3E（17A2），抗CD4（GK1.5和RM4-5），抗CD8（53-6.7），抗CD25（PC61），和抗CD69（H1.2F3）。为了细胞内分析，通过抗Ki67（35 / Ki-67）透露细胞并染色。所有ABS都是从BD Bioscience（美国）或埃比科（美国）购买的。FACS ARIA I（BD Biosciences，USA）用于收集数据，流程软件（树星）用于分析。

2.9。免疫印迹

Western blot检测如前所述[21.]．简而言之，用含1 mmol/L鸡尾酒的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。然后制备匀浆并在4°C下离心(12,000 g) 10分钟。用BCA法测定蛋白浓度。非特异性结合被5%脱脂奶为1.5 h,和膜孵化与p-AKT S473,总AKT和p-PI3K(美国BD生物科学)与总PI3K p-mTOR S2448和总mTOR(美国Biolegend)和p-P70 S6激酶(p-P70S6K) P70 S6激酶(P70S6K)和GAPDH(圣克鲁斯生物技术,在4°C下过夜，在室温下二抗1小时。信号是使用Amersham prime ECL Plus检测系统(Pittsburgh, PA)确定的。

2.10。定量实时聚合酶链反应

使用Trizol（Invitrogen，USA）提取RNA，并且使用优势RT-FOR-PCR（BD Biosciences）进行第一链cDNA合成。对于常规逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），使用Taq DNA聚合酶（Eppendorf，汉堡，德国）扩增cDNA。设计引物被设计为跨越外显子连接。通过扩增确保可比数量的cDNAβ肌动蛋白(向前,5 -CAGCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3和反向，5 -CGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3 ）.对于其他mRNA的扩增，我们使用了以下的引物，白介素- (IL-) 1β(向前,5 -ATGCCTCGTGCTGTCTGACC-3和反向，5 -CCATCTTTAGGAAGACACGGGTT-3 ），肿瘤坏死因子- (TNF-)α(向前,5 -AGCGGCTGACTGAACTCA GATTGTAG-3和反向，5 -GTCACAGTTTTCAGCTGTATAGGG-3 ），il - 10(向前,5 -AGTGGAGCAGGTGAAGAGTG-3 ，反向，5 -TTCGGAGAGAGGTACAACG-3 ），转化生长因子-β(向前,5 -GCTACCATGCCAACTTCTGT3 ，反向，5 -CGTAGTAGACGATGGGCAGT-3 ）.

2.11。统计分析

所有数据显示为 (SD)。为了分析两组之间的差异，未配对的学生进行测试。对于多个组，进行单向ANOVA，然后进行Bonferroni后HOC测试。GraphPad Prism 5.0（La Jolla，USA）软件用于计算组之间的重要性。价值 被认为是统计学意义的。

结果

3.1。用RHBNP治疗保护心脏损伤

为了确认rhBNP对心肌红外损伤的影响，我们使用TCC染色来评估梗死区域。数字1(一)在每组中呈现染色心脏组织的照片。IR组的梗死区域比假手术组高44.26％，用RHBNP治疗明显减少到20.12％（图1 (b)）.这表明RHBNP显着减少了心肌损伤。此外，IR组中的心脏酶，LDH和CK的平均血清浓度升高 (图1 (c)), (图1 (d)）分别比较 (图1 (c)), (图1 (d))。与此相反，rhBNP组显著降低LDH和CK浓度 和 ，分别。此外，rhBNP治疗组的心脏TNT产生较低 相比之下, 在IR组( ）和 在假组(图1（e））.这些发现表明rhBNP具有心脏保护作用。

３.２．rhBNP可减少T细胞的数量和比例

我们在有或没有rhBNP治疗的心肌IR损伤小鼠中评估了T细胞的发育。IR损伤后，大量CD4⁺和CD8⁺T细胞在心脏内组装，但数量(图2(一个))和比例(数字2（b）- - - - - -2（d）)。与此一致的是，HE染色实验显示，用rhBNP处理的IR小鼠的炎症浸润显著减少(图)2 (e)）.这些数据表明，RHBNP可以减少IR损伤后的T细胞相关的炎症浸润。

3.3。RhBNP限制T细胞增殖但不激活

为了解决rhBNP对T细胞的功能影响，我们评估了FACS的T细胞增殖。CD3.⁺用RHBNP处理的IR细胞具有显着诱导的T细胞增殖，与未接收RHBNP的IR组相比（图3（a）和3 (b)）.另一方面，T细胞活化标记物CD25和CD69在rhBNP治疗组中无显著差异(图)3 (c)和3 (d)）.总的来说，这些数据表明，rhBNP抑制T细胞增殖，但在T细胞激活中不起作用。

3.4。RhBNP在心肌组织中下调炎症细胞因子表达

心肌IR通常与严重的炎症反应和炎性细胞因子如IL-1的表达有关β和肿瘤坏死因子-α而抗炎细胞因子如TGFβ和IL-10被抑制[7]．采用RT-PCR检测心肌组织中炎性因子和抗炎因子的水平。

数字4显示IL-1的表达β和肿瘤坏死因子-αIR组TGFβIL-10降低。但与IR组相比，rhBNP能有效抑制炎症因子水平的升高，逆转炎症因子水平的下降。

3．5．rhBNP抑制Jurkat T细胞增殖

为了研究rhBNP代谢产物对T细胞的影响，我们用rhBNP处理Jurkat细胞，并用人抗cd3 /CD28珠活化。CCK-8检测结果显示，rhBNP处理的细胞的光密度(OD)值明显低于对照组( 第3天和第4天，图5(一个)）.Ki67标记细胞增殖实验显示，rhBNP处理Jurkat T细胞增殖降低约40%。这些结果表明，rhBNP也能抑制Jurkat T细胞的增殖。

3.6。rhBNP降低Jurkat T细胞中PI3K/AKT通路的磷酸化

为了了解rhBNP抑制T细胞增殖的机制，我们通过western blot分析检测了PI3K (p-PI3K)、AKT (p-AKT)、mTOR (p-mTOR)和P70S6K (p-P70S6K)的活性(图)6）.我们发现与对照组相比，rhBNP处理可促进PI3K、AKT和mTOR的磷酸化( ）.但是，在总蛋白质中没有检测到差异（总PI3K，总AKT，总MTOR和总P70S6K，图6（b））.

4.讨论

RHBNP在心脏病临床管理中的治疗效果得到了很好的认识到，它是其在各种器官中发挥抗炎活动的能力[22.，23.]．rhBNP在心肌IR损伤中有明显的有益作用，但其作用机制尚不清楚。适应性免疫反应，特别是涉及CD4的免疫反应⁺T细胞(9，对伤口愈合过程很重要[8]．最近，来自小鼠模型的有力证据表明CD4发挥了重要作用⁺缺血-再灌注中的T细胞[4，10.]．一些研究使用了CD4⁺T细胞缺陷小鼠（CD4⁺KO和RAG1 KO）并展示了CD4的新兴贡献⁺IR损伤的T细胞和梗塞治疗[8，10.]．rhBNP对CD4影响机制的建立⁺IR损伤中的T细胞具有显着的临床意义。我们的结果表明，RHBNP通过促进PI3K / AKT / mTOR途径的磷酸化来抑制IR区域中的T细胞增殖。

我们研究了rhBNP对小鼠IR损伤的保护作用，发现rhBNP (0.035 mg/kg)预处理降低了梗死面积(图)1(一)和1 (b))和心肌激酶(LDH和CK，图1 (c)和1 (d))和TnT(图1（e）)水平，这与之前的研究一致。探讨rhBNP对CD4细胞的抗炎作用⁺T细胞，我们使用FACS分析CD4的数量和比例⁺和CD8⁺患病心脏组织中的T细胞显示，rhBNP处理在心脏中减少了两种细胞类型（图2(一个)- - - - - -2（d））.HE染色也显示rhBNP可减少炎症浸润(图)2 (e)）.

我们评估了rhBNP对CD4的影响⁺T细胞并显示CD3中Ki67的表达⁺CD4.⁺T细胞减少（图3（a）和3 (b))，表明rhBNP抑制CD4⁺T细胞增殖。CD4.⁺通过检测CD25和CD69的表达，T细胞的活化没有受到影响(图)3 (c)和3 (d))，这是T细胞活化的两个标志。il - 1β和肿瘤坏死因子α是两种重要的促炎细胞因子[24.，25.]，而TGFβIL-10是抗炎的[26.]．此外，我们发现IL-1的mRNA水平β和肿瘤坏死因子αIR治疗后升高，rhBNP治疗后降低。TGF的mRNA水平βrhBNP治疗后IL-10增加。最近的一项研究一致表明，在IR期间，BNP抑制炎症相关mRNA的表达，包括TNF-α和il - 6 (8]．完全,我们的我n体外实验表明RHBNP可以直接影响T细胞。

为了探讨在T细胞中与rhBNP相关的机制，我们用rhBNP治疗Jurkat T细胞(一种广泛使用的白血病T细胞系)，以探索rhBNP是否对增殖有同样的作用。MTT法显示，rhBNP (0.1μm）治疗（图5(一个)）.为了证实这些结果，我们进一步检测了ki67细胞的FACS表达(图)5（b）)，显示rhBNP的加入明显抑制T细胞的增殖。

PI3K/AKT/mTOR信号通路参与细胞生长、细胞激活和病理条件下炎症反应的许多方面[27.]．PI3K/ akt依赖信号的激活可预防心肌病和凋亡，并保护心肌IR损伤[28.]．我们发现，rhBNP促进PI3K及其下游组分(AKT、mTOR和P70S6K)的磷酸化，但不促进总蛋白表达(图)6）.

总之，我们表明RHBNP通过抑制CD4抑制心肌红外损伤⁺T细胞通过促进PI3K / AKT / MTOR途径磷酸化。

5.结论

我们已经提供了令人信服的证据表明，用rhBNP预处理小鼠可以防止心肌红外损伤，表现为减毒炎症浸润和减少CD4⁺T细胞增殖，心肌功能保留。机制研究表明，rhBNP通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制T细胞增殖。总之，rhBNP在心肌IR损伤中作用的这一新方面扩展了我们对rhBNP心脏保护作用的理解。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者宣称不存在相互竞争的利益。

致谢

基金资助:河北省沧州市科技研发指导项目(2015;151302044)。

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