识别的新人类ABCC6运输车的拼接变体

文摘

ABCC6属于腺苷triphosphate-binding磁带(ABC)基因亚C编码一种蛋白质(MRP6)参与细胞内化合物的主动转运到细胞外环境。突变ABCC6造成这种elasticum (PXE),一种常染色体隐性障碍的结缔组织弹性结构的特点是进步的钙化皮肤,眼睛,和心血管系统。MRP6编纂了31个外显子和含有1503个氨基酸。ABCC6除了完整的成绩单,我们已经确定了一个另外的拼接变体ABCC6从人类肝cDNA缺乏外显子19到24。被任命为ABCC6。小说对碘氧基苯甲醚1924。PCR分析cDNA基本人类hepatocites和胚胎肾细胞培养证实了ABCC6的存在1924同种型。免疫印迹分析胚胎肾细胞显示了一个带对应于截短蛋白的分子量。

1。介绍

ABCC6属于亚C磷酸腺苷磁带(ABC)跨膜转运蛋白。ABCC6基因由31个外显子编码1503个氨基酸的蛋白质,有17个跨膜域和两个守恒的胞内核苷酸结合域(nbd)。ABCC6是同源(身份在氨基酸水平45%)ABCC1,被赋予多重耐药性肿瘤细胞(1];出于这个原因,ABCC6列为多药耐药性相关蛋白质,也叫MRP6。nbd包含两个高度保守的沃克图案ATP绑定和跨膜转运体功能的关键(2]。ABCC6基因的突变导致这种elasticum (PXE)(人类177850年和264800年),多系统疾病的特点是进步的钙化和弹性纤维变性3]。

ABCC6高度表达在人类肝脏和在较小程度上肾近端小管的,只有在非常低的水平,如果,在组织,如皮肤,眼睛,心血管系统影响这种elasticum (PXE) [4,5]。到目前为止,基因研究已经确定了165个突变,主要是错义和无意义突变,以及大型删除(审查[6])。自MRP6主要是肝脏和肾脏中表达,但只有低水平中发现组织受到PXE的影响,有人建议PXE主要与次要代谢紊乱参与弹性纤维(7]。尽管ABCC6突变和PXE之间高度相关,在PXE MRP6及其作用的活动在很大程度上仍未知。

最近,剪接变体导致5 bp删除ABCC6成绩单与小鼠的心脏瘠薄钙化有关(8]。

在我们的研究中,我们报告的鉴定的新变种ABCC6从人类肝cDNA缺乏外显子19到24。这种拼接变异也证实在肝和肾细胞培养。

2。材料和方法

人类的肝脏和肾脏BD Marathon-Ready cDNA是从Clontech购买的。主要人类hepatocites (Cambrex)是维护在培养基(Cambrex)后生产的指令。人类胚胎肾细胞(σ)保持在高葡萄糖杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含10%胎牛血清(v / v), 2毫米谷酰胺,100 U青霉素,和100年g / mL链霉素在5%。

2.1。克隆人类ABCC6互补dna编码

克隆ABCC6cDNA、正向引物-CACCATGGCCGCGCCTGCTG -和反向引物-TCAGACCAGGC-CTGACTCCTG -旨在克隆PCR钝端产品pcDNA 3.1 d / V5-His-TOPO表达载体(表达载体)。PCR进行使用人类肝cDNA和铂PCR SuperMix(表达载体)。进行PCR ptc - 100珀尔帖热循环(MJ研究),它由1周期2分钟,30个周期45秒,1分钟,5分钟和30秒10分钟。PCR产品从琼脂糖凝胶分离、纯化与MinElute凝胶萃取工具包(试剂盒)和结扎成pcDNA.3.1D / V5-His-TOPO表达载体。重组向量转化为全球大肠杆菌细胞。个人克隆培养过夜Luria Bertani与100年汤g / mL氨苄青霉素,质粒是孤立使用QIAprep旋转Miniprep工具包(试剂盒)。

2.2。rt - pcr分析

从使用GenElute哺乳动物培养细胞总RNA提取总RNA Miniprep工具包(σ)。逆转录之前,总RNA浓度测量与GeneQuant pro (Amersham国际,小都,英国)和RNA完整分析了紫外线照射下的可视化28 s - 18 s rrna乐队1.5%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭。完整的RNA (1g)是使用GeneAmp反向转录的RNA PCR核心装备应用生物系统公司与特定ABCC6基因引物,亲逆转录酶,根据制造商的指示。逆转录酶转录反应没有进行消极的控制在随后的PCR反应。

扩大地区从外显子18到25外显子我们使用以下引物:-GGCATGAATCTCTCCGGAG -(外显子18正向引物)-CTGGAGGGCAGCAGAGAC -(反向引物的外显子25)。PCR进行人类肝脏和肾脏cDNA和互补脱氧核糖核酸的细胞培养。PCR是1的循环2分钟;30的周期45秒,1分钟,2.5分钟,10分钟。一个整除的扩增子被溴化乙锭可视化分析1.5%的琼脂糖凝胶评估片段的大小,从凝胶纯化,直接测序。

2.3。测序

ABCC6基因重组向量序列的验证使用BigDye终结者v3.1循环测序工具包(应用生物系统公司)。3100的基因分析仪的样品进行了分析(应用生物系统公司)根据生产的建议。的互补序列ABCC6 ABCC6及其剪接变体1924已经沉积在IDs AM774324和AM711638基因库,分别。扩增的PCR产物序列通过exon18-exon25地区从细胞培养和人类肝脏和肾脏cDNA已经由MWG生物技术。

2.4。西方墨点法

免疫印迹分析MRP6表达,整个细胞溶解产物是孤立的。PMSF HEK293补充了蛋白酶抑制剂(0.1毫米,5g / mL抑肽酶,5g / mL亮抑酶肽,1g / mL抑肽素)在1200转离心5分钟。1毫升的颗粒是resuspended冰冷里帕缓冲区(PBS, Igepal ca - 630 1%,钠脱氧胆酸盐0 5%,SDS 0.1%)和孵化冰30分钟;通过声波降解法进一步破坏。声波降解法后,溶解产物是孵化冰上30分钟然后在000 xg离心10分钟。蛋白质与见得的丙酮沉淀o / n, resuspended Laemmli缓冲区,通过sds - page分离(7%)。后来,electrotransfer Immobilon-P转移膜(微孔,贝德福德,质量。,证实了我们)可逆与朱红色红染色。20分钟后在孵化缓冲区(IB)(50毫米三,150毫米氯化钠,0,5% Tween-20),膜孵化了1小时多克隆人类抗体,提高对人类MRP6 amminoacids 1 - 70(圣克鲁斯生物技术有限公司),稀释1:400 IB。后三个洗液洗涤缓冲(WB)(50毫米三,150毫米氯化钠),膜被孵化的辣根过氧化物酶共轭山羊antirabbit抗体(σ免疫化学,圣路易斯,密苏里州,美国),稀释1:5000 IB。最后,这个污点洗了三次与世行和蛋白质可视化发射极耦合逻辑(Immun-Star合,Biorad,赫拉克勒斯,加利福尼亚州,美国)。

3所示。结果与讨论

ABCC6 PCR扩大了使用特定的引物和从人类肝cDNA克隆到pCDNA3.1向量。令人惊讶的是,一些克隆的序列显示两种不同的4512年和4137年的核苷酸序列对应于完整的长度(ABCC6)和短ABCC6变种,分别。比较短的外显子/内含子的边界ABCC6基因发现外显子19到24人失踪。

为了验证如果短形式,即ABCC61924岁的低频剪接事件或一个ABCC6变体,我们放大和PCR测序产品外显子地区年龄在18岁至25岁之间的互补脱氧核糖核酸的人类肝脏、人工肾、主要人类hepatocites(你好),和人类胚胎肾细胞(HEK293)。肝脏和肾脏显示本质上完整的外显子区域(图年龄在18岁至25岁之间1通道1和2),而两个外显子缺失的变种被发现主要在嗨和HEK293(图1车道3和4)。然后,我们建议同种型缺乏外显子19到24可能不同的剪接变体的产物分布在各种组织和细胞系。

删除整个外显子19引起转变的阅读框插入一个停止信号的核苷酸2614 - 2616(图2)。过早终止密码子的结果,假定的小说蛋白质有不同的和更短的糖比本地MRP6蛋白质。第二轮嵌套PCR,异常剪接的ABCC6 mRNA之前已经观察到组织不表达可观数量的蛋白质(5]。最近,它已被证明在ABCC6错义突变基因的老鼠创建一个过早终止密码子,除了PXE,导致营养不良的心脏钙化(8]。这些发现表明,截短形式的ABCC6能影响细胞活动。

出于这个原因,识别不同的剪接变体ABCC6在肝脏和肾脏等组织,ABCC6通常表示,可能是一个重要的步骤在理解这个基因的复杂功能,澄清相关疾病的发病的机制。

检查如果短变体编码一个蛋白质表达,我们分析了HEK293通过免疫印迹分析使用一个MRP6 n端抗体方法(图中描述3)。近165 kDa的野生型蛋白预测(MRP6)和更强烈的大约100 kDa截短蛋白(MRP6对应19检测到24)。它们之间的额外的乐队可能对应于不同的截短蛋白糖基化的形式。免疫印迹分析与ABCC6的表达水平一致19显示在图24变体1这表明同种型盛行在这些细胞。

不同的投机假设ABCC6的功能1924变种可能提出。

的发现ABCC61924变种成为法律表达蛋白质ABCC6基因显示多种功能,证实了可变剪接是一种扩散机制增加蛋白质多样性ABC转运蛋白家族。

我们建议翻译ABCC6的蛋白质1924变种是一个运输的一半。事实上,翻译的核苷酸序列变异产生一个假定的截断871个氨基酸的蛋白质,包括前两个跨膜域和第一个NBD c端一端。众所周知,其他一些人类ABC转运蛋白基因编码一半可变剪接的结果,比如ABCA5基因编码一种蛋白质925 amminoacids [1642 amminoacids和多肽9),和人类ABCB6产生两种截然不同的分子量形式,局部外线粒体膜和质膜(10]。

缩写

美国广播公司(ABC):	腺苷triphosphate-binding磁带
PXE:	这种elasticum
ABCC61924:	腺苷triphosphate-binding盒式磁带亚科C成员6缺乏外显子19到24
NBD:	核苷酸结合域
MRP:	多药耐药性相关的蛋白质
你好:	主要人类hepatocites
HEK293:	人类胚胎肾细胞
核糖体rna:	核糖体核糖核酸
亲:	小鼠白血病病毒
EtBr:	溴化乙锭。

引用

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