1。介绍
心肌缺血再灌注(IR)损伤是一个主要贡献者冠状动脉疾病的发病率和死亡率。红外受伤导致进行性坏死和凋亡细胞死亡,心肌收缩性和电生理学的妥协性能(
1]。剩下的在临床实践中一个关键问题是如何平衡的重建缺血心肌的血液供应,组织对需要减少或避免红外受伤。
PI3K / AKT / mTOR信号通路对CD4的控制至关重要+T细胞的发育、功能和稳定性在哺乳动物细胞(
2]。有压倒性的证据表明红外导致内皮变化影响免疫内稳态,管状上皮,肾脏实质细胞,以及白细胞(
3,
4]。主要的先天免疫反应红外损伤包括T细胞的激活和积累在缺血后心脏
5- - - - - -
7]。CD4枯竭+T细胞在动物模型是充分减少心肌红外损伤(
8]。此外,传统的CD4+T细胞,包括Th1和Th17,发挥重要作用的发展红外损伤(
9]。在一项研究中,消除T细胞利用lymphocyte-deficient RAG1敲除小鼠(KO)防止红外损伤(
10]。在另一项研究中,小鼠CD4枯竭的境地+CD8 T细胞,但不是+T细胞,明显梗死与野生型小鼠相比(小
7]。因此,提出了一种改进的理解底层的分子机制CD4的发展会有帮助的+T细胞策略来防止心肌红外受伤。
脑利钠肽(也被称为b型利钠肽或BNP)是主要的利钠肽在哺乳动物心肌。作为一种主要由心室心脏分泌细胞,法国曾作为心力衰竭(生物标志物
11,
12]。测量血清BNP浓度为心力衰竭的诊断具有较高的敏感性和特异性(
13]。多项研究表明,法国可能会减少心肌红外损伤(
14- - - - - -
16]。此外,最近的一项研究表明,法国作为抗炎保护心脏免受多种并发症(
14]。重组体人法国巴黎(rhBNP)是一种人为的肽,通过基因工程开发,被广泛用于管理急性无报酬的充血性心力衰竭患者(
12]。最近,rhBNP也被管理静脉注射引导液体治疗和急性疾病的预测结果包括红外伤害在重症监护单位(
17]。然而,rhBNP对心肌的影响红外受伤和底层机制仍不清楚。因此,我们旨在确定rhBNP发挥其在红外调节CD4伤的保护作用+T细胞内稳态,并确定所涉及的机制。
2。材料和方法
2.1。试剂
rhBNP购买Nuodikang生物制药有限公司(中国成都)。抗体得到从细胞信号技术(丹佛,美国)。
2.2。细胞株和动物
岁成人C57BL / 6小鼠(8 - 10周,体重20 - 25 g)购自上海SipprBK实验室动物有限公司(中国上海)和安置在一个有空调的房间
23
±
2
°
C
和一个12 h光/暗周期。水和食物
随意。所有实验按照美国国立卫生研究院实验室动物保健和使用指南。这个实验是医学伦理委员会批准的河北沧州中心医院。
Jurkat T细胞(人类T细胞线)来自上海细胞生物学研究所,中国科学院(中国上海)和培养在含有10% (rpmi - 1640
v
/
v
)的边后卫(美国Hyclone), 50 U /毫升青霉素,50
μg / mL链霉素(完全培养基)湿室包含5%的股份有限公司2在37°C。
2.3。组和治疗
六十小鼠被分为三组(
ngydF4y2Ba
=
6
每组):假+磷酸盐(PBS)、红外+ PBS和红外+ rhBNP,符合之前的出版物(
17,
18]。老鼠收到0.035毫克的rhBNP或腹腔注射等体积的PBS每隔一天总共执行红外手术后的三倍。
Jurkat T细胞被分成两组:控制和rhBNP (0.1
μ米),如前所述
19]。
2.4。模型建立
小鼠禁食12 h术前然后用1 - 2%异氟烷麻醉诱导前红外所描述的其他地方(
6]。短暂,心肌缺血是引起暂时将丝绸缝(6)在冠状动脉左前降枝活结通过左胸切口。活结发布40分钟后心肌梗塞和心肌reperfused。在手术后24小时,血液样本被收集和离心机(3500×g) 15分钟前收集上层的血清用于存储在-80°C。
2.5。梗塞尺寸测量
心肌梗塞尺寸测量与2、3、去除氯(TTC)染色。老鼠被牺牲了颈椎脱位,心脏组织立即收获和储存在-20°C 40分钟。每个心片垂直于纵轴为5一致的部分。2毫米厚的部分被孵化TTC 1%解决方案在37°C在黑暗中30分钟,然后沉浸在4%多聚甲醛。梗塞区是由电脑平面几何和面积百分比计算。
2.6。心脏标记酶和心肌肌钙蛋白T
收集血液再灌注后180分钟,离心机(3000 rpm) 10分钟在4°C,和血清被卷入超小型电子管存储在-20°C到化验。等离子体肌酸激酶(CK, Zhongshengbeikong,北京),乳酸脱氢酶(LDH, Zhongshengbeikong,北京),和肌钙蛋白T (TnT,罗氏诊断,纽约,美国)浓度测定按提供的指令购买包。
2.7。组织病理学
后红外光谱、石蜡包埋组织样本分段连续3 - 5
μ米厚片、脱蜡和脱水与hematoxylin-eosin染色之前,(他)和光学显微镜下观察(德国徕卡微系统)。
2.8。流仪结果
孤立的单个细胞从老鼠的心脏,我们使用先前描述的协议(
20.]。灌注,老鼠心脏内的50毫升的冰冷的汉克的平衡盐溶液(hbs)与肝素排除血液细胞。左心室解剖,与细剪碎,和胶原酶消化类型和蛋白酶类型十四(西格玛奥德里奇,美国),透过40
μm细胞过滤器(美国默克密理博)。
细胞被标记的表面表达以下anti-mouse Abs: anti-CD3e (a2) 17日,anti-CD4 (GK1.5和RM4-5), anti-CD8 (53 - 6.7), anti-CD25 (PC61)和anti-CD69 (H1.2F3)。对细胞内分析、细胞permeabilized和沾anti-Ki67 (35 / ki - 67)。腹肌都从BD生物科学(美国)或购买eBioscience(美国)。流式细胞仪咏叹调我(美国BD生物科学)被用来收集数据,和FlowJo软件(树明星)是用于分析。
2.9。免疫印迹
免疫印迹试验进行了如前所述[
21]。总之,细胞细胞溶解与里帕裂解缓冲包含1更易与L鸡尾酒。匀浆被准备和离心机在4°C(12000克)10分钟。蛋白质浓度由BCA法决定。非特异性结合被5%脱脂奶为1.5 h,和膜孵化与p-AKT S473,总AKT和p-PI3K(美国BD生物科学)与总PI3K p-mTOR S2448和总mTOR(美国Biolegend)和p-P70 S6激酶(p-P70S6K) P70 S6激酶(P70S6K)和GAPDH(美国圣克鲁斯生物技术)在4°C一夜之间和在二级抗体室温1 h。信号测定使用Amersham ' ECL +检测系统(宾夕法尼亚州匹兹堡)。
2.10。定量实时聚合酶链反应
RNA提取使用试剂盒(英杰公司、美国),和第一链cDNA合成进行了使用优势RT-for-PCR (BD生物科学)。传统逆转录聚合酶链反应(rt - pcr),互补使用Taq放大DNA聚合酶(埃普多夫,汉堡,德国)。引物设计跨越exon-exon连接。相当数量的cDNA确保通过放大
β肌动蛋白(向前,5
′
-CAGCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3
′
和反向,5
′
-CGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3
′
)。其他信使rna的放大,我们使用以下引物,白介素- 1 (IL)
β(向前,5
′
-ATGCCTCGTGCTGTCTGACC-3
′
和反向,5
′
-CCATCTTTAGGAAGACACGGGTT-3
′
)、肿瘤坏死因子(TNF)
α(向前,5
′
-AGCGGCTGACTGAACTCA GATTGTAG-3
′
和反向,5
′
-GTCACAGTTTTCAGCTGTATAGGG-3
′
)、il - 10(向前,5
′
-AGTGGAGCAGGTGAAGAGTG-3
′
反向5
′
-TTCGGAGAGAGGTACAAACG-3
′
)、转化生长因子- (TGF)
β(向前,5
′
-GCTACCATGCCAACTTCTGT3
′
反向5
′
-CGTAGTAGACGATGGGCAGT-3
′
)。
2.11。统计分析
所有的数据呈现的
的意思是
±
标准
偏差
(SD)。两组之间的差异进行分析,未配对的学生
t
测试执行。为多个组,进行单向方差分析,其次是Bonferroni因果检验。美国GraphPad Prism 5.0 (La Jolla)软件用于计算组之间的意义。的值
p
<
0.01
被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。治疗rhBNP保护心脏免受红外受伤
确认rhBNP对心肌的影响红外受伤,我们使用太极拳染色评估梗死区。图
1(一)介绍了彩色的照片在每组心脏组织。和IR组的梗死面积大于44.26%的虚假的集团和rhBNP治疗显著降低梗死20.12%(图
1 (b))。这表明,心肌损害被rhBNP显著降低。此外,血清心肌酶的浓度,LDH和CK IR组升高
1582.00
±
74.59
U
/
l
(图
1 (c)),
1273.17
±
162.67
U
/
l
(图
1 (d)),分别与之相比
773.50
±
85.30
U
/
l
(图
1 (c)),
431.00
±
69.65
(图
1 (d)虚假的组),分别。相比之下,rhBNP组LDH和CK浓度明显降低
836.50
±
45.33
和
487.83
±
40.23
U
/
l
,分别。此外,心脏TnT生产低rhBNP-treated小组
4.99
±
0.93
ng
/
毫升
相比之下,
15.18
±
1.69
ng
/
毫升
IR组(
p
<
0.01
),
0.10
±
0.20
ng
/
毫升
虚假的组(图
1 (e))。这些发现表明rhBNP的保护作用。
治疗rhBNP保护心脏免受红外受伤。(a, b)红外模型小鼠有/没有rhBNP预处理被TTC评估梗塞大小测定:红染色是可行的区域,和白色的污点代表梗塞的地区。血清浓度(c) LDH、CK (d)和(e) TnT骗局,红外,红外+ rhBNP组。骗局:sham-operated组;红外光谱:模型组;红外+ rhBNP:模型小鼠接受rhBNP(0.035毫克/公斤)。LDH:乳酸脱氢酶;CK:肌酸激酶;TnT:肌钙蛋白T;
ngydF4y2Ba
=
5
每组数据表示为
的意思是
±
SD
,
∗
∗
∗
p
<
0.01
。
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3.2。rhBNP降低T细胞的数量和比例
我们评估小鼠心肌T细胞发展红外损伤的存在和缺乏rhBNP治疗。红外受伤后,大量的CD4细胞+和CD8+T细胞聚集在心脏,但数量(图
2(一个))和比例(数字
2 (b)- - - - - -
2 (d)),这些细胞与rhBNP治疗略有下降。始终,他染色试验表明,炎症浸润大幅减少红外老鼠rhBNP处理(图
2 (e))。这些数据表明,rhBNP可以减少T闲暇的红外损伤后炎性浸润。
rhBNP对心肌的影响T细胞。(一)绝对细胞数量和CD4 (b)的百分比+和CD8+T细胞。(c)代表点CD45的情节+,CD4+、CD45+CD8+子集心肌的红外光谱和红外+ rhBNP组。(d)他心脏组织染色。原来放大(200 x)。(e)骗局:sham-operated组;红外光谱:模型组;红外+ rhBNP:模型小鼠接受rhBNP(0.035毫克/公斤);
ngydF4y2Ba
=
5
每组数据表示为
的意思是
±
SD
,
∗
∗
∗
p
<
0.01
。
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3.3。rhBNP限制T细胞增殖但不激活
解决功能rhBNP对T细胞的影响,我们通过流式细胞仪对T细胞增殖。CD3+细胞在小鼠红外处理rhBNP明显诱导T细胞增殖与IR组相比没有收到rhBNP(数字
3(一个)和
3 (b))。另一方面,T细胞活化标记、CD25和CD69,显示与rhBNP治疗(数据无显著差异
3 (c)和
3 (d))。总的来说,这些数据表明,rhBNP抑制T细胞增殖,但在T细胞激活没有发挥作用。
rhBNP对T细胞增殖和活化的影响。细胞(a, b)增殖和(c, d)激活标签CD3后由流式细胞术+和CD4+抗体。红外光谱:模型组;红外+ rhBNP:模型小鼠接受rhBNP(0.035毫克/公斤)。
ngydF4y2Ba
=
3
每组数据表示为
的意思是
±
SD
,
∗
∗
∗
p
<
0.01
NS:无显著差异。
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3.4。rhBNP会使心肌组织中炎症细胞因子表达
心肌红外通常是与严重的炎症反应和炎性细胞因子的表达如il - 1
β和肿瘤坏死因子-
α而抗炎细胞因子,如TGF
β和il - 10是抑制(
7]。我们使用rt - pcr确定的炎症和抗炎细胞因子在心肌组织水平。
图
4表明,il - 1的表达
β和肿瘤坏死因子-
α高IR组与虚假的集团相比,而TGF的表达
β和il - 10是较低的。然而,rhBNP有效抑制炎症因子水平的增加和逆转抗炎因子水平的降低与IR组。
rhBNP调节炎症细胞因子表达。定量分析的il - 1
β,肿瘤坏死因子
α,TGF
β,il - 10 mRNA表达心肌的骗局,红外,红外+ rhBNP组。
ngydF4y2Ba
=
3
每组。骗局:sham-operated组;红外光谱:模型组;红外+ rhBNP:模型小鼠接受rhBNP(0.035毫克/公斤)。数据表示为
的意思是
±
SD
。
∗
∗
∗
p
<
0.01
。
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3.5。rhBNP抑制Jurkat T细胞增殖
探讨rhBNP代谢物对T细胞的影响,Jurkat细胞接受rhBNP和激活使用人类anti-CD3 / CD28珠子。CCK-8化验结果表明,光密度值(OD)细胞处理rhBNP明显低于对照组的细胞(
p
<
0.05
天3和4,图
5(一个))。此外,Ki67标记细胞增殖试验表明,Jurkat T细胞增殖与rhBNP治疗减少了约40%。这些发现表明rhBNP也抑制了Jurkat T细胞的增殖。
在Jurkat rhBNP T细胞增殖的影响。(一)细胞生存能力被CCK-8试验检测。(b, c)细胞增殖是由标签CD3后流式细胞术+和CD4+抗体。控制:细胞治疗等效PBS。rhBNP:细胞接受rhBNP (0.1
μ米)。
ngydF4y2Ba
=
3
每组数据表示为
的意思是
±
SD
。
∗
∗
∗
p
<
0.01
。
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3.6。rhBNP减少磷酸化Jurkat PI3K / AKT通路的T细胞
来洞察rhBNP抑制T细胞增殖的机制,我们研究了PI3K的活动(p-PI3K),一种蛋白激酶(p-AKT) mTOR (p-mTOR)和P70S6K (p-P70S6K)免疫印迹分析(图
6)。我们表明,rhBNP治疗促进PI3K的磷酸化,AKT, mTOR与对照组相比
p
<
0.05
)。然而,未发现差异在总蛋白(总PI3K、总AKT、总mTOR和总P70S6K,人物
6 (b))。
影响rhBNP PI3K / AKT / mTOR Jurkat T细胞的途径。(a)免疫印迹分析总和磷酸化PI3K AKT, mTOR, P70S6K细胞。(b)表达水平的比较全,磷酸化PI3K AKT, mTOR, P70S6K。(c)激活这些蛋白水平的比较Jurkat T细胞有/没有rhBNP (0.1
μ米)治疗。
ngydF4y2Ba
=
3
每组数据表示为
的意思是
±
SD
。
∗
∗
∗
p
<
0.01
。
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4所示。讨论
rhBNP的治疗效果在心脏疾病的临床管理得到充分认识,是其发挥抗炎活性的能力在不同的器官(
22,
23]。显然是有有益的影响心肌的rhBNP红外受伤,但潜在的机制仍不清楚。自适应免疫反应,特别是那些涉及CD4+T细胞(
9),重要的是愈合过程(
8]。最近,有强大的证据对CD4小鼠模型的一个重要的角色+T细胞在缺血再灌注
4,
10]。几项研究CD4使用+(CD4 T cell-deficient老鼠+KO和RAG1 KO),展示了一个新兴的CD4的贡献+T细胞在红外损伤和梗塞治疗(
8,
10]。机制的建立rhBNP在CD4细胞的影响+T细胞在红外损伤具有显著的临床意义。我们的研究结果表明,rhBNP抑制T细胞增殖在红外区通过促进磷酸化PI3K / AKT / mTOR的途径。
我们研究小鼠对红外rhBNP损伤的保护作用,发现rhBNP(0.035毫克/公斤)预处理减少梗塞大小(数字
1(一)和
1 (b))随着心肌激酶(LDH和CK,数字
1 (c)和
1 (d))和TnT(图
1 (e))的水平,这与先前的研究是相一致的。探索rhBNP在CD4的抗炎作用+我们使用T细胞,流式细胞仪分析CD4的数量和比例+和CD8+T细胞在病变的心脏组织,表明rhBNP治疗减少心脏细胞类型(数据
2(一个)- - - - - -
2 (d))。他还染色试验表明,rhBNP减少炎性浸润(图
2 (e))。
我们在CD4 rhBNP的影响评估+T细胞CD3表明ki67的表达+CD4+T细胞减少(数字
3(一个)和
3 (b)),这表明rhBNP抑制CD4+T细胞增殖。CD4+T细胞活化并没有影响,因为测试通过的决心CD25和CD69的表达(数字
3 (c)和
3 (d)),两个T细胞激活的标志。il - 1
β和肿瘤坏死因子
α是两个重要的促炎细胞因子(
24,
25),而TGF
β和il - 10是抗炎(
26]。此外,我们发现,il - 1的mRNA水平
β和肿瘤坏死因子
α后增加红外但是rhBNP治疗后下降。相比之下,信使rna的TGF水平
β并与rhBNP il - 10在治疗后增加。一致,最近的一项研究表明,在红外光谱、法国巴黎抑制炎症相关的mRNA的表达,包括TNF -
α和il - 6 (
8]。完全,我们的我
n体外实验表明,rhBNP可以直接影响T细胞。
解决机制相关rhBNP在T细胞,我们对待Jurkat T细胞,一种广泛使用的进展期T细胞,与rhBNP探索rhBNP是否有同样的对扩散的影响。MTT试验表明,细胞生长速率显著抑制rhBNP后(0.1
μ(图)治疗
5(一个))。来证实这些结果,我们进一步研究了ki67细胞表达,流式细胞仪(图
5 (b)),表明添加rhBNP显著抑制T细胞增殖。
PI3K / AKT / mTOR信号通路参与细胞生长的许多方面,在病理条件下细胞激活和炎症反应(
27]。激活PI3K / AKT-dependent信号防止心肌病心肌红外损伤和细胞凋亡和保护(
28]。我们发现rhBNP促进磷酸化PI3K及其下游组件(mTOR AKT,和P70S6K),但不是总蛋白表达(图
6)。
总之,我们表明,rhBNP抑制心肌红外抑制CD4伤+通过促进T细胞增殖mTOR / PI3K / AKT通路磷酸化。